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禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒灵敏性试验 被引量：5
1
作者 秦智锋 吕建强 +8 位作者 肖性龙 张东林 李环玲 陈书琨 钟安清 黄运生 林庆燕 林镜中 刘胜利 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期336-340,共5页
为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD50)的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚... 为了确定深圳出入境检验检疫局和深圳太太基因工程有限公司联合研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型禽流感的灵敏度,通过测定已知鸡胚半数致死量(ELD50)的标准毒株的进行了定量。利用9～11日龄SPF鸡胚,对深圳出入境检验检疫局保存的H5和H9亚型标准禽流感毒株进行了鸡胚半数致死量(ELD50)的测定,结果为H5亚型禽流感毒株的半数致死量为10-7.75/0.2mL,H9亚型禽流感毒株的半数致死量为10-8.5/0.2mL。用所研制的禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对H5和H9亚型标准禽流感毒株原液进行10倍连续稀释,进行实时荧光RT-PCR灵敏度的测定,结果发现:试剂盒检测H5亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-5倍稀释液,该稀释液含有281ELD50病毒量;检测H9亚型标准禽流感毒株的灵敏度为标准毒株10-8倍稀释液,该稀释液含有15.8ELD50病毒量。同时检测H5和H9时,试剂盒的灵敏度要比单独检测一个亚型时的灵敏度增加一个数量级。本灵敏度已经能够检测到感染鸡的喉拭子和(或)泄殖腔拭子所采集的病毒量,能够满足检验检疫的实际需要。 展开更多
关键词 禽流感病毒 鸡胚半数致死量 多重实时荧光rt-pcr 灵敏性试验
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应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒 被引量：8
2
作者 郑夔 丁国允 +5 位作者 周惠琼 谢雪妹 李小波 师永霞 苏锦坤 黄吉城 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期242-247,共6页
目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体... 目的建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1TCID50/mL和1TCID50/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。 展开更多
关键词 登革病毒 基孔肯雅病毒 内参 多重实时荧光RT—PCR
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口蹄疫病毒O型、A型和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用
3
作者 王翠 赵雪丽 +7 位作者 王东方 王淑娟 马震原 杨海波 刘影 柴茂 谢彩华 闫若潜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期61-69,共9页
为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究在比对多条FMDV基因的基础上,根据2B基因的最优保守区,设计O型、A型和Asia I型FMDV通用的反转录引物;再根据VP1基因的比对结果,以变异区为扩增靶区域,设... 为建立口蹄疫病毒(FMDV)O型、A型和AsiaⅠ型三重实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究在比对多条FMDV基因的基础上,根据2B基因的最优保守区,设计O型、A型和Asia I型FMDV通用的反转录引物;再根据VP1基因的比对结果,以变异区为扩增靶区域,设计3对分别针对O型、A型和AsiaⅠ型FMDV的特异性引物和TaqMan MGB探针。经优化反应体系和扩增程序等反应条件,建立基于探针技术的FDMV三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。验证该方法的特异性、敏感性和重复性,对15份临床疑似FMDV感染样品进行检测,并与基因测序方法及RT-PCR方法进行比较分析。结果显示:本研究成功建立了FMDV三重FQ-PCR方法,实现了一步法对FMDV O型、A型和AsiaⅠ型病原样品的鉴别检测。该方法可特异性扩增FMDV O型、A型和AsiaⅠ型标准株细胞培养物,但对猪水疱性口炎病毒(VSV)等7种病原及阴性对照未出现扩增,特异性较强;对FMDV O型、A型和AsiaⅠ型阳性重组质粒标准品的最低检出限均可达到10拷贝/μL,敏感性较高;批内/批间试验变异系数为0.48%~1.55%,重复性较好;利用建立的三重FQ-PCR方法对15份临床疑似FMDV感染样品进行检测,检测结果与基因测序结果完全一致,优于RT-PCR方法。本研究建立的三重FQ-PCR方法具有敏感性高、特异性强,在同一反应体系中能同时鉴别检测出FMDV O型、A型和AsiaⅠ型等优点,能满足临床鉴别检测的需求。 展开更多
关键词 口蹄疫病毒 三重实时荧光定量rt-pcr 应用
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盖塔病毒TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
4
作者 顾志刚 郭洁真 +4 位作者 王子涵 孙彤 陈鸿军 孙竹筠 陈丹清 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第1期112-118,共7页
盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引... 盖塔病毒(GETV)是一种在我国广泛分布的虫媒病毒,可通过蚊虫传播感染人畜,导致猪、马等动物出现发热、出疹及淋巴结肿大等症状,可致妊娠母猪流产或死胎。目前尚无特效治疗方式。本研究根据GenBank公布的盖塔病毒nsP1基因序列,设计3组引物探针,筛选出最佳的引物探针,建立一种灵敏度高、特异性强的针对盖塔病毒的TaqMan探针实时荧光定量RTPCR检测方法。对该方法进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品检测。标准曲线Ct值与相应质粒标准品浓度存在良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9989;对含GETV基因的重组质粒pCDNA3.1-nsP1体外转录RNA进行敏感性试验,最低检出限达10 copies,是普通RT-PCR方法的1000倍,敏感性高;与PRRSV、CSFV与PEDV的核酸不发生交叉反应,特异性好;变异系数小于2%,重复性好。本研究建立了一种敏感、特异的GETV检测方法,对GETV的快速诊断具有重要意义。 展开更多
关键词 盖塔病毒 nsP1 TAQMAN探针 实时荧光定量rt-pcr
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基于Taqman-MGB多重实时荧光PCR快速鉴定抗除草剂转基因大豆品系
5
作者 王凤军 王美蓉 +1 位作者 郑如福 陈锦辉 《中国粮油学报》 北大核心 2025年第1期211-219,共9页
通过NCBI比对DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419-2、SOYA 305423转基因大豆的序列同源性,在种属特异性区域设计多重引物和特异性荧光探针,同时提取基因组DNA,对退火温度和引物探针浓度进行优化,确定最佳反应程序,建立同时检测4种转... 通过NCBI比对DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419-2、SOYA 305423转基因大豆的序列同源性,在种属特异性区域设计多重引物和特异性荧光探针,同时提取基因组DNA,对退火温度和引物探针浓度进行优化,确定最佳反应程序,建立同时检测4种转基因大豆的多重实时荧光PCR方法。并对建立的实时荧光PCR反应进行特异性,重复性、灵敏性和适用性等方法学进行验证。结果表明DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419-2、DP305423靶标序列的线性回归方程分别为y=-3.1524x+36.958,y=-3.1689x+38.828,y=-3.469x+37.933和y=-3.4839x+39.644;相关系数R 2分别为0.994、0.997、0.995和0.992;扩增效率分别为107%、106%、94.2%和93.7%,检出限可达9个拷贝,方法特异性强,重现性好,灵敏度高,是一种快速、经济、实用的检测方法,可对转基因大豆品系及其转化体成分进行大批量快速鉴定。 展开更多
关键词 转基因大豆 品系鉴定 多重 实时荧光PCR
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车前草花叶病毒外壳蛋白基因实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用
6
作者 李鑫 李扬 +2 位作者 李辉 李可 王秀芬 《生物安全学报(中英文)》 北大核心 2025年第3期212-220,共9页
【目的】建立一套适用于百合车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)快筛的实时荧光RT-PCR检测方法。【方法】以PlAMV为检测目标,在NCBI网站上Blast检索数据库中的PlAMV以及相同寄主上常见的16种病毒的特异性基因外壳蛋... 【目的】建立一套适用于百合车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)快筛的实时荧光RT-PCR检测方法。【方法】以PlAMV为检测目标,在NCBI网站上Blast检索数据库中的PlAMV以及相同寄主上常见的16种病毒的特异性基因外壳蛋白(coat protein,CP)序列信息,根据序列碱基替换的饱和性分析、系统发育树分析以及遗传距离分析结果,确定PlAMV的特异性基因,以CP基因为靶标,设计特异性强的引物和探针,建立特异性实时荧光检测方法,验证引物特异性,测试反应的灵敏度,并对21份疑似感染PlAMV的百合样品测试检测效果。【结果】确定CP基因作为PlAMV检测的特异性基因,设计2组特异性引物和探针,利用疑似感染PlAMV的百合样品进行检测效果验证,建立了2套快筛的PlAMV实时荧光RT-PCR检测体系,检出限达到1 pg·μL^(-1),2组引物和探针均检测出21份阳性样品,检出率均为100%,2组引物和探针的扩增效率相近。【结论】建立的实时荧光RT-PCR反应体系可特异性定量检测PlAMV,并可应用于口岸样品进行快速、准确的筛查,为加强对PlAMV的分析与管控,制定全面系统的控制措施提供了技术支持。 展开更多
关键词 车前草花叶病毒 外壳蛋白 实时荧光 rt-pcr 生物信息学
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帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：2
7
作者 杨恒 李占鸿 +5 位作者 宋子昂 高林 李卓然 廖德芳 肖雷 李华春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期395-400,共6页
本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,... 本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。 展开更多
关键词 帕利亚姆病毒 血清型鉴定 实时荧光定量rt-pcr 检测方法
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鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 张靖鹏 陈翠腾 +5 位作者 林琳 付环茹 李兆龙 江斌 黄瑜 万春和 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期860-866,共7页
旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进... 旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。 展开更多
关键词 信鸽 鸽微RNA病毒 3 C基因 序列分析 实时荧光定量rt-pcr方法
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几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用
9
作者 赵文华 李富祥 杨仕标 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2022年第2期27-33,38,共8页
为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(... 为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示:建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^(1.70)~10^(2.08) copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10^(3) copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系Ⅳ型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量RT-PCR检测方法和四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测相应的3种或4种病毒病原,且具有临床样本检测的应用潜力。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 蓝舌病病毒8型 流行性出血热病毒1型 非洲马瘟病毒 四重普通rt-pcr 三重实时荧光定量rt-pcr
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蜂蜜中转基因成分启动子和终止子的多重实时荧光PCR法检测 被引量：1
10
作者 林碧莲 张雅薇 +8 位作者 高宇 何孟杭 邱秀玉 韩涛 张芳 傅德江 陈思琪 宋帆 柯振华 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第1期69-77,共9页
为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉... 为能高效率定位蜂蜜中的转基因可疑阳性样品,以10种转基因启动子和终止子(花椰菜花叶病毒35S启动子(pCaMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子(tNOS)、玄参花叶病毒的35S启动子(p FMV35S)、农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子(pNOS)、玉米泛素基因的启动子(pUbi)、烟草的花蕊特异性TA29的基因发育调节启动子(pTA29)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶基因的终止子(tE9)、章鱼碱合成酶终止子(t OCS)、谷氨酰胺转移酶7终止子(tg7)、花椰菜花叶病毒终止子(tCaMV35S))为研究靶标,进行10种启动子和终止子的引物和探针组合筛选、反应条件优化、灵敏度测定、质控品测试比对等实验,建立3组多重实时荧光PCR反应体系,并将其应用于市售蜂蜜的检测。结果表明:建立的3组多重实时荧光PCR反应体系能精准检出目的基因,其灵敏度分别为0.01、0.04、0.04 ng/μL;14种转基因质控品的测试显示多重实时荧光PCR和单重实时荧光PCR的检测结果一致;40份市售蜂蜜的筛查中,有两份蜂蜜检出pCaMV35S和tNOS,其余未检出,该方法大大提高了检测效率。该方法为蜂蜜中转基因成分的检测提供了快筛快检技术,同时也适用其它产品转基因成分的检测。 展开更多
关键词 蜂蜜 转基因 启动子 终止子 多重实时荧光PCR
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猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30毒株鉴别诊断荧光RT-PCR检测方法的建立
11
作者 覃国喜 米树运 +3 位作者 孙竹筠 刘德清 罗婷婷 熊炜 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期84-90,共7页
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预... 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的危害生猪养殖业的重要传染病之一。NADC30毒株是PRRSV的一种新毒株,其Nsp2存在131个不连续氨基酸缺失。该毒株在临床流行中致病力不同,且常规PRRSV疫苗免疫无法有效预防其感染,给养殖企业防控PRRSV带来困难。本研究基于TaqMan探针技术,针对经典型PRRSV保守基因序列及PRRSV NADC30缺失区域保守序列,设计不同荧光标记探针,建立双重实时荧光RT-PCR鉴别方法,可区分经典型PRRSV与PRRSV NADC30毒株。结果表明,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可快速区分经典型PRRSV毒株与PRRSV NADC30毒株,对PRRSV经典型疫苗毒株及临床NADC30毒株样本检测效果良好,适用于猪场临床样品中PRRSV NADC30毒株的快速鉴别诊断。 展开更多
关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 NDAC30毒株 双重实时荧光rt-pcr
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一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立 被引量：130
12
作者 张驰宇 徐顺高 黄新祥 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第9期883-888,共6页
为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成... 为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法. 展开更多
关键词 荧光实时定量rt-pcr 相对定量 绝对定量 标准曲线 mRNA定量 斜率
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实时荧光定量RT-PCR分析非小细胞肺癌SATB1的表达和临床病理意义 被引量：32
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作者 周来勇 刘芳 +3 位作者 童健 陈群请 张福伟 郭琳琅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期534-537,共4页
目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组... 目的检测非小细胞肺癌组织中SATB1 mRNA的表达,探讨SATB1表达与非小细胞肺癌发生、发展的关系及其临床病理意义。方法用TRIZOL提取非小细胞肺癌组织和正常肺组织总RNA后,将其反转录为cDNA,以实时荧光定量RT-PCR方法检测非小细胞肺癌组织及正常肺组织中SATB1 mRNA的表达,分析SATB1基因表达与临床病理参数的相关性。结果癌组织中SATB1 mRNA表达量为正常组织13倍,两者差异显著(P<0.001),其中有、无转移组分别为正常组织23.63倍和5.57倍。结论SATB1 mRNA的表达水平可能与非小细胞肺癌发生发展及淋巴转移有关,有望成为判断非小细胞肺癌预后的一个指标。 展开更多
关键词 非小细胞肺癌 SATB1 mRNA 实时荧光定量rt-pcr
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多重荧光RT-PCR同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒方法的建立 被引量：16
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作者 纪蕾 韩建康 +5 位作者 吴晓芳 徐德顺 邱妤怡 陈莉萍 沈月华 查赟峰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期311-315,共5页
目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一... 目的建立可同时检测GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的双重荧光RT-PCR快速检测方法,并应用于临床标本的检测。方法使用针对GI型和GⅡ型诺如病毒各亚型代表株保守序列设计的特异性引物和TaqMan探针,通过调整引物、探针浓度优化最佳反应条件,建立一步法荧光RT-PCR快速检测反应体系。对该方法的灵敏度、特异性、稳定性进行评估,并对临床粪便标本进行检测,与已有的单重荧光RT-PCR方法进行比较。结果实验结果表明,该检测方法特异性强,对GⅠ型、GⅡ型诺如病毒、轮状病毒、肠道腺病毒、甲型肝炎病毒进行检测,均无交叉反应;对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达1pg/mL和10pg/mL,并且重复性好;对101份临床标本分别用已有的单重荧光RT-PCR和本文建立的多重荧光RT-PCR进行检测,结果显示本文建立的多重荧光RT-PCR方法对GⅠ型诺如病毒的检测能力优于前者。结论本研究建立的多重荧光RT-PCR方法能同时对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒进行快速检测,并且灵敏度高,特异性好,可用于感染性腹泻暴发中诺如病毒的快速检测。 展开更多
关键词 诺如病毒 多重荧光rt-pcr 检测 GⅠ型 GⅡ型
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SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立 被引量：29
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作者 丛喆 李兆忠 +5 位作者 魏强 许琰 蒋虹 佟巍 卢圣栋 涂新明 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2006年第4期271-275,共5页
目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性... 目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。 展开更多
关键词 SIV 病毒载量 实时荧光定量rt-pcr SYBR GreenⅠ
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非洲猪瘟病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：15
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作者 王建华 陈小金 +5 位作者 赵丹 王玉玲 张俊哲 肖妍 董志珍 赵祥平 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期907-911,共5页
为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和高致病性猪繁殖与呼吸道综合征病毒(HP-PRRSV)的方法,本研究根据ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和HP-PRRSV NSP2基因,分别设计了3对特异性引物和Taq Man水解探针,建立了同时... 为建立同时检测非洲猪瘟病毒(ASFV)、猪瘟病毒(CSFV)和高致病性猪繁殖与呼吸道综合征病毒(HP-PRRSV)的方法,本研究根据ASFV CP530R基因、CSFV 5'UTR基因和HP-PRRSV NSP2基因,分别设计了3对特异性引物和Taq Man水解探针,建立了同时检测这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法,并对其反应条件进行优化。结果表明,该方法仅对ASFV、CSFV和HP-PRRSV呈现特异性扩增,不与伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的DNA以及猪流行腹泻病毒和猪流感病毒的c DNA发生交叉反应;该方法对ASFV、CSFV和HP-PRRSV的最低检出量分别为61拷贝/μL、11拷贝/μL和41拷贝/μL;组内和组间重复性试验的Ct值变异系数均小于2.5%,具有良好的重现性。用该方法对276份临床样品进行ASFV、CSFV和HP-PRRSV的检测,所有样品的ASFV检测结果均为阴性,CSFV检测单阳性样品6份,HP-PRRSV检测单阳性样品22份,CSFV和HP-PRRSV检测双阳性样品4份。本研究建立的方法为临床样品中ASFV、CSFV和HP-PRRSV的同时检测提供了一种快速、敏感和特异的技术手段。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 多重荧光定量rt-pcr
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猪嵴病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：9
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作者 修金生 陈小权 +1 位作者 王斌 李涛 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期922-926,共5页
目的本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果该方法检测PKV的3D基因在6.42×102～6.42×108拷贝/μL范围... 目的本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒(porcine kobuvirus,PKV)株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果该方法检测PKV的3D基因在6.42×102～6.42×108拷贝/μL范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为(84.94±0.24)℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强。所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%～1.14%,组间变异系数0.63%～1.79%,重复性好。结论本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染水平和确定感染靶器官提供新的检测方法。 展开更多
关键词 猪嵴病毒 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量rt-pcr
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实时荧光定量RT-PCR检测肝癌组织中miR-122a及miR-224的表达 被引量：6
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作者 刘卓然 陈小卫 +2 位作者 乔新惠 王蓉 向征 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期751-753,756,共4页
目的运用实时荧光定量RT-PCR方法分析miR-122与miR-224两种miRNAs在原发性肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨以miRNAs为靶点在早期肝癌中的临床诊断意义。方法采用基于2(-△△CT)的实时荧光定量RT-PCR法对35例肝癌组织及癌旁组织的miR-122a及m... 目的运用实时荧光定量RT-PCR方法分析miR-122与miR-224两种miRNAs在原发性肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨以miRNAs为靶点在早期肝癌中的临床诊断意义。方法采用基于2(-△△CT)的实时荧光定量RT-PCR法对35例肝癌组织及癌旁组织的miR-122a及miR-224进行了定量分析,结果经由Northernblot验证。结果与正常组织相比,在所有的被检肝癌组织中,均发现了miR-122a有不同程度的表达下调(P<0.01),而上述肝癌组织中的miR-224的定量结果显示该miRNA表达显著增加(P<0.001)。结论HCC组织中存在上述两种miRNAs表达水平的改变,实时荧光定量RT-PCR法为早期、准确的在临床上检测肝组织癌变提供了新的思路。 展开更多
关键词 MIR-122 miR-224 实时荧光定量rt-pcr 肝癌
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新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：11
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作者 袁远华 吴志新 +3 位作者 王俊峰 黄兴国 贺东生 黄淑坚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期738-741,共4页
为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结... 为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号。对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。 展开更多
关键词 新型鸭呼肠孤病毒 SYBR GreenⅠ 实时荧光定量rt-pcr
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猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：15
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作者 李军 蔡良语 +9 位作者 陈兵 刘建利 孙洁 陈书琨 林庆燕 陶虹 吴绍强 卢体康 陈金顶 秦智锋 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第9期801-805,共5页
为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特... 为对引起腹泻症状的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA) 3种病毒同时快速地鉴别检测,本研究对GenBank中登录的TGEV的S基因、PEDV的S基因、PRo VA的NSP基因进行序列分析,分别设计了针对3种病毒的特异性引物和用3种荧光基团标记的核酸探针,通过条件优化建立了针对这3种病毒的多重荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法能够特异性检测PEDV、TGEV和PRo VA,而与其它病原无交叉反应;对TGEV、PEDV和PRo VA的最低检测量分别为1.12拷贝/μL、39拷贝/μL和25拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于5%;该方法与商品化的试剂盒检测结果符合率达100%。该方法快速、敏感,检测结果准确可靠,为猪病毒性腹泻疾病的流行病学调查和分子生物学快速诊断奠定了基础。 展开更多
关键词 猪传染性胃肠炎病毒 猪流行性腹泻病毒 猪轮状病毒A 荧光定量rt-pcr检测 多重检测
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