在PCR-DGGE研究土壤微生物多样性中应用GC发卡结构的效应 被引量：42

1

作者 罗海峰 齐鸿雁 +3 位作者 薛凯 王晓谊 王川 张洪勋 《生态学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第10期2170-2175,共6页

应用普通细胞裂解法提取 3株实验菌株 (Escherichia coli DH5α,Staphylococcus aureus SA- 1和 A-grobacterium tumerfaciens 1 31 2 9)的基因组 DNA和应用基于高盐和长时高热的细胞裂解法提取 7种不同土壤样品中的微生物的基因组 DNA... 应用普通细胞裂解法提取 3株实验菌株 (Escherichia coli DH5α,Staphylococcus aureus SA- 1和 A-grobacterium tumerfaciens 1 31 2 9)的基因组 DNA和应用基于高盐和长时高热的细胞裂解法提取 7种不同土壤样品中的微生物的基因组 DNA,两组不同结构的引物 F3 57GC,R51 8(在正向引物的 5′端有 GC发卡结构 )和 F3 57,R51 8,分别对实验菌株和土壤样品中微生物的 1 6Sr RNA基因 V3区进行扩增 ,均得到了目的片段。比较了不同引物扩增的 1 6S r DNA片段在 DGGE中的不同电泳行为 ,结果表明 ,含 GC发卡结构的PCR扩增产物在 DGGE中能够得到很好的分离 ,而无 GC发卡结构的 PCR产物则不能在 DGGE中获得满意分离。引入 GC发卡结构 。 展开更多

关键词 PCR—DGGE 微生物多样性 GC发卡结构

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特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响 被引量：3

2

作者 梁华晟 薛耀明 钟宇华 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期2093-2096,共4页

目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pS... 目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期。结果菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确。并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因。细胞周期检测提示PTH1R沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期。结论成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。 展开更多

关键词 甲状旁腺激素受体1基因 小干扰RNA 小发卡结构RNA 转染 RNA干扰 细胞周期

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T-bet基因shRNA真核表达载体的构建及其功能的初步研究 被引量：1

3

作者 薛渊 王胜军 +6 位作者 何志强 石燕 周成林 马洁 仝佳 邵启祥 许化溪 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期453-455,共3页

目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础。方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染... 目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础。方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染后DC2.4细胞增殖能力,用RealtimePCR和Westernblot分别从基因及蛋白水平检测转染前后DC2.4细胞T-bet表达水平变化;RealtimePCR检测IFN-γ的mRNA;流式细胞术(FCM)检测细胞表面CD80、CD86与MHCⅡ类分子表达情况。结果:构建的T-bet靶向shRNA真核表达载体,能够显著抑制DC2.4细胞T-bet的表达,且转染后DC2.4细胞增殖受到抑制,CD80、CD86及MHCⅡ类分子表达下调,IFN-γmRNA水平显著下降。结论:成功地构建了T-betshRNA真核表达载体,转染DC2.4细胞后能有效地抑制其T-bet、IFN-γ的表达,影响其抗原提呈功能。 展开更多

关键词 T-BET 小发卡结构RNA 真核表达 树突状细胞

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靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义 被引量：2

4

作者 崔玉霞 王萍玲 +1 位作者 周娟 杨锡强 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2006年第1期1-4,54,共5页

目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因m RNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M 2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重... 目的:构建针对呼吸道合胞病毒(RSV)M2基因m RNA的短发卡结构状RNA(shRNA)重组载体质粒,为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础;方法:按shRNA设计原则,选择RSV-M 2基因作为靶基因,设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列,中间以9bp序列间隔,经退火形成互补双链,克隆至转录载体pgenesil-1上,重组质粒经酶切和测序鉴定,然后将构建成功的重组质粒转染H EP2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果:将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上,经酶切及序列鉴定为目的序列,并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论:成功构建了针对RSV M 2基因m RNA的shRNA重组载体质粒,可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制,从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。 展开更多

关键词 呼吸道合胞病毒 M2基因 短发卡结构状RNA 重组质粒

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shRNA干扰HERG钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤

5

作者 贾勇圣 赵杰 +4 位作者 魏晓莉 靳庆娥 郑建全 李昕 闫海涛 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第2期126-131,共6页

目的:探讨发卡结构小片段RNA(small hairpin interfering RNA,shRNA)干扰人ERG(human ether-α-go-go-related gene,HERG)钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤的疗效和作用机制。方法:用真核转录载体mU6pro构建针对herg基因的发卡状RN... 目的:探讨发卡结构小片段RNA(small hairpin interfering RNA,shRNA)干扰人ERG(human ether-α-go-go-related gene,HERG)钾通道治疗裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤的疗效和作用机制。方法:用真核转录载体mU6pro构建针对herg基因的发卡状RNA干扰质粒(shRNA-herg)。18只BALB/c裸小鼠皮下接种成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立裸鼠皮下人成神经细胞移植瘤模型,当瘤体积达到100mm3时随机分成3组,分别为生理盐水组(Ⅰ)、对照质粒组(Ⅱ)、干扰质粒组(Ⅲ)。各组瘤内分别注射生理盐水、对照质粒、干扰质粒,以后每7d注射1次,连续15d。观察各组肿瘤生长情况,RT-PCR测定肿瘤组织herg基因mRNA含量变化,免疫组化检测肿瘤组织中HERG钾通道蛋白变化。结果:经治疗后,第Ⅲ组肿瘤生长受到明显抑制,Ⅱ、Ⅲ组抑瘤率分别为3.04%和29.78%(P<0.05)。肿瘤组织内herg基因mRNA含量、HERG钾通道蛋白,Ⅲ组较Ⅰ、Ⅱ组表达减弱。结论:构建的shRNA干扰质粒可通过靶向性抑制herg基因及其编码的HERG钾通道蛋白的表达,有效地抑制人成神经细胞瘤的生长。 展开更多

关键词 发卡结构小片段RNA HERG钾通道 成神经细胞瘤 RNA干扰

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NTE基因ShRNA慢病毒载体的构建与鉴定

6

作者 张银花 李秋明 +1 位作者 孙英健 沈红 《北京农学院学报》 2017年第2期6-9,共4页

【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜... 【目的】构建神经病靶酯酶(NTE)蛋白低表达的ShRNA重组慢病毒表达系统。【方法】依照ShRNA序列设计原则设计带酶切位点的NTE ShRNA序列,与表达载体pLL3.7连接构建NTE ShRNA重组表达质粒,转染DH5α菌观察重组表达状况,与pCVM-VSV-G包膜质粒和pCMV-dr8.2dvpr表达质粒共转染293T细胞,包装得到重组慢病毒。用病毒稀释法以绿色荧光蛋白(GFP)为标记,确定转染效率及病毒含量。【结果】经酶切及测序鉴定结果显示成功构建pLL3.7-NTE ShRNA慢病毒载体。重组慢病毒质粒与辅助质粒共转染293T细胞后获得高表达的细胞,共转染48h后,收集病毒液检测病毒滴度达4.5×10~4/mL。【结论】成功构建NTE ShRNA慢病毒重组表达系统。 展开更多

关键词 pLL3.7 慢病毒载体 短发卡结构RNA NTE

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利用荧光寿命变化定量分子内和分子间相互作用的方法

7

作者 王文娟 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2021年第11期1358-1364,共7页

荧光寿命是指荧光分子在回到基态前在激发态停留的平均时间.本文发展了基于荧光寿命测量来定量分子内和分子间相互作用的方法:通过G碱基猝灭对于荧光寿命的影响定量DNA二级结构的形成;通过荧光共振能量传递(FRET)中荧光寿命的变化来定... 荧光寿命是指荧光分子在回到基态前在激发态停留的平均时间.本文发展了基于荧光寿命测量来定量分子内和分子间相互作用的方法:通过G碱基猝灭对于荧光寿命的影响定量DNA二级结构的形成;通过荧光共振能量传递(FRET)中荧光寿命的变化来定量分子间的相互作用.第一种方法巧妙利用了G碱基会猝灭临近的染料分子的性质,结合荧光寿命的变化,可以判断DNA二级结构的形成以及形成的比率.FRET是用于研究生物分子相互作用的一个重要手段.传统的FRET方法主要是基于强度的变化,但这种变化容易受到荧光表达水平变动、样品中分子扩散以及荧光串色的影响,因此经常存在着实验比较复杂和重复性差的问题.而基于荧光寿命的FRET研究则可以很好地克服上述缺点.通过检测供体荧光寿命的变化,我们能够方便快捷地判断是否发生FRET,并通过建立系统的数据分析方法,得到FRET的效率以及分子之间相互作用的信息. 展开更多

关键词 荧光寿命 荧光猝灭 G碱基猝灭 荧光共振能量传递 荧光衰减曲线 分子内相互作用 分子间相互作用 发卡结构 时间相关单光子计数

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Thermus aquaticus DNA连接酶的连接特性研究 被引量：3

8

作者 于欣 王静 +1 位作者 安然 梁兴国 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期50-55,共6页

为进一步研究Thermus aquaticus（Taq）DNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术,本文以含有超稳定发卡结构的DNA（带有11nt长的单链部分）和另一条单链DNA为连接底物,研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特... 为进一步研究Thermus aquaticus（Taq）DNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术,本文以含有超稳定发卡结构的DNA（带有11nt长的单链部分）和另一条单链DNA为连接底物,研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）的添加等对连接的影响,探讨了Taq DNA连接酶的连接特性。连接结果显示：单链DNA的3’端同发卡结构I底物相连的连接率,比单链DNA的5’端同发卡结构II底物相连的连接率更高;可以连接的最短单链DNA片段的长度为6nt;在20～65℃范围内,一般连接率随温度升高而升高。在连接时,由2条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率影响不大,一般在连接温度远远高于该复合体的熔点（Melting Temperature,Tm）时仍有很高的连接率。在70或75℃时,虽然连接率有所降低,但仍然可以连接9nt的单链DNA片段。研究还发现,在片段连接上,PEG 6000对较难连接的片段（6～7nt）有促进作用,对容易连接的片段（8～10nt）促进作用不显著,甚至有一定抑制作用。 展开更多

关键词 TAQ DNA连接酶 发卡结构 短片段

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反向重复序列DNA的PCR扩增特性研究 被引量：2

9

作者 李春川 潘孝明 +3 位作者 王静 董平 李敬 梁兴国 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期180-188,共9页

旨在研究反向重复序列形成的发卡结构对模板扩增的影响。研究DNA发卡结构中环部大小、茎部长度、引物相对于茎部位置等对PCR扩增效率的影响,探讨如何通过引物设计及改变退火温度等条件来实现发卡结构DNA的有效扩增的方法。结果显示,如... 旨在研究反向重复序列形成的发卡结构对模板扩增的影响。研究DNA发卡结构中环部大小、茎部长度、引物相对于茎部位置等对PCR扩增效率的影响,探讨如何通过引物设计及改变退火温度等条件来实现发卡结构DNA的有效扩增的方法。结果显示,如果引物的位置同发卡结构茎部5'序列相同或部分相同,则由于发卡结构的形成阻碍引物与模板结合而对PCR产生抑制作用,并且抑制作用随着茎部长度的增加而增强;当环部的长度达到50 nt以上时,抑制作用明显减弱。较高的退火温度和引物浓度都有助于引物同分子内形成发卡结构的竞争,使PCR扩增更容易进行。 展开更多

关键词 发卡结构 PCR扩增 反向重复序列

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高灵敏靶标自环化滚环扩增检测的动态接头构建

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作者 王晨儒 安然 梁兴国 《中国海洋大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期41-48,共8页

针对靶标自环化滚环扩增(TC-RCA)难以高灵敏度检测的难题,本文探究了扩增过程中靶标环化效率低的原因,并构建了新型动态接头以提高靶标DNA的环化灵敏度。通过采用含有发卡结构的动态接头(18 nt),使接头的两端产生连接活性差异,探讨发卡... 针对靶标自环化滚环扩增(TC-RCA)难以高灵敏度检测的难题,本文探究了扩增过程中靶标环化效率低的原因,并构建了新型动态接头以提高靶标DNA的环化灵敏度。通过采用含有发卡结构的动态接头(18 nt),使接头的两端产生连接活性差异,探讨发卡接头打开与闭合的动态平衡在提高环化灵敏度中的作用。具体研究了发卡动态接头的稳定性和磷酸化对连接及环化效率的影响。研究表明,增加接头两端的连接活性差异可提高环化灵敏度(106 copies/μL),从而揭示了TC-RCA灵敏度低的根本原因。由于许多过量的接头同时连接到靶标DNA两端后,靶标无法环化,造成仅有少部分靶标环化为RCA模板,导致极低浓度的靶标无法发生RCA。在此基础上,采用另一种10 nt的短链动态接头,使检测灵敏度提高了两个数量级(达104 copies/μL)。本研究为TC-RCA中接头的设计提供了新思路,对双链DNA环化机理的深入研究具有重要意义。 展开更多

关键词 滚环扩增 发卡结构 DNA环化 核酸检测 接头

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淋巴因子和干扰素

11

《生物技术通报》 CAS CSCD 1990年第11期70-71,共2页

903062 多向同时突变在获得猪α干扰素基因中的应用[俄]/Chernov,I.P.…//Bioorg.Khim.-1989,15(12).-1686～1689[译自 DBA,1990,9(5),90-02567]采用多向同时突变,将人α2干扰素转换成猪α2干扰素基因(两者有80.4%的同源性).方法是:(1)

关键词 淋巴因子 基因克隆 同源性 DNA 核昔酸 发卡结构 启动区 巴斯德毕赤酵母 限制性内切酶 转录子

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