目的研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的转染和病毒载体对晶状体上皮细胞增生的影响...目的研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的转染和病毒载体对晶状体上皮细胞增生的影响,探讨rAAV2作为后囊膜混浊基因治疗载体的可行性。方法rAAV2-EGFP按感染复数(mul-tiplicity of infection,MOI)为104、105、2×105、106转染N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测rAAV2-EGFP对N/N1003A细胞的转染效率,MTT比色法测定rAAV2载体对N/N1003A增生的影响。结果EGFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆。rAAV2-EGFP的转染效率随着MOI的增加和时间的延长而增加,MOI=106时,转染后第7d达到71.12%.MTT法显示各转染组与未转染组A值无统计学差异。结论重组腺相关病毒载体可以介导EGFP基因高效稳定转染晶状体上皮细胞,并且对细胞增生无抑制作用,腺相关病毒作为后囊膜混浊基因治疗载体是可行的。展开更多
目的比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast,HFB)的转染效率。方法原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of in-fection,MOI)为104、10...目的比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast,HFB)的转染效率。方法原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of in-fection,MOI)为104、105、106转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的转染效率,倒置荧光显微镜观察转染后的荧光强度。MTT法检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的毒性。结果腺相关病毒AAV2-EGFP对HFB的转染效率随着MOI增加而增高,MOI为104时转染效率为(7.68±1.18)%,当MOI达到105后,转染效率稳定在(22.16±5.59)%,随着MOI增加,最高至MOI 106转染效率无显著提高。而病毒AAV2/1对于HFB的转染效率在MOI为106转染效率仅为(3.47±0.93)%。2种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异。结论AAV2载体对体外培养的HFB转染效率高于AAV2/1,但2种病毒载体对人皮肤成纤维细胞转染效率均不高,AAV2/1-EGFP对HFB几乎无感染能力。展开更多
目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导...目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于基因治疗研究。方法酶切含有EGFP基因和启动子以及含有米非司酮调控系统的质粒pRS-17,亚克隆到穿梭质粒PDC313上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,利用报告基因引物对病毒进行鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用最终稀释法测定其滴度,并在SW620细胞中检测其基因调控效果。结果成功地构建了携带有米非司酮调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RUEGFP,病毒滴度达到6.6×1010pfu/ml。当给予诱导剂米非司酮后,腺病毒载体可以诱导表达EGFP,两者在一定范围内呈正比,而没有米非司酮时,几乎无报告基因的表达。结论腺病毒Ad-RUEGFP能调控外源基因的表达,为下一步体内基因治疗实验奠定了实验基础。展开更多
目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行...目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。展开更多
目的:研究重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌(HASMCs)的方法。方法:用组织贴块原代培养传代至3～8代的HASMCs,重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI...目的:研究重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌(HASMCs)的方法。方法:用组织贴块原代培养传代至3～8代的HASMCs,重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染,荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率,CCK-8法检测其对细胞的毒性。结果:随着MOI增高,转染效率增高。MOI=100时Ad-GFP对HASMCs的感染效率可达(96±0.32)%,以感染后48h达高峰,持续7d仍有绿色荧光表达;转染后的细胞与未转染细胞相比,细胞毒性无统计学差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因Ad-GFP能高效转染HASMCs,转染后对细胞无毒性,是一种安全的基因载体。展开更多
文摘目的研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP)对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的转染和病毒载体对晶状体上皮细胞增生的影响,探讨rAAV2作为后囊膜混浊基因治疗载体的可行性。方法rAAV2-EGFP按感染复数(mul-tiplicity of infection,MOI)为104、105、2×105、106转染N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜下观察晶状体上皮细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测rAAV2-EGFP对N/N1003A细胞的转染效率,MTT比色法测定rAAV2载体对N/N1003A增生的影响。结果EGFP在细胞中的表达呈绿色,弥漫于整个胞浆。rAAV2-EGFP的转染效率随着MOI的增加和时间的延长而增加,MOI=106时,转染后第7d达到71.12%.MTT法显示各转染组与未转染组A值无统计学差异。结论重组腺相关病毒载体可以介导EGFP基因高效稳定转染晶状体上皮细胞,并且对细胞增生无抑制作用,腺相关病毒作为后囊膜混浊基因治疗载体是可行的。
文摘目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于基因治疗研究。方法酶切含有EGFP基因和启动子以及含有米非司酮调控系统的质粒pRS-17,亚克隆到穿梭质粒PDC313上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,利用报告基因引物对病毒进行鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用最终稀释法测定其滴度,并在SW620细胞中检测其基因调控效果。结果成功地构建了携带有米非司酮调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RUEGFP,病毒滴度达到6.6×1010pfu/ml。当给予诱导剂米非司酮后,腺病毒载体可以诱导表达EGFP,两者在一定范围内呈正比,而没有米非司酮时,几乎无报告基因的表达。结论腺病毒Ad-RUEGFP能调控外源基因的表达,为下一步体内基因治疗实验奠定了实验基础。
文摘目的构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的Hela细胞系。方法PCR和DNA测序鉴定pEGFP-C1真核表达质粒,采用Qiagen tip 500进行pEGFP-C1真核表达质粒DNA的提取和纯化;cellfectin转染Hela细胞,G418筛选,有限稀释法单克隆培养,荧光显微镜进行荧光检测EGFP的表达,采用激光共聚焦显微镜观测器检测荧光特性。结果PCR和DNA测序证实pEGFP质粒结构正确;在倒置荧光显微镜下,转染24h后,部分Hela细胞可见绿色荧光,转染72h时,大约80%Hela细胞内均可见绿色荧光。加入含G418的选择性培养基进行选择性培养,选择荧光较强的Hela细胞经有限稀释,持续筛选及克隆化培养,获得稳定表达绿色荧光的Hela细胞克隆,扩大培养并传至10代以上,将此细胞株命名为Hela-EGFP。激光共聚焦显微镜观察发现:在蓝光(-395nm)激发时,Hela-EGFP细胞绿色荧光激发波长为395nm,最大发射峰为509nm。结论Hela-EGFP细胞株具备稳定表达EGFP的能力,为实时可视化进行宫颈癌侵袭转移机制的研究奠定了基础。
文摘目的:研究重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因转染体外培养的人气道平滑肌(HASMCs)的方法。方法:用组织贴块原代培养传代至3～8代的HASMCs,重组绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection,MOI)转染,荧光显微镜和流式细胞术检测其转染效率,CCK-8法检测其对细胞的毒性。结果:随着MOI增高,转染效率增高。MOI=100时Ad-GFP对HASMCs的感染效率可达(96±0.32)%,以感染后48h达高峰,持续7d仍有绿色荧光表达;转染后的细胞与未转染细胞相比,细胞毒性无统计学差异(P>0.05)。结论:重组腺病毒载体介导的绿色荧光蛋白基因Ad-GFP能高效转染HASMCs,转染后对细胞无毒性,是一种安全的基因载体。
