基于PCR的质粒快速定点诱变方法建立与评价 被引量：3

1

作者 陈凡 傅一勤 +1 位作者 林梅西 汪少芸 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期61-68,共8页

基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区(T... 基因突变对生命的进化具有重要意义,针对质粒的DNA定点诱变技术也是基因工程、蛋白质工程研究中的重要手段之一。为了提高质粒定点诱变的效率,本研究利用引物部分重叠的设计方案,使用Tm值相对固定的引物设计模式,将同一引物分为重叠区(Tm=50±2℃)和非重叠区(Tm=60±2℃),并在严格控制模板用量(2 pg/kb)的基础上,通过20个PCR循环对目标质粒进行定点诱变扩增,随后取0.5μL产物直接用于转化。在Fast Pfu Fly酶系中,利用此法构建了6个含碱基替换、缺失和插入的质粒,均获得成功,突变效率可达96%以上,阳性克隆获得数达70个以上。此外,利用4种不同PCR酶系对该法的适用性进行了评价,结果表明突变效率均可达93%以上,阳性克隆获得数均在10个以上。通过适当增加PCR模板用量(10 pg/kb)并使用纯化后的PCR产物进行转化,该法可适用于转化效率大于106(cfu/μg)的任意感受态细胞,对应的突变效率可大于91%,阳性克隆获得数大于20。根据本法的作用原理,该方案适合质粒中10~20 bp(因重叠区GC含量及碱基序列的不同而改变)以内的任意碱基替换和插入,以及任意长度的DNA片段缺失。且具有通用性强、耗时少、诱变成功率高、成本低、对感受态及转化效率无特殊要求等优点,适合各实验室的日常研究使用。 展开更多

关键词 PCR 质粒 定点诱变 部分重叠

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PCR定点诱变方法构建BCR-ABL cDNA竞争性PCR内参照物 被引量：1

2

作者 田红 孙竞 +3 位作者 周小棉 周淑芸 徐兵 杨艺 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2000年第2期90-92,共3页

本实验通过合成与原有下游引物 (B)相似的一条新引物 (B′) ,经聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增出比原BCR ABLcDNA序列减少了 4个碱基的参照物 ,达到定点诱变的目的。经酶切分析证明 ,两型BCR ABLmRNA均可通过此方法... 本实验通过合成与原有下游引物 (B)相似的一条新引物 (B′) ,经聚合酶链反应 (polymerasechainreaction ,PCR)扩增出比原BCR ABLcDNA序列减少了 4个碱基的参照物 ,达到定点诱变的目的。经酶切分析证明 ,两型BCR ABLmRNA均可通过此方法得到相应的cDNA参照物。参照物和待测模板的共扩增产物可通过毛细管电泳达到基线分离 ,证明了其可行性。该参照物可用于慢性粒细胞白血病BCR ABL融合基因的竞争性PCR 。 展开更多

关键词 白血病 PCR定点诱变 BCR-ABL基因 竞争性PCR

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大肠杆菌热敏毒素LT克隆基因的PCR定点诱变和重组表达的构建 被引量：1

3

作者 马兴元 郑文云 +2 位作者 赵玉军 姜力 朱平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期427-431,共5页

为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性 ,实验依据LT基因的同源序列设计并合成 5条引物 ,采用突出末端PCR法和重组PCR法 ,将克隆于质粒pEWD2 99上的LT基因 ,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点 ,扩增出带有上... 为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性 ,实验依据LT基因的同源序列设计并合成 5条引物 ,采用突出末端PCR法和重组PCR法 ,将克隆于质粒pEWD2 99上的LT基因 ,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点 ,扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112 突变点的约 110 0bp和约 80 0bp的DNA片段和不含突变点的约 30 0bp的DNA片段 ,使控制LT毒力活性中心的第 7位和第 112位氨基酸的碱基分别发生诱变 ,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后 ,插入经BamHI和Xhol双酶切的线性化的高效表达载体pGEX_4T_1的多克隆位点区 ,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达 ,将连接产物转化入JM10 5菌株 ,挑出可疑阳性菌落 ,提取质粒 ,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析 ,证明读框正确 ,序列正确 ,获得了pGEX_4T_1(LTm7和pGEX_4T_1(LTm112 两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人和动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂 ,完成了基因水平的工作。 展开更多

关键词 大肠杆菌 热敏毒素 LT克隆基因 PCR定点诱变 重组表达 粘膜免疫传剂 基因工程

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中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的定点诱变及其载体构建 被引量：1

4

作者 易绍东 孟素荣 +2 位作者 崔英凯 陈哲明 彭健 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第11期1139-1142,共4页

目的对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究,并构建携带有基因突变K317N的pRc/CMV-hH1的表达载体。方法采用PCR定点突变技术,根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI/Sse8387I设计一对... 目的对我们发现的中国人Brugada综合征新的SCN5A基因突变K317N进行体外定点诱变研究,并构建携带有基因突变K317N的pRc/CMV-hH1的表达载体。方法采用PCR定点突变技术,根据突变位置附近的两个单一限制性内切酶位点AgeI/Sse8387I设计一对定点诱变引物,将突变位点设计在引物上,通过PCR扩增,使扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV-hH1载体中。结果DNA测序表明,在预期位点巳经发生突变,SCN5A基因在第317密码子由赖氨酸(K)突变为天冬氨酸(N),成功实现定点诱变。结论PCR技术诱导定点突变,准确、高效。pRc/CMV-hH1(K317N)的成功构建,为进一步进行该突变的结构与功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 中国人 BRUGADA综合征 SCN5A 基因突变 K317N 定点诱变 载体构建

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巨型引物PCR法对抗CD3改型单链抗体的定点诱变

5

作者 刘晶 尹长城 +1 位作者 黄华梁 姜述德 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第5期756-760,共5页

亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素之一 .利用巨型引物PCR定点诱变方法 ,设计并化学合成出两组含多个突变位点的简并引物 ,在第一轮PCR中使用简并引物分别扩增出含突变碱基的两条特异性的DNA片段 ,即巨型引物 ,将其经琼脂... 亲和力是影响改型单链抗体应用于临床的重要因素之一 .利用巨型引物PCR定点诱变方法 ,设计并化学合成出两组含多个突变位点的简并引物 ,在第一轮PCR中使用简并引物分别扩增出含突变碱基的两条特异性的DNA片段 ,即巨型引物 ,将其经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后 ,作为 3′和 5′的两端引物应用于第二轮PCR反应中 .通过改变标准PCR反应条件 ,调整引物与模板的浓度 ,扩增出特异性较强的目的DNA条带 .PCR产物经回收后 ,进行DNA测序 . 展开更多

关键词 CD3改型单链抗体 定点诱变 PCR 巨型引物 慢速退火

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利用体外定点诱变技术构建人突变型α-L-艾杜糖醛酸酶基因

6

作者 于洪枫 曾瑞萍 +1 位作者 葛春喜 林群娣 《中山医科大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第2期105-107,共3页

【目的】构建突变型α L 艾杜糖醛酸酶基因 (IDUA)cDNA ,为体外表达、鉴定突变的性质提供物质基础。【方法】以野生型pcDNA3 IDUA为基础质粒 ,采用双引物法体外定点诱变技术 ,引入突变E40 4X。【结果】突变区域经PCR SSCP和测序证实诱... 【目的】构建突变型α L 艾杜糖醛酸酶基因 (IDUA)cDNA ,为体外表达、鉴定突变的性质提供物质基础。【方法】以野生型pcDNA3 IDUA为基础质粒 ,采用双引物法体外定点诱变技术 ,引入突变E40 4X。【结果】突变区域经PCR SSCP和测序证实诱导突变成功。【结论】本研究成功构建了突变型IDUAcDNA ,可用于下游的体外表达 ;此定点突变技术具有简便、诱变效率高等优点 ,是体外构建突变型基因的一种有效方法。 展开更多

关键词 定点诱变 α-L-艾杜糖醛酸酶 基因 IDUA 体外表达 基因突变

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定点诱变G5-淀粉酶

7

作者 朱卫民 伊藤义文 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 1999年第3期162-166,共5页

利用定点突变技术，分别改变位于 Ｇ５淀粉酶氨基酸序列上高度保守区段内的３个氨基酸 Ｔｒｐ５７、 Ｔｙｒ１３９和 Ｌｙｓ１８８。其中， Ｔｒｐ５７和 Ｔｙｒ１３９分别被 Ｈｉｓ、 Ｐｈｅ、 Ｌｅｕ 和 Ｔｙｒ 取代， Ｌｙ... 利用定点突变技术，分别改变位于 Ｇ５淀粉酶氨基酸序列上高度保守区段内的３个氨基酸 Ｔｒｐ５７、 Ｔｙｒ１３９和 Ｌｙｓ１８８。其中， Ｔｒｐ５７和 Ｔｙｒ１３９分别被 Ｈｉｓ、 Ｐｈｅ、 Ｌｅｕ 和 Ｔｙｒ 取代， Ｌｙｓ１８８分别被 Ａｒｇ 和 Ｑｌｎ 取代，共得到９种单点突变基因。这些突变基因均在大肠杆菌中获得表达。对这些突变基因所表达的 Ｇ５淀粉酶的水解活性及其变化进行了初步分析。发现这些突变酶对淀粉和 Ｇ５的水解活性有不同程度的下降，而且对 Ｇ５的水解活性的下降尤为明显，其中，个别突变酶在基本保持对淀粉的水解活性的同时，对 Ｇ５的水解活性有大幅度的下降。 展开更多

关键词 定点诱变 G5-淀粉酶 水解活性变化 淀粉酶

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猪MSTN前肽定点诱变载体在C2C12细胞中的表达 被引量：1

8

作者 张晓玮 崔文涛 +4 位作者 伍晓雄 杨述林 牟玉莲 唐中林 李奎 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1588-1593,共6页

本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性。以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序。再将... 本研究旨在克隆通城猪含有第1个内含子的MSTN前肽基因,构建真核定点诱变载体,并通过转染C2C12细胞验证载体表达的有效性。以通城猪血液样品中提取的DNA作为模板,PCR扩增得到含第1个内含子的MSTN前肽基因,扩增产物进行克隆、测序。再将目的片段定向克隆到去除了EGFP基因的pEGFP-N1表达载体上。通过定点诱变方法将前肽编码序列第76位天冬氨酸突变为丙氨酸,获得定点诱变载体pEGFP(-)-N1-ProMstnD76A,并瞬时转染C2C12细胞。转染48 h后,通过RT-PCR和Real-time PCR方法检测目的基因的表达情况。结果表明:本研究成功克隆了通城猪含第1个内含子的MSTN前肽基因,并对该基因进行定点诱变修饰,构建了真核表达载体,转染后其前体mRNA能在C2C12细胞中进行正确剪接,目的基因mRNA表达水平较高。这为猪MSTN前肽基因在体内表达的研究奠定基础,并为制备转基因猪提供有用的分子材料。 展开更多

关键词 猪 MSTN前肽基因 定点诱变 真核表达

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以PCR为基础的定点诱变方法研究进展 被引量：3

9

作者 黃春晓 段学军 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2006年第12期5-8,共4页

以PCR为基础的定点诱变技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法,不仅用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究,还用于定点改造目的基因。综述了以PCR为基础的定点诱变的各种方法,并介绍了国内外最新的研究进展,重点介绍并分析了单管... 以PCR为基础的定点诱变技术是近年来得到极大发展的分子生物学方法,不仅用于基因和蛋白质的结构与功能的基础研究,还用于定点改造目的基因。综述了以PCR为基础的定点诱变的各种方法,并介绍了国内外最新的研究进展,重点介绍并分析了单管大引物法、一步重叠延伸PCR、多位点环状诱变PCR及TAMS定点诱变等新方法,比较了不同方法的优缺点,分析了存在的问题并提出解决对策。 展开更多

关键词 PCR 定点诱变 重叠延伸法 大引物法 多位点环状诱变 TAMS技术

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基因体外定点诱变技术 被引量：4

10

作者 王秋颖 《山西农业大学学报（自然科学版）》 CAS 2007年第6期124-126,共3页

定点诱变技术可有目的的改变DNA序列中的任何一个特定的碱基,是基因操作的一种基本技术。综述了常见的几种定点诱变方法,并对它们的优缺点进行了对比。

关键词 基因 定点诱变 PCR

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藻蓝蛋白裂合酶CpeS色氨酸定点诱变及体内重组功能研究

11

作者 张晓刚 周明 +1 位作者 胡勋 赵开弘 《武汉植物学研究》 CSCD 北大核心 2006年第3期191-195,共5页

为了研究藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS结构与功能的关系以及色氨酸残基对于该酶功能的影响,构建了藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS的两个色氨酸突变体,分别为CpeS(W 14 I)和CpeS(W 75S)。通过体内重组检测酶活性的变化,研究色氨酸残... 为了研究藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS结构与功能的关系以及色氨酸残基对于该酶功能的影响,构建了藻蓝蛋白β亚基Cys-84裂合酶CpeS的两个色氨酸突变体,分别为CpeS(W 14 I)和CpeS(W 75S)。通过体内重组检测酶活性的变化,研究色氨酸残基的突变对裂合酶催化活性的影响。重组结果显示:突变体CpeS(W 14 I)的催化活性几乎完全丧失,为野生型的8%;突变体CpeS(W 75S)的催化活性为野生型的76%。由此推测,第14位色氨酸可能是CpeS酶活性的必需氨基酸,其所处的位置可能是裂合酶CpeS的活性位点。 展开更多

关键词 CpeS 定点诱变 体内重组 活性位点

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基因定点诱变删除及天然α型心钠素的分泌型表达

12

作者 李磊 李光地 +5 位作者 王东 王健平 曾桂超 张迺蘅 汤健 李载平 《生物化学杂志》 CSCD 1991年第4期492-495,共4页

用基因定点诱变技术,删除了pO_1α ANF表达质粒中的33对碱基,使人α型心钠素结构基因直接与大肠杆菌分泌型表达质粒pIN-Ⅲ-OmPA中的信号肽酶切位点编码区相连,构成天然人α型心钠素的表达质粒pANF,在IPTG诱导下表达28肽的天然人α型心... 用基因定点诱变技术,删除了pO_1α ANF表达质粒中的33对碱基,使人α型心钠素结构基因直接与大肠杆菌分泌型表达质粒pIN-Ⅲ-OmPA中的信号肽酶切位点编码区相连,构成天然人α型心钠素的表达质粒pANF,在IPTG诱导下表达28肽的天然人α型心钠素。纯化后的表达产物具有天然心钠素的放免活性和很强的舒张血管的生物活性。 展开更多

关键词 定点诱变 基因表达 心钠素

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PCR技术对Wilson病基因进行定点突变的研究 被引量：7

13

作者 闫振文 梁秀龄 +3 位作者 杨春水 侯国庆 王莹 Toshihiro Sugiyama 《中山医科大学学报》 CSCD 北大核心 2002年第2期94-96,F002,共4页

【目的】利用聚合酶链反应 (PCR)技术对Wilson病 (WD)基因进行体外定点突变的研究。【方法】采用PCR定点突变技术 ,首先设计两对引物 ,将突变位点设计在引物上 ,通过重叠延伸法两次PCR扩增 ,扩增片段上含有所需要的突变位点 ,最后将扩... 【目的】利用聚合酶链反应 (PCR)技术对Wilson病 (WD)基因进行体外定点突变的研究。【方法】采用PCR定点突变技术 ,首先设计两对引物 ,将突变位点设计在引物上 ,通过重叠延伸法两次PCR扩增 ,扩增片段上含有所需要的突变位点 ,最后将扩增片段克隆入pRc/CMV载体中。【结果】DNA测序表明在预期位点已经发生突变 ,WD基因第 778位密码子由精氨酸 (Arg)残基突变为亮氨酸残基 (Leu) ,用PCR定点突变技术成功构建Wilson病基因突变体。【结论】PCR技术诱导定点突变准确、高效。Wilson病基因突变体的构建成功 ,为进一步研究该突变位点导致Wilson病的发病机制和Wilson病蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。 展开更多

关键词 肝豆状核变性 遗传学 聚合酶链反应 定点诱变 基因突变 研究

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α-淀粉酶基因启动子-35区的诱变及其对大肠杆菌内表达量的影响 被引量：3

14

作者 黄春晓 崔锦 马向东 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2006年第5期24-27,共4页

对来自野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因(Gene Bank的序列号为AY167892)的启动子进行定点诱变,研究启动子的碱基改变对该基因在大肠杆菌中表达量的影响,在基因工程中有重要的意义。以α-淀粉酶基因连接到pBluescript KS+形成的重组质粒PHN... 对来自野油菜黄单胞菌的α-淀粉酶基因(Gene Bank的序列号为AY167892)的启动子进行定点诱变,研究启动子的碱基改变对该基因在大肠杆菌中表达量的影响,在基因工程中有重要的意义。以α-淀粉酶基因连接到pBluescript KS+形成的重组质粒PHNH003为模板,通过PCR得到该α-淀粉酶基因启动子-35区上游序列截短141bp的基因,并通过定点诱变改变该截短基因启动子-35区第2位和第3位的碱基(即TGCACA→TTGACA),分别把这2个基因克隆至pBlue-script KS+并转化大肠杆菌DH5α。并把PHNH003转化至大肠杆菌DH5α,作为对照菌株。结果表明,含截短基因的菌株的α-淀粉酶活性比对照菌株提高24%;含点突变的截短基因的菌株的α-淀粉酶活性比对照提高100%。并分析了α-淀粉酶基因启动子-35区上游序列及-35区2个碱基的突变对基因在大肠杆菌中表达量的影响。 展开更多

关键词 Α-淀粉酶基因 启动子 定点诱变 大肠杆菌 表达

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定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性 被引量：3

15

作者 代健 樊自尧 +3 位作者 杨轩 张丽萌 陈战球 崔玉东 《黑龙江八一农垦大学学报》 2014年第2期44-49,112,共7页

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基... 金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。 展开更多

关键词 金黄色葡萄球菌 α-溶血素 定点诱变 原核表达 溶血活性

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通过定点突变提高纳豆激酶纤溶活性和热稳定性 被引量：2

16

作者 于晓淼 赵允章 +2 位作者 王锋超 孙悦 刘宏生 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2023年第2期21-27,共7页

纳豆激酶(Nattokinase, NK)是一种纤溶酶,可溶解血栓,常用于治疗心血管疾病(CVDs)。然而,野生型NK往往表现出很少的纤溶能力和较低的热稳定性,针对如何提高NK的热稳定性和活性开展研究。使用重叠延伸PCR法将NK中位于194位的Ser替换为Pro... 纳豆激酶(Nattokinase, NK)是一种纤溶酶,可溶解血栓,常用于治疗心血管疾病(CVDs)。然而,野生型NK往往表现出很少的纤溶能力和较低的热稳定性,针对如何提高NK的热稳定性和活性开展研究。使用重叠延伸PCR法将NK中位于194位的Ser替换为Pro,为验证突变后的热稳定性,将野生型NK和突变体S194P均在不同温度下孵育相同时间,使用纤维蛋白板法测定二者酶活,验证热稳定性。成功构建了pET-26b-NK_(s194p),测量酶活结果显示,野生型NK和突变体S194P酶活分别达到101.30 IU/mL和123.23 IU/mL,结果表明突变体S194P的酶活比野生型NK高(18.10±2)%,将野生型NK和突变体S194P在60~65℃温度下孵育30 min后测量酶活,野生型NK在63℃时丧失酶活,突变体S194P在65℃时丧失酶活,耐热温度提高2℃。结果表明,突变体S194p的蛋白结构在突变后发生了改变,使NK提高了耐热温度。 展开更多

关键词 纳豆激酶 定点诱变 纤溶活性 热稳定性 分子动力学模拟

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TLR序列在SRP54蛋白与SRPRNA和信号肽结合中的作用 被引量：4

17

作者 黄俏佳 兰风华 +1 位作者 董荔红 朱忠勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期781-785,共5页

SRP54蛋白是信号识别颗粒(signal recognition particle)的一个关键组分.对人SRP54蛋白328～330位的TLR3个氨基酸进行人工诱变,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达了A3突变体,并对A3突变体进行纯化和Superdex75凝胶过滤分析.观察到A3突变... SRP54蛋白是信号识别颗粒(signal recognition particle)的一个关键组分.对人SRP54蛋白328～330位的TLR3个氨基酸进行人工诱变,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达了A3突变体,并对A3突变体进行纯化和Superdex75凝胶过滤分析.观察到A3突变体丧失了与SRPRNA结合的能力,其自身也不能形成二聚体.结果证明,TLR这3个氨基酸残基与二聚体结构的形成有关,TLR是SRP54蛋白结合SRPRNA和新生蛋白质信号肽所必需的关键性氨基酸序列. 展开更多

关键词 信号识别颗粒 信号肽 定点诱变 凝胶过滤

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pBV-IL-6重组质粒的构建及其在E.coli细胞中的超高表达 被引量：4

18

作者 任启生 王嘉玺 +1 位作者 邹民吉 马贤凯 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1992年第3期133-136,共4页

本研究通过计算机分析设计、人工合成的寡核苷酸引物进行定点诱变和转译起始区优化,再经 PCR 扩增和体外重组,获得重组质粒 pBV-IL-6,转化大肠杆菌获得重组人白细胞介素6的工程菌 EcoliJM103/pBV-IL-6.结果,表达 IL-6占菌体总蛋白的71%.... 本研究通过计算机分析设计、人工合成的寡核苷酸引物进行定点诱变和转译起始区优化,再经 PCR 扩增和体外重组,获得重组质粒 pBV-IL-6,转化大肠杆菌获得重组人白细胞介素6的工程菌 EcoliJM103/pBV-IL-6.结果,表达 IL-6占菌体总蛋白的71%.经 IL-6依赖的小鼠杂交瘤细胞系7TDI 和^(?)H-TdR 掺入法测定表达产物粗提物的 IL-6生物活性为10~6U/L,经凝胶过滤纯化与复性之后 IL-6比活性为10^(?)U/mg.表达产物为缺失 N 端25个氨基酸的人白细胞介素6. 展开更多

关键词 白细胞介素6 转译起始 定点诱变

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L78部分氨基酸残基对SERCA1a钙转运功能的影响 被引量：2

19

作者 王国丽 DAIHO Takashi +4 位作者 YAMASAKI Kazuo DANK0 Stefania 王彪 宿文辉 SUZUKI Hiroshi 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2014年第8期796-803,共8页

跨肌浆网膜的钙离子ATP酶SERCA1a可在水解ATP的同时逆浓度梯度从胞浆转运钙离子入肌浆网,引发收缩的骨骼肌细胞舒张.目前对SERCA1a结构与功能的研究,要领先于对其他P型离子转运ATP酶的研究.为了解SERCA1a跨膜螺旋M7与M8膜内侧连接部Link... 跨肌浆网膜的钙离子ATP酶SERCA1a可在水解ATP的同时逆浓度梯度从胞浆转运钙离子入肌浆网,引发收缩的骨骼肌细胞舒张.目前对SERCA1a结构与功能的研究,要领先于对其他P型离子转运ATP酶的研究.为了解SERCA1a跨膜螺旋M7与M8膜内侧连接部Linker78(L78)的功能,我们评估了L78部分氨基酸残基突变对SERCA1a反应循环的影响,发现:除G864A之外的所有突变体均可不同程度地降低钙离子转运速率;G862或P863氨基酸残基的突变导致SERCA1a的ATP酶活性显著降低或丧失,并引起由ATP或无机磷酸Pi生成的磷酸化酶中间体EP量显著减少;A893被P取代对SERCA1a的影响与G862、P863突变相似;与野生型SERCA1a相比,G864A与FMQ873-875单突变体ATP酶活性及EP生成量无明显差别.上述结果表明,M7、M8膜内侧连接部L78不仅与跨膜区钙离子转运过程密切相关,而且L78在GPG862-864处及A893附近的正确转折对胞浆结构域P的磷酸化也具有关键的远距离调控作用,提示L78的结构及柔度对SERCA1a构象正常的周期性变化至关重要. 展开更多

关键词 P型ATP酶 钙离子ATP酶 SERCA 定点诱变 反应循环

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CCC2基因缺陷型酵母对中国人Wilson病突变热点致病性的研究 被引量：1

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作者 丰岩清 李洵桦 +4 位作者 国宁 梁秀龄 黄帆 王莹 陈曦 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期541-544,577,共5页

【目的】应用CCC2基因缺陷型酵母研究中国人Wilson病(Wilsondisease,WD)突变热点Arg778Leu的致病性,在蛋白水平上探讨中国人Wilson病的发病机制。【方法】应用RT-PCR和TOPOTA克隆技术分段克隆ATP7B的全长cDNA,USE定点诱变技术制备突变体... 【目的】应用CCC2基因缺陷型酵母研究中国人Wilson病(Wilsondisease,WD)突变热点Arg778Leu的致病性,在蛋白水平上探讨中国人Wilson病的发病机制。【方法】应用RT-PCR和TOPOTA克隆技术分段克隆ATP7B的全长cDNA,USE定点诱变技术制备突变体,应用酵母功能互补分析的方法研究Arg778Leu的致病性。【结果】本研究应用USE定点诱变技术成功制备了ATP7B的Arg778Leu突变体,在CCC2缺陷型酵母内表达人的野生型ATP7B可以弥补酵母内CCC2蛋白的运铜功能,使CCC2缺陷型酵母在铜、铁及亮氨酸缺陷型培养基上生长良好;对突变体的研究表明Arg778Leu只能部分代偿CCC2蛋白的运铜功能。【结论】本试验证明CCC2基因缺陷型酵母是研究人ATP7B的一种良好的细胞模型,证明了中国人WD的常见突变Arg778Leu是一种致病性的突变。 展开更多

关键词 WILSON病 定点诱变 CCC2缺陷型酵母

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