新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白遗传进化分析及多克隆抗体制备

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作者 钟日成 林寅盛 张济培 《广东畜牧兽医科技》 2025年第2期30-36,共7页

新型呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)是可引起番鸭、北京鸭和鹅等多种水禽,发生肝脏、脾脏不规则出血和坏死的传染性疾病,近年来广东地区水禽中该病的发病率呈上升趋势。为了解广东地区新型呼肠孤病毒遗传进化特征,该试验从广东... 新型呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)是可引起番鸭、北京鸭和鹅等多种水禽,发生肝脏、脾脏不规则出血和坏死的传染性疾病,近年来广东地区水禽中该病的发病率呈上升趋势。为了解广东地区新型呼肠孤病毒遗传进化特征,该试验从广东佛山某鸭场发病番鸭中分离得到一株试验毒株,通过对该毒株σC基因序列分析,结果表明该试验毒株与NDRV同处于一个分支,并且核苷酸相似性达95.1%-99.6%;而与典型MDRV和ARV遗传距离较远,且相似性均低于50%。与SH12和DH13毒株相比,该试验毒株出现了15个氨基酸残基的变异。为了解该试验毒株σC蛋白的抗原性,进一步构建了pET32a⁃σC质粒,并建立了重组σC蛋白在BL21(DE3)内稳定表达的方法,通过Western blot鉴定该蛋白能够与NDRV阳性血清和兔多克隆抗体发生特异性结合。为进一步了解NDRV在广东地区水禽中的遗传进化特征以及基因工程疫苗的研发提供参考。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σC蛋白 遗传进化分析 多克隆抗体制备

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嗜水气单胞菌Hcp蛋白的原核表达·多克隆抗体制备及生物信息学分析

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作者 许艺兰 许佳乐 +8 位作者 卢冰霞 陈婷婷 秦毅斌 刘思雨 全琛宇 许心婷 赵硕 陈忠伟 何颖 《安徽农业科学》 CAS 2024年第23期79-84,共6页

[目的]获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)Hcp蛋白的多克隆抗体(Polyclonal Antibody)及基本生物学特性。[方法]利用RT-PCR方法扩增Hcp基因,构建重组表达质粒后转化BL21感受态细胞,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thi... [目的]获得嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)Hcp蛋白的多克隆抗体(Polyclonal Antibody)及基本生物学特性。[方法]利用RT-PCR方法扩增Hcp基因,构建重组表达质粒后转化BL21感受态细胞,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷,Isopropylβ-D-Thiogalactoside)诱导表达获得Hcp重组蛋白,纯化后免疫家兔,制备针对该蛋白的多克隆抗体,进行抗体的效价测定、Western blotting鉴定,利用生物信息学在线工具对其基本理化性质、保守结构域、磷酸化位点、二级与三级结构进行预测。[结果]该蛋白在IPTG终浓度为0.6 mmol/L、37℃下诱导表达6 h可获得最高表达量,蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在;Western blotting结果显示,AH的培养物上清与沉淀均能够与制备的兔抗发生特异性结合,具有良好的反应原性,制备的多克隆抗体效价达1.024×10^(6)。生物信息学分析表明,嗜水气单胞菌Hcp蛋白的分子式为C_(846)H_(1304)N_(224)O_(259)S_(8),共编码172个氨基酸,相对分子质量为19013.49 u,等电点(PL)为5.24,属于稳定蛋白;二级结构中无规则卷曲占比为51.74%,延伸链占比为25.00%,α-螺旋占比为19.19%,β-转角占比为4.07%。[结论]成功制备了Hcp蛋白的多克隆抗体,为进一步研究AH的VI型分泌系统(Type VI secretion system,T6SS)提供技术支持。 展开更多

关键词 嗜水气单胞菌 Hcp基因 原核表达 多克隆抗体制备 生物信息学

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重组蛋白Lv-PEN-3的表达纯化与多克隆抗体制备

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作者 杜志强 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期938-940,共3页

以凡纳滨对虾的对虾素3(Lv-PEN-3)基因作为研究对象,分别进行了大肠杆菌重组表达载体的构建、重组蛋白的诱导表达与亲和纯化,以及多克隆抗体的制备等研究。研究结果显示:Lv-PEN-3可以被大肠杆菌正确表达,而且该重组蛋白具有良好的免疫... 以凡纳滨对虾的对虾素3(Lv-PEN-3)基因作为研究对象,分别进行了大肠杆菌重组表达载体的构建、重组蛋白的诱导表达与亲和纯化,以及多克隆抗体的制备等研究。研究结果显示:Lv-PEN-3可以被大肠杆菌正确表达,而且该重组蛋白具有良好的免疫刺激作用,可以刺激家兔产生相应的抗体。 展开更多

关键词 凡纳对虾 对虾素 诱导表达 纯化 多克隆抗体制备

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拟南芥自噬蛋白ATG8e的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：2

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作者 刘希 李远凤 +1 位作者 齐亚飞 郁飞 《江苏农业科学》 2018年第18期47-51,共5页

构建拟南芥自噬相关基因ATG8e的原核表达载体p GEX-4T-1-ATG8e,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到融合蛋白GST-ATG8e。GST-ATG8e蛋白首先用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂亲和纯化,然后用凝血酶酶切去除... 构建拟南芥自噬相关基因ATG8e的原核表达载体p GEX-4T-1-ATG8e,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导得到融合蛋白GST-ATG8e。GST-ATG8e蛋白首先用谷胱甘肽琼脂糖凝胶树脂亲和纯化,然后用凝血酶酶切去除谷胱甘肽S移换酶(glutathione S-transferase,简称GST)标签,最后十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)割胶纯化,用纯化后14 ku的ATG8e蛋白免疫家兔4次得到抗血清,纯化抗血清制备高效ATG8e多克隆抗体。提取野生型拟南芥和ATG8e超表达植株叶片总蛋白做免疫印迹检测,结果在2种基因型植物叶片蛋白样品中均能检测到与ATG8e分子量大小一致的条带,且ATG8e超表达植物中ATG8e积累量明显高于野生型。成功制备了拟南芥ATG8e蛋白多克隆抗体,为研究ATG8e在自噬中的作用奠定了试验基础。 展开更多

关键词 自噬蛋白 ATG8e 蛋白纯化 多克隆抗体制备 免疫印迹

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黄颡鱼自噬相关基因LC3B和Beclin1的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：3

5

作者 魏晓雷 叶汉梅 罗智 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期1197-1202,共6页

为深入研究黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco自噬的发生过程和机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得372和1344 bp的黄颡鱼LC3B(PfLC3B)和Beclin1(PfBeclin1)基因编码序列,并成功构建了pET32a(+)-PfLC3B和pET32a(+)-PfBeclin1重组表达载体,分别采... 为深入研究黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco自噬的发生过程和机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得372和1344 bp的黄颡鱼LC3B(PfLC3B)和Beclin1(PfBeclin1)基因编码序列,并成功构建了pET32a(+)-PfLC3B和pET32a(+)-PfBeclin1重组表达载体,分别采用亲和层析和包涵体纯化的方法得到了纯度较高的重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白;以重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白免疫Balb/C小鼠,制备多克隆抗体。通过Western blot鉴定了PfLC3B和PfBeclin1抗血清可以分别特异性识别重组PfLC3B和PfBeclin1蛋白;PfLC3B抗血清可以特异性识别黄颡鱼内源性LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白,PfBeclin1抗血清可以特异性识别黄颡鱼内源性Beclin1蛋白。蛋白水平的组织分布显示,黄颡鱼LC3和Beclin1蛋白在肝脏中表达水平均较高,在肾脏和脾脏中的表达水平较低。综上所述,研究成功制备了黄颡鱼LC3B和Beclin1的多克隆抗体,为深入研究黄颡鱼自噬机制提供了有力工具。 展开更多

关键词 黄颡鱼 LC3B BECLIN1 原核表达 多克隆抗体制备

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拟南芥ERA-1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量：1

6

作者 付世英 刘夏燕 《江苏农业科学》 北大核心 2017年第8期33-36,共4页

将拟南芥ERA-1基因除信号肽外的剩余编码序列克隆到原核表达载体p ET28a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,发现表达的目的蛋白位于包涵体中,大量表达目的蛋白并用镍柱亲和层析法进行纯化,获得足量的重组蛋白后将其作为抗原免疫家兔,获... 将拟南芥ERA-1基因除信号肽外的剩余编码序列克隆到原核表达载体p ET28a上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中表达,发现表达的目的蛋白位于包涵体中,大量表达目的蛋白并用镍柱亲和层析法进行纯化,获得足量的重组蛋白后将其作为抗原免疫家兔,获得抗血清。用重组蛋白亲和纯化抗血清中的ERA-1多克隆抗体。利用野生型拟南芥、ERA-1敲除突变系和ERA-1过表达系的叶片总蛋白进行免疫印迹试验,检测ERA-1多克隆抗体的特异性,发现纯化后的ERA-1多克隆抗体(1∶1 000体积比稀释)能特异地检测到拟南芥中的ERA-1蛋白。本试验成功制备了ERA-1蛋白的多克隆抗体,可以用于今后对ERA-1基因功能的研究。 展开更多

关键词 拟南芥ERA-1 原核表达 蛋白纯化 抗血清 多克隆抗体制备

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北柴胡转录因子BcAP2-13的原核表达和多克隆抗体制备 被引量：1

7

作者 徐娇 朱楚然 +3 位作者 都明理 王丽红 隋春 魏建和 《江苏农业科学》 2019年第10期66-69,共4页

利用带有促溶标签SUMO和纯化标签6×His的原核表达载体,构建了调控北柴胡皂苷生物合成的转录因子基因BcAP2-13的原核表达载体p13-SUMO-His6。载体热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D... 利用带有促溶标签SUMO和纯化标签6×His的原核表达载体,构建了调控北柴胡皂苷生物合成的转录因子基因BcAP2-13的原核表达载体p13-SUMO-His6。载体热激转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)后,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导培养,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,28℃和37℃不同温度诱导条件下均得到了融合蛋白13-SUMO-His 6。以Ni-NTA柱纯化的融合蛋白为抗原,免疫成年兔4次以制备多克隆抗体。间接酶联免疫法检测结果表明,所得抗体效价较高。提取北柴胡毛状根及BcAP2-13超表达毛状根的总蛋白,免疫印迹检测结果表明,在2种毛状根蛋白样品中均能检测到与预计13-SUMO-His6蛋白分子量大小一致的条带,BcAP2-13过表达毛状根总蛋白样品的条带强于普通毛状根总蛋白样品的条带,与预期一致。成功制备了北柴胡BcAP2-13的多克隆抗体,为进一步研究北柴胡转录因子BcAP2-13的确切作用位点和调控机制奠定了基础。 展开更多

关键词 北柴胡 转录因子 原核表达 多克隆抗体制备 免疫印迹

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黄颡鱼Cu稳态相关基因ccs和cox17的原核表达及多克隆抗体制备

8

作者 杨洪 魏晓雷 +1 位作者 谭肖英 罗智 《水生生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第10期1609-1616,共8页

为深入研究黄颡鱼Tachysurus fulvidraco Cu稳态调控机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得了810和192 bp的ccs (Pfccs)和cox17 (Pfcox17)基因编码序列,并成功构建了p ET32a(+)-Pfccs和p ET32a(+)-Pfcox17重组表达载体;转化重组质粒到E. coli Ros... 为深入研究黄颡鱼Tachysurus fulvidraco Cu稳态调控机制,从黄颡鱼cDNA中克隆获得了810和192 bp的ccs (Pfccs)和cox17 (Pfcox17)基因编码序列,并成功构建了p ET32a(+)-Pfccs和p ET32a(+)-Pfcox17重组表达载体;转化重组质粒到E. coli Rosetta (DE3)感受态细胞中,以IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)作为诱导剂诱导表达,通过SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达,发现PfCCS蛋白主要在沉淀中表达, PfCOX17蛋白主要在上清中表达;分别采用包涵体和亲和层析纯化的方法得到了纯度较高的重组PfCCS和PfCOX17蛋白;以纯化得到的PfCCS和PfCOX17蛋白免疫Balb/C小鼠3次,制备多克隆抗体。通过Western Blot鉴定了PfCCS和PfCOX17抗血清可以分别特异性识别重组PfCCS和PfCOX17蛋白,也可以分别特异性识别黄颡鱼内源性CCS和COX17蛋白。通过Western Blot对黄颡鱼CCS和COX17蛋白在鳃、心脏和肝脏中的分布情况进行检测,发现黄颡鱼CCS和COX17蛋白在肝脏中具有较高的表达水平, CCS蛋白在鳃中的表达水平最低,而COX17蛋白在鳃和心脏中的表达水平都很低。综上所述,研究成功制备了黄颡鱼CCS和COX17蛋白的多克隆抗体,为深入研究CCS和COX17蛋白在Cu转运中的作用及黄颡鱼Cu稳态调控机制奠定基础。 展开更多

关键词 CCS COX17 原核表达 多克隆抗体制备 黄颡鱼

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草原短尾羊Brachyury蛋白多克隆抗体制备

9

作者 杨光 霍雨佳 +5 位作者 苏红 智达夫 刘默凝 窦傲蕾 王家业 曹贵方 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2022年第4期1-7,16,共8页

【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法... 【目的】克隆草原短尾羊Brachyury基因(即T基因)编码区(CDS),并制备Brachyury蛋白特异性多克隆抗体,为草原短尾羊短尾表型机制研究提供重要的试验材料。【方法】提取草原短尾羊16 d胚胎的组织RNA,反转成cDNA,以cDNA为模板,采用PCR方法克隆草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列。将Brachyury基因CDS全长序列连接至pEASY■-Blunt E1载体,构建原核表达载体pEASY■-Blunt E1-Brachyury,并进行NheⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。将原核表达载体导入RosettagamiB(DE3)大肠杆菌,并进行IPTG诱导表达,对表达产物进行回收纯化。利用纯化后的表达产物免疫6周龄日本大耳白兔,用间接ELISA(iELISA)法测定血清多克隆抗体效价。以制备的多克隆抗体为一抗,采用Western blot法检测草原短尾羊16,20,25和30 d胚胎中Brachyury蛋白的表达水平。【结果】克隆了1335 bp的草原短尾羊Brachyury基因CDS全长序列,成功构建了原核表达载体pEASY■-Blunt E1-Brachyury,表达获得了49.16 ku的重组Brachyury蛋白。成功制备了重组Brachyury蛋白多克隆抗体,抗体效价达1∶1500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。草原短尾羊16 d胚胎中Brachyury蛋白的表达量最高。【结论】成功制备草原短尾羊Brachyury蛋白兔血清多克隆抗体,抗体效价为1∶1500,该多克隆抗体可以特异性识别草原短尾羊胚胎中的Brachyury蛋白。 展开更多

关键词 草原短尾羊 胚胎 Brachyury基因 多克隆抗体制备

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犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析

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作者 王栋 刘营 +3 位作者 张康 张鸿焱 苏峰 马卫明 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2020年第3期892-901,共10页

试验旨在获得高纯度犬降钙素原(procalcitonin,PCT)重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态... 试验旨在获得高纯度犬降钙素原(procalcitonin,PCT)重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a(+),未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1∶51200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。 展开更多

关键词 降钙素原(PCT) 原核表达 纯化 多克隆抗体制备

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Ⅰ型牛疱疹病毒VP22蛋白原核表达及多克隆抗体制备

11

作者 郭伟强 段绪来 +3 位作者 解佳 赵学亮 刘英楠 陈鸿军 《动物医学进展》 北大核心 2023年第11期20-25,共6页

为制备Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)VP22蛋白抗体,选用国内分离株BHV-SHJS,在其UL49基因核酸序列第517至747位间设计引物扩增目的片段,构建pET-28a-UL49(172-249 aa)原核表达载体,转化载体至BL21(DE3)感受态细胞;经IPTG诱导表达并纯化VP22(172... 为制备Ⅰ型牛疱疹病毒(BHV-1)VP22蛋白抗体,选用国内分离株BHV-SHJS,在其UL49基因核酸序列第517至747位间设计引物扩增目的片段,构建pET-28a-UL49(172-249 aa)原核表达载体,转化载体至BL21(DE3)感受态细胞;经IPTG诱导表达并纯化VP22(172-249 aa)融合蛋白后;用该融合蛋白作抗原,以皮下注射的方式免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体;经间接ELISA、Western blot及间接免疫荧光(IFA)方法检测其灵敏度和特异性。结果表明,表达的VP22蛋白以包涵体形式存在;ELISA测定结果显示,制备的VP22蛋白抗体效价达到1∶16000;Western blot和IFA结果显示,制备的多克隆抗体能与BHV-SHJS VP22特异性结合,具有良好的反应原性。试验结果为后期BHV-1感染宿主细胞在机制方面的研究和VP22功能的探究奠定了基础。 展开更多

关键词 Ⅰ型牛疱疹病毒 VP22蛋白表达 多克隆抗体制备

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马疱疹病毒1型ORF2蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

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作者 杨贤斌 吴桂灵 +5 位作者 撒瑞雪 杨凯舒 张嗣玉 齐晋卫 李银涛 刘建华 《现代畜牧兽医》 2024年第6期1-5,共5页

研究旨在克隆马疱疹病毒1型(EHV-1)ORF2基因,通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白,制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列(GenBank:MT063054)设计1对引物,将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中,通过Transetta(DE3)... 研究旨在克隆马疱疹病毒1型(EHV-1)ORF2基因,通过大肠杆菌原核表达系统获得ORF2蛋白,制备多克隆抗体。根据EHV-1 YM2019株全基因组序列(GenBank:MT063054)设计1对引物,将ORF2基因克隆至pET-28a-ORF2原核表达载体中,通过Transetta(DE3)感受态细胞,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达ORF2蛋白,使用Ni-NTA琼脂糖纯化树脂纯化,免疫BALB/c小鼠,检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示:ORF2基因成功克隆至原核表达载体pET-28a中,并通过大肠杆菌表达系统得到ORF2蛋白,大小约为38 ku,以包涵体的形式存在。通过Ni-NTA纯化树脂获得纯度较高的重组蛋白,能够与EHV-1阳性血清特异性结合;间接ELISA方法检测多克隆抗体的效价为1∶64000,RK-13表达的ORF2蛋白可被多克隆抗体能特异性识别。研究表明,大肠杆菌表达的ORF2重组蛋白具有良好反应原性,ORF2蛋白制备的多克隆抗体效价高、特异性强,可为ORF2蛋白的生物学功能和基因缺失疫苗的研究奠定基础。 展开更多

关键词 马疱疹病毒1型 ORF2蛋白 原核表达 多克隆抗体制备

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小麦类脱水素的表达、纯化及多克隆抗体的制备 被引量：6

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作者 杨颖 张林生 +1 位作者 张晓娟 山仑 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第9期960-964,共5页

脱水素在胚胎发育后期累积,外源脱落酸(ABA)、低温、干旱和其他一些环境条件下能诱导脱水素的产生,尽管植物在脱水条件下脱水素广泛存在于细胞中,但其生化功能仍不清楚.为研究小麦在不同时期脱水素基因的表达情况和生物学功能及抗体制备... 脱水素在胚胎发育后期累积,外源脱落酸(ABA)、低温、干旱和其他一些环境条件下能诱导脱水素的产生,尽管植物在脱水条件下脱水素广泛存在于细胞中,但其生化功能仍不清楚.为研究小麦在不同时期脱水素基因的表达情况和生物学功能及抗体制备,以小麦幼芽为材料,经干旱胁迫处理后,提取总RNA,通过RT-PCR得到小麦类脱水素基因片段(WZY1-1),再连接至克隆载体PUCM-T,并成功构建重组表达质粒PET-32a(+)-wzy1-1,将阳性重组质粒转化于受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.结果表明,表达蛋白位于37ku处,小麦类脱水素基因获得高效表达.表达蛋白经Ni2+琼脂糖凝胶亲和层析和透析袋电洗脱法纯化后,对兔子进行免疫,制备的抗血清通过ELISA检测到较高的多克隆抗体效价.蛋白质印迹结果显示,利用纯化的蛋白质制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白质带特异性结合,且郑引1号小麦幼苗进行干旱处理,提取粗蛋白,SDS-PAGE,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28ku处出现特异的蛋白质条带,这说明所制备的抗血清可以与小麦叶片所表达的dehydrin蛋白特异性结合,证明其具有良好的免疫原性. 展开更多

关键词 脱水素蛋白 原核表达 多克隆抗体制备

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O型FMDV VP1基因的表达鉴定及其多克隆抗体的制备 被引量：1

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作者 任宪刚 薛飞 +3 位作者 朱远茂 冯军科 史鸿飞 高欲燃 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期568-571,共4页

为制备O型口蹄疫病毒(FMDV)VPI抗血清,本研究人工合成了FMDV的VPI基因,并克隆构建了采用PCR方法以pUC57-VP1重组质粒,以其作为模板,经PCR将VPI基因亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-VP1。重组质粒鉴定验证后,转化至大... 为制备O型口蹄疫病毒(FMDV)VPI抗血清,本研究人工合成了FMDV的VPI基因,并克隆构建了采用PCR方法以pUC57-VP1重组质粒,以其作为模板,经PCR将VPI基因亚克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-VP1。重组质粒鉴定验证后,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果显示重组蛋白的分子量约为38ku,以包涵体的形式存在。Westernblot与间接ELISA结果显示重组蛋白能够与FMDV阳性血清反应。进一步将纯化的重组蛋白免疫BALB/c鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶1600。本研究为FMDV的其他研究工作提供了基础材料。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 VP1基因 表达鉴定 多克隆抗体制备

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拟南芥PRL1多克隆抗体的制备及应用 被引量：2

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作者 樊瑛 梁爽 +2 位作者 刘思宇 郑璐 齐亚飞 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2019年第4期129-137,共9页

【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯... 【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔,从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,将其克隆至植物表达载体pBI111L中,再转化到农杆菌GV3101中,利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列,成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体,实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达(包涵体)。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,成功构建了pBI111L-PPRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体,用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54ku的蛋白,该蛋白在prl1点突变体中表达量下降,在PRL1T-DNA插入突变体中缺失,而在prl1回复株系中表达量升高,并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体,可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。 展开更多

关键词 拟南芥 PRL1蛋白 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体制备

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小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)的原核表达及兔多克隆抗体的制备与鉴定

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作者 蔡玥 马仕昆 +4 位作者 董樾 张薇 夏蒙蒙 牛长敏 郑英 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第9期826-832,共7页

目的原核表达小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)蛋白并制备兔抗小鼠Stra8多克隆抗体。方法应用分子克隆法构建pET28a-Stra8原核表达重组质粒,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Stra8蛋白表达,采用组氨... 目的原核表达小鼠视黄酸刺激基因8(Stra8)蛋白并制备兔抗小鼠Stra8多克隆抗体。方法应用分子克隆法构建pET28a-Stra8原核表达重组质粒,将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导Stra8蛋白表达,采用组氨酸标签(His-TAG)亲和层析柱纯化原核蛋白。以纯化后的Stra8蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备Stra8多克隆抗体。ELISA测定多克隆抗体的效价,Western blot法检测制备的抗体对睾丸组织Stra8蛋白的识别能力以确定其有效性,免疫荧光组织化学染色法检测睾丸组织中Stra8蛋白的表达以确定多克隆抗体的特异性。结果pET28a-Stra8重组质粒经双酶切和测序鉴定正确,经诱导后能高效表达Stra8蛋白,应用His-TAG亲和层析法获得纯度较高的Stra8蛋白。应用纯化的Stra8蛋白连续免疫新西兰大白兔5次后,提取抗血清,经ELISA检测获得的Stra8多克隆抗体效价为1∶106,Western blot法分析显示多克隆抗体可特异性地识别睾丸组织中的内源性Stra8蛋白,免疫荧光染色法显示该多克隆抗体能够特异性的识别小鼠睾丸组织精原细胞表达的Stra8蛋白。结论在大肠杆菌中有效地诱导表达Stra8原核蛋白并制备了特异性的兔抗Stra8多克隆抗体。 展开更多

关键词 小鼠 视黄酸刺激基因8(Stra8) 原核蛋白表达 多克隆抗体制备

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绵羊FecB基因的原核表达及其抗体制备

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作者 丁强 张利平 +2 位作者 贾建磊 王静 张勇 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2015年第3期31-36,共6页

为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆... 为了进一步研究FecB基因,利用PCR-RFLP技术筛选出FecB基因,PCR扩增FecB基因编码区序列1509bp,利用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ定向插入原核表达载体pET30a(+),构建原核表达载体pET30a(+)-FecB,诱导表达纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体,WesternBlot检测重组蛋白的免疫活性,ELISA检测抗体效价。结果表明,成功的构建了绵羊FecB基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白,经过4次免疫后,获得多克隆抗体,ELISA方法检测小鼠抗体免疫效价达到1∶32000,纯化的蛋白具有免疫活性。为研究绵羊FecB基因蛋白的功能提供参考。 展开更多

关键词 FECB基因 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体制备

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斜带石斑鱼IgZ重链基因的表达纯化和抗体制备 被引量：2

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作者 姚占娟 张其中 崔淼 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期149-152,共4页

为获得斜带石斑鱼IgZ重链基因的多克隆抗体,成功构建了斜带石斑鱼免疫球蛋白IgZ重链重组蛋白表达质粒pQE30/IgZ,将其转化到大肠杆菌表达菌株M15中,确定了最佳诱导表达条件:IPTG 0.2 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6 h。所获得的IgZ重链... 为获得斜带石斑鱼IgZ重链基因的多克隆抗体,成功构建了斜带石斑鱼免疫球蛋白IgZ重链重组蛋白表达质粒pQE30/IgZ,将其转化到大肠杆菌表达菌株M15中,确定了最佳诱导表达条件:IPTG 0.2 mmol/L,诱导温度30℃,诱导时间6 h。所获得的IgZ重链重组蛋白经Ni-NTA亲和层析后,纯度达到85%以上;以纯化的IgZ重链重组蛋白为抗原免疫新西兰兔,制备出相应的多克隆抗体,经ELISA测定抗血清效价约为1∶320 000。 展开更多

关键词 斜带石斑鱼 免疫球蛋白Z 原核表达 多克隆抗体制备

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猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立 被引量：1

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作者 刘思雨 何颖 +6 位作者 卢冰霞 赵武 赵硕 许心婷 全琛宇 秦毅斌 欧阳康 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期1238-1248,共11页

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDC... 【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。 展开更多

关键词 猪丁型冠状病毒 NSP14蛋白 原核表达 多克隆抗体制备 间接ELISA

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马铃薯蔗糖磷酸合成酶StSPS1的原核表达及抗体制备

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作者 蔡诚诚 李罗品 +4 位作者 温和 刘石锋 王强 李立芹 王西瑶 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2023年第6期11-17,共7页

为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因,该基因编码区全长为3165 bp,编码蛋白的长度为1055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30... 为了对马铃薯蔗糖磷酸合成酶(SPS)编码蛋白StSPS1进行原核表达及多克隆抗体制备。从四倍体马铃薯品种川芋10号的块茎中克隆出了StSPS1基因,该基因编码区全长为3165 bp,编码蛋白的长度为1055 aa。随后基于构建的His标签融合表达载体PET30a-StSPS1,进行了StSPS1蛋白的诱导、变性、纯化、复性及兔免疫试验。结果发现,StSPS1蛋白分子量约为119.62 ku,在可溶性上清中的表达极少,主要在不溶的沉淀中表达,最佳的诱导条件为37℃下用0.5或1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h。由于StSPS1为包涵体蛋白,故对其进行包涵体变性处理,并利用His标签纯化出了与目的条带大小相符的蛋白,同时通过His抗体进行了蛋白质免疫印迹(WB)试验,发现在119.62 ku处检测到目标条带,说明StSPS1包涵体蛋白纯化成功。最后,通过将透析复性后的StSPS1蛋白注射进兔子皮下组织中,成功免疫出2个StSPS1的抗体,经过WB鉴定发现2个抗体均能在抗原和川芋10号叶片的总蛋白中杂出目标条带。综上,对马铃薯StSPS1蛋白进行了诱导及纯化,并成功制备了StSPS1蛋白的兔多克隆抗体。 展开更多

关键词 马铃薯 蔗糖磷酸合成酶 StSPS1 原核表达 多克隆抗体制备

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