背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵...背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。展开更多
目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL...目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL-TK共转染Hep G2细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575,P<0.001),且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218,P<0.001),而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件,该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。展开更多
构建psi-CHECK2双荧光素酶报告基因载体,验证褐飞虱Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因(coiledcoil domain-containing protein 124-like)表达的影响。首先设计合成包含与Nlu-miRNA-8结合序列的Ccdc124基因片段,构建双荧光素酶报告基因载体,转染...构建psi-CHECK2双荧光素酶报告基因载体,验证褐飞虱Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因(coiledcoil domain-containing protein 124-like)表达的影响。首先设计合成包含与Nlu-miRNA-8结合序列的Ccdc124基因片段,构建双荧光素酶报告基因载体,转染果蝇S2细胞,通过荧光素酶活性变化观察NlumiRNA-8对Ccdc124表达的影响。结果发现,nlu-miRNA-8对Ccdc124组的荧光表达有非常显著的抑制作用,而对空白对照、阴性对照组的荧光表达没有显著的抑制作用。研究成功构建了psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体,并初步证实Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因有调控作用。展开更多
文摘背景与目的:活体动物体内光学成像(optical in vivo imaging)主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是用荧光素酶(luciferase,Luc)基因标记细胞或DNA,而荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP、Cyt及dyes等)进行标记,利用一套非常灵敏的光学检测仪器,能够直接监控活体生物体内的细胞活动和基因行为,生物发光成像具有高的灵敏度和特异性,同时生物发光信号可用于精确定量,而荧光成像具有方便、便宜、直观、标记靶点多样和易于被大多数研究人员接受的优点。本研究基于慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)和Luc双报告基因转基因小鼠(即RL转基因小鼠),将这两种技术融为一体。方法:制备携带RFP和Luc基因(简写RL基因)的慢病毒,然后将携带RL基因的慢病毒注入小鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔鼠,应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等在蛋白和DNA水平上筛选和鉴定,并获得RL转基因小鼠。结果:移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎125枚给6只假孕母鼠,其中4只假孕母鼠怀孕,共生仔鼠20只;利用小动物活体成像仪检测RFP和Luc表达,在蛋白水平证实20只F0代中,3只高表达RFP和Luc;DNA水平检测证实,3只RFP和Luc阳性的小鼠基因组中确实整合有外源转基因RL,预示基因型鉴定结果很好验证了小动物活体成像仪筛选和鉴定结果。此外,RL转基因首建鼠基因组中整合的RL转基因可稳定遗传至下一代,并能正常表达。RL转基因小鼠主要脏器均可见红色荧光和Luc信号,但不同脏器间荧光和Luc强度有差异。结论:成功制备RL双报告基因转基因小鼠,为后续研究干细胞在肿瘤发生、发展和转移中的作用和造血重构等提供双报告基因标记的各种移植用供体细胞,并对此供体细胞及其在体内衍生的细胞进行灵敏的非损伤、实时可视化体内跟踪。
文摘目的:探讨CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达的负调控作用。方法:设计合成包含CYP3A4*1G G或A等位基因的一系列基因片段(外显子10与内含子10交界处287和181 bp),构建CYP3A4*1G正向位于CYP3A4启动子上游的荧光素酶报告基因载体,与内参质粒pRL-TK共转染Hep G2细胞,通过双荧光素酶报告基因系统检测荧光素酶活性。结果:与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在287 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=795.575,P<0.001),且G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。与CYP3A4启动子相比较,G与A等位基因在181 bp DNA片段中均降低了荧光素酶表达(F=23.218,P<0.001),而G与A等位基因对CYP3A4启动子活性的抑制程度比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在CYP3A4内含子10与外显子10交界处CYP3A4*1G存在与CYP3A4*1G变异无关的CYP3A4启动子的抑制元件,该抑制元件对CYP3A4*1G增强CYP3A4基因表达起负调控作用。
文摘构建psi-CHECK2双荧光素酶报告基因载体,验证褐飞虱Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因(coiledcoil domain-containing protein 124-like)表达的影响。首先设计合成包含与Nlu-miRNA-8结合序列的Ccdc124基因片段,构建双荧光素酶报告基因载体,转染果蝇S2细胞,通过荧光素酶活性变化观察NlumiRNA-8对Ccdc124表达的影响。结果发现,nlu-miRNA-8对Ccdc124组的荧光表达有非常显著的抑制作用,而对空白对照、阴性对照组的荧光表达没有显著的抑制作用。研究成功构建了psi-CHECK2/Ccdc1243′UTR载体,并初步证实Nlu-miRNA-8对Ccdc124基因有调控作用。
