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人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达 被引量:1
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作者 苏磊 曹少先 +5 位作者 丰秀静 田石 孟春花 王慧利 张庆晓 王锋 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第3期581-585,共5页
采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤... 采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。 展开更多
关键词 人α-乳白蛋白质 基因克隆 奶山羊胎儿成纤维细胞 表达
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除奶山羊胎儿成纤维细胞SCD1基因 被引量:4
2
作者 刘雷雷 贾启鹏 +4 位作者 李宗帅 杨洋 李海江 赵兴绪 张勇 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期30-38,共9页
【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据“20N+NGG”原则在SCD1第4外显子和第6外显... 【目的】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除奶山羊胎儿成纤维细胞(GFFs)中硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因,旨在为奶山羊敲入外源性基因奠定理论基础以及构建动物模型提供生物材料.【方法】根据“20N+NGG”原则在SCD1第4外显子和第6外显子分别设计6个靶向SCD1基因sgRNA(F1、F2、F3、S1、S2、S3),构建PX330-eGFP-sgRNA敲除载体,通过脂质体转染到GFFs中,PCR扩增阳性细胞SCD1外显子4和外显子6的核苷酸序列,连接到pEASY-Blunt载体上,测序评估不同sgRNA的敲除效率;分别在第4外显子和第6外显子选择敲除效率高的sgRNA共同转染GFFs,经流式分选获得敲除SCD1基因的GFFs.【结果】设计的6个sgRNA均能够连入PX330-eGFP载体中,单克隆菌测序试验表明sgRNA F2、sgRNA F3、sgRNA S1和sgRNA S2具有敲除作用,其敲除效率分别为41.67%、30.77%、6.67%和28.57%;实时荧光定量PCR检测结果表明sgRNA-F2-S2与sgRNA-F3-S2转染组均能显著降低阳性细胞中SCD1的mRNA水平(P<0.05);Western Blot检测结果表明在阳性细胞中均未表达SCD1蛋白.【结论】获得两株敲除SCD1基因的GFFs,为制备敲除SCD1基因奶山羊核供体提供了生物材料. 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9系统 奶山羊胎儿成纤维细胞 敲除 硬脂酰辅酶A去饱和酶1
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奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究 被引量:17
3
作者 张艳丽 许丹 +5 位作者 庞训胜 万永杰 王子玉 孟立 宋辉 王锋 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期81-86,共6页
为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转... 为获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞(gFFs),绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,并且研究了脂质体量、质粒量和转染时间对gFFs的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。结果表明:该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。24孔板中采用脂质体转染试剂4.0μL、质粒DNA 1.2μg,转染6 h可以获得最佳的转染效果,转染效率达4.21%。 展开更多
关键词 胎儿纤维细胞 分离培养 脂质体 转染 奶山羊
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奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及SRY基因性别鉴定 被引量:2
4
作者 陈华涛 胡林勇 +2 位作者 杨艳 李倩 靳亚平 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第8期1-7,共7页
为了探索和建立奶山羊胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验用组织块培养法分离纯化得到两株奶山羊胎儿成纤维细胞系,进行细胞形态观察、生长曲线及细胞周期和倍性分析。同时根据GenBank... 为了探索和建立奶山羊胎儿成纤维细胞体外分离培养及性别鉴定的技术方法,获得转基因克隆羊的供体细胞,本试验用组织块培养法分离纯化得到两株奶山羊胎儿成纤维细胞系,进行细胞形态观察、生长曲线及细胞周期和倍性分析。同时根据GenBank上发布的山羊SRY基因设计合成一对PCR引物作为性别鉴定引物,另外根据山羊BLG基因序列设计一对引物作为内参引物,建立PCR反应体系对两株胎儿成纤维细胞系进行性别鉴定。结果表明,分离的胎儿成纤维细胞活力良好,可在体外快速生长、增殖、稳定培养;阳性对照和山羊胎儿成纤维细胞系2经PCR扩增得到337 bp片段和498 bp的BLG基因片段,而阴性对照和山羊胎儿成纤维细胞系1经PCR扩增得到498 bp的β-乳球蛋白基因片段。将337 bp片段和pMD19-T载体连接,构建重组载体pSRY,通过测序证明337 bp片段为SRY基因片段。这说明有337 bp扩增带的细胞系为雄性,无337 bp扩增带的细胞系为雌性。本试验为转基因奶山羊新品种的培育奠定了基础。 展开更多
关键词 奶山羊 纤维细胞 SRY基因 性别鉴定
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萨能奶山羊胎儿成纤维细胞miRNA文库的构建及生物信息学分析 被引量:3
5
作者 常卫华 王娟红 崔子龙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第11期3436-3444,共9页
本试验旨在丰富山羊miRNA文库,并探讨miRNAs在胎儿成纤维细胞生长调控中的作用。试验以萨能奶山羊胎儿成纤维细胞为研究对象,运用Illumina高通量测序和生物信息学技术分析山羊胎儿成纤维细胞miRNAs表达。成功构建了萨能奶山羊胎儿成纤... 本试验旨在丰富山羊miRNA文库,并探讨miRNAs在胎儿成纤维细胞生长调控中的作用。试验以萨能奶山羊胎儿成纤维细胞为研究对象,运用Illumina高通量测序和生物信息学技术分析山羊胎儿成纤维细胞miRNAs表达。成功构建了萨能奶山羊胎儿成纤维细胞miRNAs的cDNA文库,获得16395039 total reads,去除冗余数据后获得16150181条clean reads,其中unique sRNAs 205857条。生物信息学分析获得候选新miRNAs 247条,候选miRNAs靶基因8401个,靶基因位点数10832个;同时分析发现候选miRNAs首位碱基对U和A具有偏向性。GO注释表明,69.6%的基因与细胞和细胞组分相关,超过54.1%的基因参与了细胞器相关活动,多达65.0%的基因与细胞及细胞过程相关联。KEGG通路分析显示,约10.5%的基因与代谢通路有关,是占比最多的一条通路,数据显示miRNAs对胎儿成纤维细胞具有重要调控作用。试验结果为胎儿成纤维细胞的生长调控及奶山羊乳腺生物反应器中供核体细胞miRNAs深入研究提供参考。 展开更多
关键词 胎儿纤维细胞 MIRNA 高通量测序 GO注释 KEGG通路
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崂山奶山羊胎儿成纤维细胞SOD1和APOE基因差异表达分析
6
作者 钟永本 王娟红 《现代农业科技》 2014年第12期268-268,共1页
选择SOD1和APOE基因,研究其在不同代数奶山羊胎儿成纤维细胞中的差异表达。分别收集正常生长的第F2、F8、F16、F32、F40、F50代胎儿成纤维细胞,提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术及实时荧光定量PCR技术检测不同代数崂山羊胎儿成纤维细胞SOD... 选择SOD1和APOE基因,研究其在不同代数奶山羊胎儿成纤维细胞中的差异表达。分别收集正常生长的第F2、F8、F16、F32、F40、F50代胎儿成纤维细胞,提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术及实时荧光定量PCR技术检测不同代数崂山羊胎儿成纤维细胞SOD1和APOE基因的表达,结果表明:崂山奶山羊SOD1和APOE基因在第2代成纤维细胞中表达水平最高,随着传代次数的增多,表达量逐渐下降,第50代表达量最低,而且SOD1和APOE基因的表达趋势完全一致,由此表明SOD1和APOE基因在不同代数崂山奶山羊胎儿成纤维细胞中有选择表达的趋势,为进一步揭示细胞衰老机制提供参考。 展开更多
关键词 崂山奶山羊 胎儿纤维细胞 SOD1 APOE 荧光定量
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氧化石墨烯-纳米银对山羊胎儿成纤维细胞中lncRNA表达谱的影响
7
作者 宋志贤 刘松子 +3 位作者 鲍思璇 张启鹏 孔桂美 袁玉国 《生态毒理学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期292-299,共8页
研究了低剂量氧化石墨烯-纳米银(graphene oxide-silver nanoparticles,GO-AgNPs)长期暴露对动物胚胎细胞lncRNA表达影响的表观遗传毒性机制。试验以0(对照组)或0.5μg·mL^(-1)(处理组)GO-AgNPs浓度连续处理山羊胎儿成纤维细胞70 d... 研究了低剂量氧化石墨烯-纳米银(graphene oxide-silver nanoparticles,GO-AgNPs)长期暴露对动物胚胎细胞lncRNA表达影响的表观遗传毒性机制。试验以0(对照组)或0.5μg·mL^(-1)(处理组)GO-AgNPs浓度连续处理山羊胎儿成纤维细胞70 d,提取细胞RNA进行转录组测序,对差异lncRNA进行GO功能注释和KEGG信号通路富集进行分析,并用qRT-PCR方法对差异表达基因进行验证。与对照组相比,处理组共有167个显著差异的lncRNA,其中72个上调,95个下调。GO功能注释表明差异基因与单生物细胞过程(single-organism cellular process)、组织迁移(tissue migration)和细胞成分运动调节(regulation of cellular component movement)等相关;KEGG信号通路富集分析表明,差异表达lncRNA主要富集于白细胞介素-2生物合成过程等。以上结果说明非致死量GO-AgNPs长期暴露可诱导山羊胎儿成纤维细胞lncRNA表达谱的变化。 展开更多
关键词 氧化石墨烯-纳米银 胎儿纤维细胞 表观遗传毒性 长链非编码RNA
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IGF-1毛囊特异表达载体的构建以及转染绒山羊胎儿成纤维细胞的研究 被引量:13
8
作者 郭旭东 尹俊 +3 位作者 杨东山 毛舒燕 宝明涛 旭日干 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1460-1467,共8页
本研究旨在构建绵羊胰岛素样生长因子l(IGF-1)毛囊特异表达载体pCDsR-KI,并转染绒山羊胎儿成纤维细胞,最终获得稳定表达红色荧光并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过RT-PCR方法获得IGF-1 cDNA,其与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光... 本研究旨在构建绵羊胰岛素样生长因子l(IGF-1)毛囊特异表达载体pCDsR-KI,并转染绒山羊胎儿成纤维细胞,最终获得稳定表达红色荧光并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过RT-PCR方法获得IGF-1 cDNA,其与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成IGF-1毛囊特异表达载体pCDsR-KI(大小7.4 kb)。以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以lipofectamineTM2000介导转染所培养的第2代成纤维细胞,在DMEM/F12+10%FBS、37℃、5%CO2中培养,并添加G418筛选,获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆。经PCR法鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中。通过分析转基因体细胞的生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数趋于正常。为下一步通过体细胞核移植技术获得转基因克隆绒山羊准备了核供体细胞。 展开更多
关键词 山羊 胰岛素样生长因子l 红色荧光蛋白 毛囊细胞 胎儿纤维细胞
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山羊胎儿成纤维细胞的冷冻保存和体外培养(英文) 被引量:4
9
作者 王超 李向臣 +3 位作者 安志兴 张志平 舒建洪 张涌 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2004年第4期55-58,共4页
将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后... 将胎儿成纤维细胞悬浮于不同的冷冻保护液中 ,在不同的温度下进行冷冻保存试验。结果显示 ,当保护液中含有 90 0 m L / L胎牛血清 (FBS)时 ,- 196℃下保存的山羊胎儿成纤维细胞解冻后的细胞贴壁率高于- 80℃ ,且前者贴壁细胞增殖也较后者快 ,二者间差异显著 ;而在 - 2 0℃条件下只有一小部分细胞能够存活 ,与前两者相比差异极显著 ,说明 - 2 0℃不适合冷冻胎儿细胞。冷冻保护液中含有 10 0 m L / L二甲基亚砜 (DMSO)的保护效果明显好于 5 0 m L / L DMSO,二者间差异显著。用组织块法培养的细胞 ,在两种培养基 DMEM和 M199中添加 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 -巯基乙醇 (2 - Me) ,其组织块成活率及细胞生长速度均高于单纯添加 10 0 m L / LFBS,同时证明 DMEM和 M199都能用于胎儿成纤维细胞的体外培养。以 DMEM培养液为基础 ,分别添加 2mm ol/ L 2 - Me,5 m L / L FBS,10 0 m L / L FBS和 2 m mol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS对山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养 ,结果显示 ,细胞在 10 0 m L / L FBS和 2 mm ol/ L 2 - Me+10 0 m L / L FBS培养液中生长迅速 ,两者间无明显差异 ,2 - Me的存在促进了细胞的增殖 ;两者都与添加 2 m mol/ L 2 - Me组存在显著差异 ;添加 2 m mol/ L 2 - Me和 5m L / L 展开更多
关键词 山羊 胎儿纤维细胞 冷冻保存 体外培养 2-巯基乙醇 二甲基亚砜
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莎能奶山羊皮肤成纤维细胞几种冷冻保存方法的研究 被引量:4
10
作者 王亮 刘婷婷 +6 位作者 彭涛 帅志强 张达江 朱海 陈军 李卫华 汪汉卿 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期1-6,共6页
以莎能奶山羊皮肤组织为材料进行细胞培养,通过分离纯化建立了莎能奶山羊皮肤成纤维细胞系。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的条件下选用5种具有不同预冷平衡方式和预冷时间的方法进行冷冻保存,5个月后通过对成纤维细... 以莎能奶山羊皮肤组织为材料进行细胞培养,通过分离纯化建立了莎能奶山羊皮肤成纤维细胞系。纯化培养的成纤维细胞在冷冻保护剂和血清成分相同的条件下选用5种具有不同预冷平衡方式和预冷时间的方法进行冷冻保存,5个月后通过对成纤维细胞复苏后的活力对比分析,方法3(70%细胞悬液+20%胎牛血清+10%DMSO;先在4 C预冷平衡0.5 h,接着液氮罐口气态氮悬挂4 h,然后沉入液氮)冻存细胞解冻后胎盘蓝染色细胞活力分析,活细胞率为84.8%,培养48 h后细胞贴壁率为85.4%,明显高于其他几种方法。 展开更多
关键词 莎能奶山羊 纤维细胞 细胞培养 冷冻保存 细胞
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脂质体LTX介导高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)条件的优化 被引量:3
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作者 丰秀静 曹少先 +4 位作者 孟春花 王慧利 钱勇 王锋 成勇 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第3期561-565,共5页
探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、... 探讨获得外源基因高效转染山羊胎儿成纤维细胞(gFFCs)的方法,为筛选出体细胞核移植的供核细胞,制备转基因山羊提供技术基础。该研究以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,采用脂质体LipofectaminTM LTX+PLUSTMReagent介导,对细胞接种量、质粒DNA用量、脂质体与质粒DNA比例、脂质体-DNA复合物与细胞作用时间进行优化,荧光显微镜下统计转染后24 h的转染效率。结果显示:在24孔培养板中,每孔接种细胞6×104个,24 h后进行转染,质粒DNA每孔0.6μg,脂质体与质粒DNA比例为4.5∶1.0,脂质体-DNA复合物与细胞作用时间为6 h时,转染效率最高,达到81.2%。 展开更多
关键词 山羊胎儿纤维细胞 转染效率 脂质体 绿色荧光蛋白
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利用SRY基因鉴定山羊胎儿成纤维细胞的性别 被引量:3
12
作者 王怡 管鹏飞 +1 位作者 薛整风 成勇 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第16期7359-7360,共2页
根据GenBank中已发表的山羊SRY基因和β-乳球蛋白基因序列设计2对PCR引物,对来自3个1月龄山羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA进行PCR扩增,分别以公羊、母羊的基因组DNA为阳性和阴性对照,同时对PCR产物进行序列测定和同源性分析。结果表明,... 根据GenBank中已发表的山羊SRY基因和β-乳球蛋白基因序列设计2对PCR引物,对来自3个1月龄山羊胎儿成纤维细胞的基因组DNA进行PCR扩增,分别以公羊、母羊的基因组DNA为阳性和阴性对照,同时对PCR产物进行序列测定和同源性分析。结果表明,阳性对照和GFF1细胞系有2条扩增带,阴性对照、GFF2和GFF3细胞系只有1条扩增带;序列测定结果表明,PCR扩增产物为SRY基因,利用该方法准确鉴定出1个雄性细胞系和2个雌性细胞系。 展开更多
关键词 SRY基因 山羊胎儿纤维细胞 性别鉴定
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崂山奶山羊Myostatin基因真核表达载体的构建及其在成纤维细胞中的表达研究 被引量:2
13
作者 唐大运 陈晓亮 +6 位作者 吴健敏 朱化彬 杜卫华 王栋 赵学明 陈汉忠 林秀坤 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第1期37-40,共4页
试验克隆了崂山奶山羊Myostatin基因序列,构建了其真核表达载体,并验证了其在成纤维细胞中的表达。本研究通过从崂山奶山羊肌肉组织中提取RNA,反转录后采用巢式PCR方法扩增出Myostatin基因序列,构建真核表达载体,通过转染成纤维细胞,采... 试验克隆了崂山奶山羊Myostatin基因序列,构建了其真核表达载体,并验证了其在成纤维细胞中的表达。本研究通过从崂山奶山羊肌肉组织中提取RNA,反转录后采用巢式PCR方法扩增出Myostatin基因序列,构建真核表达载体,通过转染成纤维细胞,采用RT-PCR方法验证其表达。结果表明,克隆出崂山奶山羊Myostatin基因的全长cDNA序列,大小为1128bp,GenBank登录号:GU377303.1;构建pcDNA-MSTN真核表达载体,转染成纤维细胞48h后通过RT-PCR检测,结果显示,Myostatin表达量显著增加,表明成功构建pcDNA-MSTN真核表达载体,为进一步研究Myostatin的生物学功能及转基因羊培育奠定基础。 展开更多
关键词 崂山奶山羊 肌肉生长抑制素 真核表达载体 纤维细胞 巢式PCR
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绿色荧光蛋白基因在山羊胎儿成纤维细胞中的表达 被引量:1
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作者 楚秋霞 王二耀 +8 位作者 吴姣 陈付英 王治方 辛晓玲 施巧婷 冯亚杰 李文军 魏成斌 徐照学 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2013年第10期142-145,共4页
为建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的山羊胎儿成纤维细胞(gFFC)株,采用组织块贴壁法培养gFFC,QIAGEN转染试剂介导转染gFFC,用G418梯度法筛选阳性细胞株。结果显示:培养的gFFC生长形态正常;24孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时... 为建立稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的山羊胎儿成纤维细胞(gFFC)株,采用组织块贴壁法培养gFFC,QIAGEN转染试剂介导转染gFFC,用G418梯度法筛选阳性细胞株。结果显示:培养的gFFC生长形态正常;24孔培养板中细胞汇合度达70%~80%时,每60μL转染液内含DNA量0.4μg和QIAGEN转染试剂3μL,每孔内加入40μL转染液时能获得最佳转染效果,在G418筛选1个月后获得抗性阳性细胞株。表明EGFP基因在gFFC中成功表达。 展开更多
关键词 山羊胎儿纤维细胞 转染 EGFP基因 表达
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重组人瑞替普酶基因在山羊胎儿成纤维细胞β-酪蛋白基因座的定点整合
15
作者 王宏 沈子龙 +5 位作者 奚涛 李治国 刘红如 赵周英 吴国祥 成国祥 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期73-77,共5页
目的 :利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶 (rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株。方法 :构建了针对山羊 β- 酪蛋白基因座的定点打靶载体 ,其上游同源臂为 β 酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约 6 .1kb的基因组片... 目的 :利用体细胞基因打靶技术来获得定点整合有重组人瑞替普酶 (rPA)的山羊胎儿成纤维细胞株。方法 :构建了针对山羊 β- 酪蛋白基因座的定点打靶载体 ,其上游同源臂为 β 酪蛋白启动子端同时包含其信号肽编码区长约 6 .1kb的基因组片段 ,下游同源臂为 3.3kb从 β- 酪蛋白外显子 6至外显子 9的基因组片段。rPA小基因起始密码子位于 β- 酪蛋白信号肽编码区下游。将载体瞬时转染C12 7小鼠乳腺癌细胞 ,并通过激素进行诱导 ,酶联免疫吸附分析 (ELISA)检测细胞培养上清中的rPA表达量来验证载体表达功能。将载体通过电穿孔的方法转染同基因型的山羊胎儿成纤维细胞。利用G4 18和GANC进行药物筛选 ,并通过PCR和southern杂交的方法进行基因组DNA检测。结果 :获得了一株定点整合的细胞克隆 ,绝对基因打靶效率为 2× 10 7。结论 :本实验结果为后续利用核移植技术制备乳腺生物反应器提供了坚实的实验基础。 展开更多
关键词 细胞 基因打靶 胎儿纤维细胞 乳腺生物反应器 重组人瑞替普酶
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人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响 被引量:3
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作者 鲍珣 张拓 张涌 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第8期42-46,共5页
利用包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响... 利用包含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的真核表达载体pCI-neo-hTERT转染山羊胎儿成纤维细胞,筛选阳性克隆扩大培养,并对转染阳性细胞分别进行RT-PCR检测,倍性分析,细胞周期检测和细胞凋亡检测,以观察该基因对山羊胎儿成纤维细胞的影响。试验结果表明,筛选出的阳性细胞现已传至第50代;RT-PCR检测,端粒酶基因成功整合到山羊胎儿成纤维细胞并持续表达;倍性分析结果显示,转基因第50代细胞呈正常二倍体;对细胞周期进行分析,结果显示转基因第50代细胞较未转染第30代细胞有较高的S期,说明该细胞DNA合成旺盛,具有很强的增殖能力;细胞凋亡检测结果发现,转基因第50代细胞中凋亡细胞的比例明显少于转染第30代山羊胎儿成纤维细胞。这些试验结果均表明,hTERT能增加山羊胎儿成纤维细胞体外培养的代数,并保持细胞良好的形态及较强的增殖能力。 展开更多
关键词 HTERT 山羊 胎儿纤维细胞
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敲除山羊胎儿成纤维细胞中的抗体重链基因 被引量:2
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作者 李蓓 俞慧清 +3 位作者 朱采红 谢发展 陈建泉 成国祥 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第8期899-904,共6页
在针对大动物的精确基因修饰研究中,基于体细胞的同源重组是唯一可行与有效的方法.其中,沉默基因位点的重组尤为困难.为获得抗体基因功能缺失的山羊用于人源化抗体的研究,通过体细胞同源重组技术,首次成功地获得了抗体基因敲除的山羊胎... 在针对大动物的精确基因修饰研究中,基于体细胞的同源重组是唯一可行与有效的方法.其中,沉默基因位点的重组尤为困难.为获得抗体基因功能缺失的山羊用于人源化抗体的研究,通过体细胞同源重组技术,首次成功地获得了抗体基因敲除的山羊胎儿成纤维细胞株,该细胞株可用于体细胞克隆制备抗体基因功能缺失的转基因山羊.以35日龄的山羊胎儿成纤维细胞(GEF88)基因组DNA为模板,扩增山羊抗体重链J-Cμ基因作为同源臂,构建了同基因型的正负筛选打靶载体GTIgH.将此打靶载体经电穿孔的方法转染GEF88细胞,并通过0.8mg/L的嘌呤霉素进行药物筛选,获得了362个抗性细胞克隆,PCR、测序及DNA印迹鉴定结果显示,其中的GT211抗性细胞克隆为中靶细胞,该细胞克隆中的抗体重链基因的一条等位基因已被成功敲除. 展开更多
关键词 基因敲除 细胞基因打靶 山羊胎儿纤维细胞 抗体重链基因(IgH) 沉默基因
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BIX-01294对山羊胎儿成纤维细胞生长状态和组蛋白H3K9二甲基化的影响 被引量:1
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作者 张一军 刘军 +6 位作者 魏丽晓 茹坤 张曼 贺晓丽 权富生 郑月茂 张涌 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第10期1-7,共7页
为探讨BIX-01294对供核细胞的影响,使用不同浓度的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、H3K9me2水平和多能性基因的mRNA水平。细胞活力检测结果显示,BIX-01294浓... 为探讨BIX-01294对供核细胞的影响,使用不同浓度的BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞(Goat embryonic fibroblasts,GEFs),并检测其细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、H3K9me2水平和多能性基因的mRNA水平。细胞活力检测结果显示,BIX-01294浓度在1.0μmol/L以下不会影响细胞活力,2.0μmol/L时24h和48h处理组的细胞活力显著下降(P<0.05),≥4.0μmol/L时所有处理组的细胞活力均极显著下降(P<0.01)。细胞周期和凋亡检测结果显示,H3K9me2下调会引起细胞周期的停滞和正常细胞的减少,其中BIX-01294在大于2.0μmol/L时G0/G1期细胞的比例极显著升高(P<0.01),4.0μmol/L时凋亡细胞极显著增加(P<0.01)。处理后的细胞H3K9me2水平均极显著下降(P<0.01),但大于1.0μmol/L的处理浓度能获得较好的下调效果。处理后细胞Oct4、Sox2和Nanog的mRNA水平均有不同程度的增加,其中Oct4和Nanog的mRNA水平增加极显著(P<0.01)。说明:采用1.0μmol/L BIX-01294处理山羊胎儿成纤维细胞,可以下调H3K9me2水平,增加G1/G0期细胞比例,上调细胞多能性基因表达量,而且不影响细胞活力。 展开更多
关键词 BIX-01294 山羊 胎儿纤维细胞 H3K9二甲基化
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醛固酮对人胎儿心脏成纤维细胞增殖以及胶原表达的影响 被引量:19
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作者 谢永进 王升启 +3 位作者 陈劲松 伯晓晨 杨静 任艺虹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期386-388,共3页
目的:探讨人胎儿心脏成纤维细胞(FCFS)经不同浓度的醛固酮(ALD)干预后增殖的变化以及对细胞中I、III型胶原表达的影响。方法:采用胶原酶II消化法、差速贴壁法、差速脱壁法获取并纯化FCFS,在不同浓度醛固酮作用下,应用CCK-8活细胞计数试... 目的:探讨人胎儿心脏成纤维细胞(FCFS)经不同浓度的醛固酮(ALD)干预后增殖的变化以及对细胞中I、III型胶原表达的影响。方法:采用胶原酶II消化法、差速贴壁法、差速脱壁法获取并纯化FCFS,在不同浓度醛固酮作用下,应用CCK-8活细胞计数试剂盒检测细胞的增殖率。应用RT-PCR方法检测细胞中I型胶原前胶原A1(COL1A1)和III型胶原前胶原A1(COL3A1)mRNA的变化,应用Western blot检测COL1A1、COL3A1蛋白表达的变化。结果:ALD可浓度依赖性促-进FCFS增殖;低浓度的ALD(10-9、10-8、10-7mol/L)可明显促进FCFS中COL1A1、COL3A1表达,而10-6mol/L的ALD没有明显作用,10-5mol/L的ALD甚至起到抑制作用。结论:ALD可促进FCFS的细胞增殖,其增殖程度随浓度升高而升高;ALD在一定浓度范围内可以促进COL1A1和COL3A1表达,高浓度ALD对两种分子表达具有抑制作用。 展开更多
关键词 醛固酮 胶原 心肌纤维 胎儿心脏纤维细胞
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脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化 被引量:23
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作者 李扬 吴凯峰 +2 位作者 郭旭东 郭继彤 旭日干 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期653-655,共3页
通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(... 通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。 展开更多
关键词 脂质体介导 外源基因体外转染 胎儿纤维细胞 优化 绿色荧光蛋白 转染条件
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