小鼠H1foo基因四环素诱导表达系统的构建与表达 被引量：1

1

作者 李建 宁静 +2 位作者 陈西锐 宋成艳 雷安民 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期757-762,共6页

卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研... 卵母细胞特异性连接组蛋白H1foo(Linker histone H1foo)是连接组蛋白H1(Histone 1)在卵母细胞中特异性表达的1个亚型,H1foo在卵母细胞减数分裂和成熟发育过程中起着不可替代的作用,而且H1foo也参与了重编程过程。为了在体细胞中进一步研究H1foo的功能,本试验通过采用四环素诱导表达载体系统,用PCR的方法扩增了小鼠的H1foo基因和四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子区。用双酶切和连接等方法将上述元件连接到真核表达载体pVenus上,构建了重组质粒pVenus-tet-CMV-H1foo。双酶切和测序结果显示,片段连接正确,且全长测序正确。本试验所构建的四环素诱导的小鼠H1foo真核表达系统有助于人们在体细胞中更好地探讨H1foo在特定时间的作用和功能。 展开更多

关键词 小鼠 H1foo基因 四环素诱导表达系统

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四环素诱导的YAP1敲减系统的建立及其对胃癌细胞功能的影响 被引量：1

2

作者 王贺 刘俊 +5 位作者 黄硕 丁晓琛 乔一桓 姜勋亮 闫静川 李纪鹏 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2020年第5期690-695,共6页

目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DO... 目的建立一种四环素(tetracycline,DOX)诱导的基因敲减系统,并利用此系统研究YAP1对胃癌细胞功能的影响。方法构建pLKO.1-tetON-YAP1敲减的慢病毒载体,酶切和测序方法检测载体构建成功与否;慢病毒感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,建立DOX诱导的YAP1敲减的胃癌细胞系;RT-PCR检测YAP1 mRNA相对表达量,Western blotting检测YAP1蛋白水平变化;平板克隆实验检测细胞增殖情况;划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移的情况。结果构建四环素诱导的YAP1敲减的病毒质粒,酶切鉴定结果显示,在6000 bp和3000 bp处各有一条带,测序结果与设计的shRNA序列一致。包装慢病毒并感染胃癌细胞系SGC-7901和MKN-28,DOX诱导组中,感染pLKO.1-tetON-YAP1的病毒的细胞中YAP1 mRNA的相对表达量和蛋白水平明显下调;而未诱导组则无明显变化。平板克隆形成实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组克隆形成数明显降低;未诱导组无明显变化。划痕实验和Transwell迁移实验结果显示,DOX诱导后shYAP1组表达后细胞迁移能力受到抑制,未诱导组无明显变化。结论成功建立了四环素诱导的慢病毒系统,利用此系统敲减胃癌细胞YAP1基因,胃癌细胞增殖和迁移能力受到抑制。 展开更多

关键词 四环素诱导表达系统 SHRNA 胃癌 YAP1基因 增殖 迁移

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人端粒酶hTERT可诱导RNAi系统的建立及其对TREx-HeLa细胞生长的影响 被引量：4

3

作者 柏芸 杜贻鹏 +5 位作者 骆晓枫 米洋 袁广卿 何霞 陈展辉 周俊宜 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期537-542,共6页

目的:建立可诱导性沉默hTERT的RNA干扰系统,并初步探讨端粒酶与细胞增殖调控之间的关系。方法:构建沉默端粒酶催化亚基hTERT的Tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA,并稳定转染表达TR的TREx-HeLa细胞,用半定量RT-PCR检测hTER... 目的:建立可诱导性沉默hTERT的RNA干扰系统,并初步探讨端粒酶与细胞增殖调控之间的关系。方法:构建沉默端粒酶催化亚基hTERT的Tet-on可诱导性RNAi载体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA,并稳定转染表达TR的TREx-HeLa细胞,用半定量RT-PCR检测hTERT的转录后水平,TRAP法检测端粒酶活性。MTT法检测细胞的增殖,流式细胞仪和Hoechst33342染色法观察细胞凋亡。结果:构建了可诱导性沉默端粒酶催化亚基hTERT的重组体psiRNA-hH1/TO-hTERTshRNA,并建立了可诱导性沉默hTERT的TREx-HeLa细胞株。短期内的端粒酶活性降低后TREx-HeLa细胞生长增殖有下降趋势,而其凋亡情况则未见明显变化。结论:本研究建立了可诱导沉默hTERT的RNAi系统,为研究端粒酶活性与细胞增殖和衰老的关系提供了实验基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 四环素可诱导rnai系统 端粒 末端转移酶 细胞凋亡 TREx—HeLa细胞

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四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白转基因斑马鱼模型建立 被引量：4

4

作者 张力 刘超 +3 位作者 周昕 谢英 刘树锋 徐增年 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期81-85,共5页

目的探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法构建肝脏特异启动子fabp10启动rt... 目的探索tet-on四环素诱导表达系统在斑马鱼体内应用策略与技术路线,构建四环素诱导肝脏特异表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼,为条件型功能基因研究及组织特异转基因斑马鱼疾病模型的建立奠定基础。方法构建肝脏特异启动子fabp10启动rt TA蛋白表达的重组质粒pfabp10-rt TA,联合p TRE-Tight-BI-Ac GFP1质粒转染He La细胞后给予doxycycline诱导,Western blot法验证;pfabp10-rt TA联合p TRE-Tight-BI-Ac GFP1质粒注射斑马鱼1-细胞期受精卵后,30μg/m L doxycycline诱导,荧光筛选稳定整合个体。结果共转染pfabp10-rt TA与p TRE-Tight-BI-Ac GFP1的He La细胞经1μg/m L浓度doxycycline诱导培养液诱导,GFP表达量显著高于不加doxycycline培养液对照组;筛选获得的稳定整合斑马鱼幼鱼,在浓度为30μg/m L doxycycline条件下,肝脏明显有绿色荧光表达,对照组幼鱼肝脏位置未有明显绿色荧光。结论 Tet-On四环素诱导表达系统可用于建立四环素调控斑马鱼肝脏特异表达外源基因;利用该技术可建立诱导肝脏表达GFP建立转基因斑马鱼品系,为建立条件型转基因斑马鱼疾病模型、探索肝脏器官发生发育等研究提供良好的模式动物工具。 展开更多

关键词 斑马鱼 四环素诱导系统 肝脏 绿色荧光蛋白

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四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建 被引量：3

5

作者 解宇 汪亮 +2 位作者 张冬杰 刘娣 孙亚蒙 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第1期13-16,共4页

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导... 猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcD-NA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-PTight-MC4R真核表达载体,并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。 展开更多

关键词 猪 MC4R基因 四环素诱导表达系统

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光诱导RNAi系统的构建及优化

6

作者 王建华 王雪 +2 位作者 杜增民 赵玉政 杨弋 《华东理工大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期28-33,共6页

利用光诱导基因表达系统,构建光诱导RNAi系统,并对系统转染比例、转录因子的表达量和shRNAmir表达载体的核心启动子进行优化。通过构建不同启动子的光敏转录因子GAVPO表达载体和不同核心启动子的shRNAmir表达载体,分析它们对报告基因的... 利用光诱导基因表达系统,构建光诱导RNAi系统,并对系统转染比例、转录因子的表达量和shRNAmir表达载体的核心启动子进行优化。通过构建不同启动子的光敏转录因子GAVPO表达载体和不同核心启动子的shRNAmir表达载体,分析它们对报告基因的干扰效果的影响。结果表明,GAVPO的表达量对报告基因沉默效果和shRNAmir的背景表达水平至关重要。低表达量的GAVPO能够实现对报告基因的微调控,报告基因的表达量下降到约60%;而高表达量的GAVPO能够高效抑制报告基因表达,报告基因的表达量下降到34%。 展开更多

关键词 rnai 光诱导基因表达系统 shRNAmir 萤火虫荧光素酶

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在四环素调控系统下表达HA蛋白MDCK细胞系的建立

7

作者 于海龙 许榜丰 +9 位作者 石晓娜 马天馨 闫婉婉 李雪松 杨健美 滕巧泱 刘芹防 苑纯秀 赵权 李泽君 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2021年第5期13-18,共6页

细胞培养流感病毒生产疫苗过程中细胞系的选择至关重要,本研究建立了可控表达H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白的MDCK细胞系,能有效支持H9N2流感病毒的扩增。本研究应用插入四环素调控元件和H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组质粒V2-H9,与... 细胞培养流感病毒生产疫苗过程中细胞系的选择至关重要,本研究建立了可控表达H9N2亚型禽流感病毒(AIV)HA蛋白的MDCK细胞系,能有效支持H9N2流感病毒的扩增。本研究应用插入四环素调控元件和H9N2亚型禽流感病毒HA基因的重组质粒V2-H9,与辅助质粒pMDSV、psPAX2共转染293T细胞包装慢病毒,将包装出的慢病毒感染MDCK细胞,通过添加嘌呤霉素筛选出阳性的单克隆细胞。再用PR8 SH441病毒感染筛选出来的MDCK单克隆细胞。结果显示,流感病毒在其中4株MDCK单克隆细胞的HA效价接近于8;生长曲线结果显示,流感病毒在第34株MDCK单克隆细胞中复制效果最好;间接免疫荧光(IFA)和Western blot检验结果显示,第34株MDCK单克隆细胞H9 HA的表达量最高;将第34株MDCK单克隆细胞驯化后进行悬浮培养,每隔24 h测定细胞密度,结果表明,第34株MDCK单克隆细胞可以悬浮培养,且流感病毒在第34株MDCK悬浮细胞中HA效价可达9log2。以上结果表明,本研究获得了一株可高效扩增H9亚型禽流感病毒的MDCK细胞株,为流感弱毒疫苗的研发提供了新的研究方法和实验基础。 展开更多

关键词 流感病毒 四环素调控系统 HA基因 诱导表达

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单质粒模式诱导表达载体系统的建立 被引量：2

8

作者 刘定燮 周晓巍 黄培堂 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第5期824-825,共2页

在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 ... 在Invitrogen公司T Rex诱导表达系统的基础上,将目的基因与调控蛋白基因克隆于同一载体上,并在CV1细胞中观察了四环素对该单质粒模式载体报告基因表达的诱导效应.载体在瞬时转染CV1细胞并以四环素诱导 2 4h后目的基因的表达水平提高了 8 9倍。 展开更多

关键词 单质粒模式 诱导表达 载体系统 四环素

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诱导型eIF3g人工microRNA表达载体的构建及应用 被引量：4

9

作者 褚丽莎 韩娜 +1 位作者 宋向阳 曹江 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期135-138,共4页

目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRev... 目的:构建可用四环素调控的针对人eIF3g的人工microRNA表达载体,用于抑制肿瘤细胞中eIF3g的表达。方法:利用网络资源设计针对人eIF3g的人工microRNA,以PCR方法克隆,经DNA测序验证后亚克隆至四环素调控表达系统的pRevTRE2载体上,得到pRevTRE2-eIF3g-microRNA。将四环素调控表达系统的Tet-off质粒转染K562细胞获得稳定转染克隆后,再利用带有报告基因GFP的pRevTRE2-GFP转染选择调控能力较好的K562/Tet-off细胞株,将pRevTRE2-eIF3g-microRNA转染K562/Tet-off细胞,Westernblot检测eIF3g的表达,以研究eIF3g人工microRNA的作用效果。结果:DNA测序结果显示,针对人eIF3g的人工microRNA的克隆正确。pRevTRE2-GFP转染结果表明所选择的K562/Tet-off细胞株有较好的诱导功能。Westernblot结果显示,转染pRevTRE2-eIF3g-microRNA的K562/Tet-off细胞可用四环素调控eIF3g人工microRNA的表达从而抑制K562细胞中eIF3g的表达。结论:成功构建了可用四环素调控的eIF3g人工mi-croRNA表达载体,能有效调控K562细胞中eIF3g的表达。 展开更多

关键词 eIF3g MICRORNA 四环素诱导表达系统

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建立可诱导表达TNFAIP1的稳定细胞系 被引量：1

10

作者 李红 贺志成 +1 位作者 刘倩 周建林 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2008年第2期96-99,共4页

利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞... 利用Tet-Off可诱导表达系统在HT1080细胞中建立可诱导表达TNFAIP1基因的稳定细胞系.首先将融合表达GFP的TNFAIP1片段克隆到反应质粒pTRE2hyg中,然后将该质粒转染到HT1080/Tet-off细胞中,使用潮霉素B筛选,挑取单克隆,得到稳定转染的细胞系,扩大培养后在荧光显微镜下观察克隆的诱导效率,得到了低背景,高效诱导表达GFP-TNFAIP1的稳定细胞系,便于研究TNFAIP1在细胞生长、细胞周期和细胞信号通路等方面的作用. 展开更多

关键词 TNFAIP1 四环素调控系统 诱导表达

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tTS/rtTA系统下调目的基因基础表达的细胞模型研究 被引量：2

11

作者 张若霜 帅丽芳 +1 位作者 赵勇 陈系古 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期361-364,共4页

【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7... 【目的】构建带有肝脏特异性启动子和tTS沉默子的四环素调控系统,观察其在人HepG2细胞内的表达,建立严密型四环素调控系统的HepG2细胞模型。【方法】通过二次分子克隆构建重组真核表达质粒载体pliv7-rtTA-tTS-Neo,用脂质体法将质粒pliv7-rtTA-tTS-Neo及pliv7-rtTA-Neo转染人HepG2细胞,经G418筛选后的克隆用有限稀释法进行单克隆化,克隆扩增后瞬时转染pTRE-Luc质粒,强力霉素(1mg/L)诱导表达后检测荧光素酶活性,挑选出低背景和高诱导表达的HepG2细胞克隆。【结果】带有tTS的细胞株其诱导倍数明显高于不带有tTS的细胞株(192︰21),其中克隆9的诱导倍数最高(256),获得1株高表达、低背景的HepG2/pLiv7-rtTA-tTS-Neo细胞株。【结论】荧光素酶活性检测结果验证了tTS对四环素调控系统的内在泄露问题有一定的抑制作用,使四环素调控系统的开关具有真正意义上的严密性。 展开更多

关键词 四环素调控系统 tTS沉默子 诱导表达 HEPG2细胞

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细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))在MCF7细胞中的可诱导表达并引起F-actin的重分布 被引量：2

12

作者 梁剑青 王嫚娜 +6 位作者 张峥嵘 袁龙 郑幽 黄红艳 孙强 王菊芳 王小宁 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期465-470,共6页

目的使用四环素操纵子(Tet-on)可控表达系统研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))对MCF7乳腺癌细胞形态及细胞骨架的影响。方法以p16^(INK4a)表达缺失的MCF7乳腺癌细胞为宿主细胞,用慢病毒通过"两步感染法&qu... 目的使用四环素操纵子(Tet-on)可控表达系统研究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A(CDKN2A/p16^(INK4a))对MCF7乳腺癌细胞形态及细胞骨架的影响。方法以p16^(INK4a)表达缺失的MCF7乳腺癌细胞为宿主细胞,用慢病毒通过"两步感染法"建立MCF7-p Tet-on-p16^(INK4a)可诱导表达细胞系,加入诱导剂强力霉素(Dox)诱导目的基因表达;细胞计数检测细胞生长变化;采用免疫细胞化学染色检测上皮钙黏素(E-cadherin)表达,采用鬼笔环肽(phalloidin)标记纤维型肌动蛋白(F-actin),观察p16^(INK4a)对细胞间黏附连接、细胞骨架的影响;用显微镜对细胞拍照后,用Image J软件进行形态分析。结果成功建立了可诱导表达p16^(INK4a)的MCF7稳定细胞系,Dox可以有效诱导p16^(INK4a)的表达;诱导条件下稳定表达p16^(INK4a)的MCF7细胞增殖受抑制,细胞体积增大,轮廓线延长;而对照MCF7细胞F-actin主要定位于胞质,p16^(INK4a)表达的细胞内F-actin向细胞边缘分布增加。结论 p16^(INK4a)在MCF7细胞中的表达可以导致细胞体积增大、细胞间黏附连接弱化、F-actin向细胞外周重新分布。 展开更多

关键词 P16INK4A 四环素操纵(Tet—on)可诱导系统 细胞骨架 F-ACTIN

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慢病毒介导KIF4A稳定诱导敲降MCF7细胞株的建立

13

作者 闫鲁霞 程蓓蓓 +1 位作者 周之春 朱长军 《天津师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2022年第3期55-59,67,共6页

为了构建驱动蛋白KIF4A基因稳定诱导敲降细胞株Tet-shKIF4A/MCF7,应用Tet诱导基因敲降慢病毒载体系统,将慢病毒载体质粒Tet-plko-puro-shKIF4A与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293T细胞中,产生慢病毒颗粒.使用慢病毒感染MCF7细胞,用嘌... 为了构建驱动蛋白KIF4A基因稳定诱导敲降细胞株Tet-shKIF4A/MCF7,应用Tet诱导基因敲降慢病毒载体系统,将慢病毒载体质粒Tet-plko-puro-shKIF4A与包装质粒psPAX2和pMD2.G共转染至293T细胞中,产生慢病毒颗粒.使用慢病毒感染MCF7细胞,用嘌呤霉素筛选出稳定诱导敲降KIF4A细胞株Tet-shKIF4A/MCF7.通过免疫印迹方法检测Tet-shKIF4A/MCF7细胞中KIF4A蛋白的表达水平,对诱导敲降KIF4A的四环素药物的浓度和敲降时间进行优化.应用免疫荧光染色的方法检测对照细胞和Tet-shKIF4A/MCF7细胞内的KIF4A的表达以及有丝分裂细胞形态的变化.结果表明,本研究成功构建了KIF4A基因稳定诱导敲降细胞株Tet-shKIF4A/MCF7,诱导敲降KIF4A的四环素药物最佳质量浓度为50μg/mL,最佳诱导时间为36 h.本研究为深入探究KIF4A在细胞生命活动中的功能以及细胞周期的分子作用机制提供了重要实验材料. 展开更多

关键词 慢病毒 KIF4A 四环素诱导敲降系统 MCF7细胞株

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TRAIL基因对人白血病Jurkat细胞生物力学特性的影响 被引量：4

14

作者 李丹 周淑佩 +5 位作者 陈凯 姚伟娟 谢利德 顾黎 王新娟 文宗曜 《中国生物医学工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期268-274,共7页

本实验研究将人类肿瘤坏死因子相关凋亡配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand)的cDNA序列作为目的基因导入RevTet On后 ,利用在Jurkat中所建立起的四环素调控TRAIL基因表达系统 ,作为研究肿瘤细胞凋亡前后生物流变学特性变化的细... 本实验研究将人类肿瘤坏死因子相关凋亡配体 (TNF relatedapoptosisinducingligand)的cDNA序列作为目的基因导入RevTet On后 ,利用在Jurkat中所建立起的四环素调控TRAIL基因表达系统 ,作为研究肿瘤细胞凋亡前后生物流变学特性变化的细胞模型。我们通过测量用强力霉素诱导TRAIL基因表达前后细胞生物力学特性的变化 ,研究TRAIL基因对Jurkat细胞生物力学特性的影响。结果显示TRAIL基因的表达对Jurkat细胞有明显的促凋亡作用。TRAIL基因表达后 ,细胞表面电荷密度减少 ,流动性下降。而且 ,本实验表明 。 展开更多

关键词 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 四环素基因调控系统 JURKAT 凋亡 生物流变学 人白血病Jurkat细胞

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稳定整合pTet-on载体小鼠胚胎干细胞株的建立 被引量：2

15

作者 张梅英 李华 +8 位作者 董婉维 杨葳 秦英 汪瑛 周生来 于洋 王惟 王太一 王禄增 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2006年第3期161-166,F0011,共7页

目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PC... 目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PCR和Southern blot方法进行DNA整合鉴定,并用瞬时转染荧光素酶报告基因(pTRE-Luc)对筛选的Tet-on阳性克隆株的功能进行鉴定。结果经400μg/mL的G418压力筛选后,获得了11个细胞克隆株,特异性核苷酸引物检测细胞基因组DNA,有9个ES-D3细胞株可以扩增出相应的核苷酸片段,部分Tet-on阳性ES-D3株Southern blot鉴定结果表明Tet-on基因片段已整合入ES-D3细胞基因组DNA,荧光素酶报告基因功能鉴定获得1株诱导表达倍率为21.31的ES-D3细胞株,且Tet-on基因阳性ES-D3细胞的形态和生长速度与正常ES-D3细胞没有差异。结论通过电穿孔转染的方法成功地获得1株诱导表达倍率为21.31的高表达ES-D3细胞株,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中转染和诱导表达打下了基础。 展开更多

关键词 四环素诱导表达系统 电穿孔 ES-D3 细胞

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时空表达可控的转基因动物模型调控体系的研究 被引量：3

16

作者 孙敬方 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2005年第2期72-75,F008,共5页

目的在血管内皮细胞建立时空表达可控的转基因动物模型调控体系。方法培育两个配套的转基因动物品系,利用组织专一性启动子确保转基因表达的空间专一性,利用四环素诱导系统对转基因表达在时间上实施调控。结果将血管内皮细胞特异性表达... 目的在血管内皮细胞建立时空表达可控的转基因动物模型调控体系。方法培育两个配套的转基因动物品系,利用组织专一性启动子确保转基因表达的空间专一性,利用四环素诱导系统对转基因表达在时间上实施调控。结果将血管内皮细胞特异性表达的VE cadherin基因启动子与人工融合的转录因子tTA基因连接,建立转基因小鼠品系VE cadherin:tTA;将tetoperon的启动子与myrAkt1连接,建立转基因小鼠品系TET:myrAkt1。两系鼠杂交的子代,筛选的阳性纯合子,能可控性地在血管内皮细胞特异性表达目的基因Akt1PKB。结论利用VE cadherin基因启动子和tet off诱导表达系统,可以达到在时间上和空间上都能人为控制目的基因在血管内皮细胞上特异性表达的目的。 展开更多

关键词 转基因动物模型 调控体系 时空表达 血管内皮细胞 特异性表达 转基因表达 基因启动子 小鼠品系 目的基因 诱导系统 转录因子 表达系统 人为控制 专一性 TTA 四环素 TET TET 纯合子 可控性 和空间 时间 连接

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