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应用两步氯化钙转化法高效制备双自杀基因重组腺病毒 被引量：3
1
作者 郑权 黄宗海 +2 位作者 汤福祥 黄媛媛 车小燕 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第6期575-577,共3页
目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法应用PCR扩增出CD和TK基因,经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK,经酶切线性化后,转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病... 目的构建巨细胞病毒(CMV)启动子驱动下的双自杀基因重组腺病毒。方法应用PCR扩增出CD和TK基因,经适当改造后插入pAdtrack CMV中构建成转移质粒pAdtrack CMV-CDTK,经酶切线性化后,转化用氯化钙制备的感受态AdEasier-1细菌,获得重组腺病毒质粒。最后将线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞包装获得重组腺病毒,滴度测定后,体外感染血管内皮细胞ECV304。结果PCR检测表明已成功构建了含CD、TK融合基因的重组腺病毒,为进一步开展肿瘤的双自杀基因治疗研究奠定了基础。结论应用改进后的AdEasy系统构建腺病毒相比于传统AdEasy系统,方法更简便、成功率更高、实验周期更短。 展开更多
关键词 两步氯化钙转化法 制备 双自杀基因重组腺病毒 基因治疗
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CD/TK单、双自杀基因重组腺病毒的制备及初步应用 被引量：1
2
作者 曹慧青 赵勇 +3 位作者 孟宪敏 赵秀文 刘冬青 丁金凤 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期698-703,共6页
为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺... 为制备表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶 (cytosinedeaminase ,CD)和单纯疱疹病毒 1 胸苷激酶(herpessimplexvirustype 1thymidinekinase ,TK)双自杀基因的重组腺病毒载体 ,为再狭窄基因治疗的应用奠定基础 ,首先构建了含单、双自杀基因的腺病毒穿梭载体 ,细菌内同源重组法获得重组腺病毒质粒 .脂质体介导下转染 2 93细胞进行包装并大量扩增得到Ad TK、Ad CD、Ad TK CD、Ad LacZ 4种重组腺病毒 .氯化铯 (CsCl)梯度离心法纯化后利用报告基因绿色荧光蛋白 (GFP)测定病毒滴度 ,可达 10 9pfu ml .PCR和Western印迹法对外源基因进行鉴定 ,证明单、双自杀基因均已整合入腺病毒基因组并表达 .重组腺病毒感染血管平滑肌细胞后 ,用MTT法比较了单、双自杀基因的杀伤作用 ,发现在感染复数≤ 2 0时 ,双自杀基因对细胞的抑制作用明显高于单基因 .成功地构建腺病毒双自杀基因共表达载体 ,为进一步的体内外实验奠定了基础 . 展开更多
关键词 表达载体 双基因共表达 应用 制备 CD/TK 自杀基因 重组腺病毒
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“两步转化法”高效制备携带自杀基因的重组腺病毒载体 被引量：3
3
作者 杨文宇 黄宗海 +2 位作者 汤福祥 钱勇 车小燕 《第一军医大学学报》 CSCD 北大核心 2004年第2期164-167,共4页
目的采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌,制备AdEasy-1细菌;自载体pBS-CD中切出CD基因,亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上,构建的pAdtrackCMV-CD线性化后... 目的采用“两步转化法”高效制备含胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的腺病毒重组载体。方法将质粒pAdEasy-1线性化后转化于BJ5183菌,制备AdEasy-1细菌;自载体pBS-CD中切出CD基因,亚克隆至穿梭质粒pAdtrackCMV上,构建的pAdtrackCMV-CD线性化后转化AdEasy-1细菌,抽提同源重组腺病毒质粒,PacⅠ酶切后转染293细胞,在293细胞中包装与扩增,利用GFP报告基因进行滴度测定。同时按“一步转化法”进行同样的重组腺病毒制备,比较二者的优劣性。结果“两步转化法”终产物17个克隆中13个正确,正确率为76.5%(13/17);“一步转化法”重组产物17个克隆中有2个正确,正确率为11.8%(2/17),两者具有显著性差异(P=0.000 17)。结论“两步转化法”细菌内同源重组是一种更高效、更方便的重组腺病毒制备方法。 展开更多
关键词 两步转化法 制备 自杀基因 重组腺病毒载体 恶性肿瘤 基因治疗
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KDR启动子驱动的双自杀基因对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用 被引量：5
4
作者 杨六成 黄宗海 +4 位作者 孔恒 李强 陈飞 俞金龙 厉周 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期1-4,共4页
目的探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用。方法用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的BEL-7402、HUVEC细胞和不表达KDR的HepG2细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重... 目的探讨腺病毒介导的KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对人肝癌细胞及脐静脉内皮细胞的特异性杀伤作用。方法用腺病毒AdKDR-CDglyTK感染表达KDR的BEL-7402、HUVEC细胞和不表达KDR的HepG2细胞,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测重组腺病毒及转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,MTT法检测该系统对不同细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果以感染复数MOI为100的腺病毒AdKDR-CDglyTK分别感染各细胞株,重组腺病毒对三种细胞具有相似的感染效率。RT-PCR检测发现,重组腺病毒及感染AdKDR-CDglyT的三种细胞均有目的基因CDglyTK的表达。感染腺病毒的BEL-7402、HUVEC细胞对前药具有较高的敏感性,而HepG2细胞对前药不敏感(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该系统有明显的旁观者效应。结论KDR启动子驱动的双自杀基因系统CDglyTK对肝癌细胞及人脐静脉内皮细胞具有特异性的杀伤作用。 展开更多
关键词 双自杀基因 人脐静脉内皮细胞 肝肿瘤 腺病毒
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重组腺病毒Ad-hTERTp-HSV-TK/GCV系统的构建及其对人肝癌细胞HepG2的杀伤作用及旁观者效应研究 被引量：3
5
作者 刘燕 邓志华 +4 位作者 杨长青 刘京龙 贾静 郭素雅 杨强 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期29-32,共4页
背景与目的:肝癌的基因治疗已成为肝癌治疗的重要发展方向,本文探讨Ad-hTERTP-HSV-TK/GCV系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用;并观察其过程中旁观者效应的作用。方法:用重组腺病毒Ad-hTERTP-HSV-TK系统分别感染肝癌细胞株HepG2和正常肝... 背景与目的:肝癌的基因治疗已成为肝癌治疗的重要发展方向,本文探讨Ad-hTERTP-HSV-TK/GCV系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用;并观察其过程中旁观者效应的作用。方法:用重组腺病毒Ad-hTERTP-HSV-TK系统分别感染肝癌细胞株HepG2和正常肝细胞L-02,加入前体药物更昔洛韦(GCV),四甲基偶氮唑盐比色法检测其对感染后细胞的杀伤作用;将感染后的TK阳性HepG2细胞和未感染的TK阴性HepG2细胞按不同比例浓度(0∶10、1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0)混合,观察其旁观者效应。结果:肝癌细胞HepG2的存活率随病毒感染复数(MOI)和GCV浓度增加而逐渐降低,L-02细胞无明显变化。旁观者效应表明,在TK阳性HepG2细胞为10%时,细胞抑制率达28.06%,70%时达90.44%。结论:重组腺病Ad-hTERTP-HSV-tk/GCV系统对肝癌细胞HepG2有选择性杀伤作用及明显的旁观者效应。 展开更多
关键词 基因治疗 肝肿瘤 重组腺病毒载体 HTERT启动子 自杀基因 培养的肿瘤细胞
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hTERT启动子调控腺病毒介导的HSV-TK/GCV基因系统治疗肾癌的动物实验研究
6
作者 田大伟 陈业刚 +2 位作者 张勇 王亚轩 黎玮 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2010年第15期846-849,共4页
目的：探讨带有人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（herpessimplex virus—thymidine kinase，HSV—TK）基因的重组腺病毒（Ad—TK）结合无毒的环氧鸟苷（gancyclo... 目的：探讨带有人端粒酶逆转录酶（Human Telomerase Reverse Transcriptase，hTERT）启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（herpessimplex virus—thymidine kinase，HSV—TK）基因的重组腺病毒（Ad—TK）结合无毒的环氧鸟苷（gancyclovir，GCV）对人肾细胞癌的治疗作用。方法：建立人肾细胞癌移植瘤裸鼠模型，采用hTERTp为启动子驱动Ad—HSV-TK尾静脉注射荷瘤小鼠，注射剂量1．0×10^9pfu／kg，腹腔注射GCV，每5天测量移植瘤体积和重量，30天后处死裸鼠，观察肿瘤体积、相对肿瘤体积、瘤重、肿瘤增殖率及检测凋亡率，评价Ad—hTERT—HSV-TK/GCV的抗肿瘤活性，并与Ad—hTERT—HSV—TK和GCV单独治疗比较。结果：成功建立肾细胞癌移植瘤裸鼠模型。Ad—hTERT—HSV—TK/GCV对裸鼠移植瘤生长具有明显抑制作用，对心、肺、肝、脑、肾、脾无明显损害。而Ad—hTERT-HSV-TK和GCV单独治疗组虽然能抑制肿瘤生长，但是较阴性对照组无明显统计学差异。Ad—hTERT-HSV-TK／GCV治疗组的移植瘤体积、重量都明显小于阴性对照组、Ad—TK和GCV治疗组（P〈0．05）；Ad—hTERT-HSV-TK／GCV治疗组的凋亡指数为（3．2±0．3）％，其他组凋亡指数分别是（0．1±0．1）％，（0．2±0．1）％，（0．2±0．1）％，与Ad—hTERT—HSV—TK/GCV治疗组相比差异具有显著性（P〈0．05）；免疫组化检测结果显示Ad—hTERT—HSV—TK／GCV治疗组的增殖指数为（27．57±9．36）％，而其他组的增殖指数则分别为（71．2±13．1）％．（69．8±11．6）％，（72．4±12．3）％，Ad—hTERT—HSV—TK／GCV治疗组同其他组相比差异具有显著性（P〈0．01）。结论：Ad—hTERT—HSV—TK／GCV对肾细胞癌具有明确的抑制肿瘤生长促进肿瘤凋亡及提高存活率的作用，且对正常组织无明显损伤；Ad—hTERT—HSV—TK／GCV系统是一种安全有效且靶向性高的基因疗法，值得进一步临床研究。 展开更多
关键词 肾癌基因治疗 重组腺病毒 人端粒酶逆转录酶 自杀基因 启动子
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重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用 被引量：2
7
作者 周丽君 李秋香 +3 位作者 李冬田 曹阳 李光明 佟惠春 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2008年第3期223-227,共5页
目的:探讨含腺病毒基因E1A、融合自杀基因CDglyTK及报告基因GFP的重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物5-FC和(或)GCV联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。方法:将重组腺病毒质粒prAd-E1A-CDglyTK经脂质体介导转染293细胞,进行病... 目的:探讨含腺病毒基因E1A、融合自杀基因CDglyTK及报告基因GFP的重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物5-FC和(或)GCV联合应用对人卵巢癌SKOV3细胞的抑制作用。方法:将重组腺病毒质粒prAd-E1A-CDglyTK经脂质体介导转染293细胞,进行病毒的扩增、纯化与PCR鉴定,以紫外分光光度法与TCID50法测定纯化病毒的颗粒浓度与感染性滴度,计算病毒比活性;在SKOV3细胞中观察重组病毒的复制能力及感染效率,确定感染率达90%以上的最小MOI。用MTT法观察感染重组病毒的SKOV3细胞对5-FC或GCV的敏感性,并计算IC_(50);观察一定MOI的rAd-E1A-CDglyTK或重组复制缺陷型腺病毒rAd-CDglyTK与IC_(50)的5-FC和(或)GCV联合应用对SKOV3细胞生长的抑制作用。结果:经PCR和琼脂糖凝胶电泳证实,纯化重组腺病毒中存在E1A和CDglyTK两个基因片段,其病毒颗粒浓度和感染性滴度分别为9.47×10^(11) VP/ml和3.16×10^(10)IU/ml,病毒比活性为3.34%。重组病毒可在SKOV3细胞中复制,对SKOV3细胞的感染效率随MOI的增加而增加,可致细胞感染率达90%以上的最小MOI为50 IU/cell。5-FC或GCV明显抑制感染细胞的生长,且存在明显的剂量依赖效应。两种重组腺病毒/前药系统的抑瘤作用比较显示,rAd-E1A-CDglyTK组细胞生长抑制率[(16.57±1.59)%]显著高于rAd-CDglyTK组[(10.44±1.80)%,P<0.01];与IC_(50)的5-FC和GCV双药联合应用,其抑制率达(71.68±2.63)%,显著高于rAd-CDglyTK/5-FC+GCV组的(63.64±2.91)%(P<0.01)。结论:重组腺病毒rAd-E1A-CDglyTK与酶前体药物联合应用对卵巢癌SKOV3细胞具有显著的抑制作用,其效果优于重组复制缺陷型腺病毒rAd-CDglyTK。 展开更多
关键词 卵巢癌 重组腺病毒 EIA基因 自杀基因 SKOV3细胞
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选择性杀伤CEA阳性结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用
8
作者 王梦筠 韦芳 +6 位作者 王慧萍 季迅达 陈霞芳 李惠明 冯烨 王煜非 黄倩 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期802-807,共6页
目的构建能选择性杀伤表达癌胚抗原(CEA)的结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体。方法PCR扩增CEA基因5’端调控序列,构建以EGFPLuc作为报告基因的表达质粒pCEA-EGFPLuc。利用脂质体将pCEA-EGFPLuc导入CEA阳性和阴性细胞中,通过检测增强... 目的构建能选择性杀伤表达癌胚抗原(CEA)的结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体。方法PCR扩增CEA基因5’端调控序列,构建以EGFPLuc作为报告基因的表达质粒pCEA-EGFPLuc。利用脂质体将pCEA-EGFPLuc导入CEA阳性和阴性细胞中,通过检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达和荧光素酶(luciferase)活性,评价CEA启动子活性。构建由CEA启动子调控的E1A,并携带HSVtk基因的条件复制型腺病毒Ad.CEA-E1A/CMV-TK,分别感染CEA阳性肿瘤细胞(Lovo和SW620)和阴性肿瘤细胞(HeLa),通过E1A表达和细胞存活率检测,评价该病毒对CEA阳性肿瘤细胞的选择性杀伤效果及联合应用环氧鸟苷(GCV)后的协同效应。结果CEA启动子具有较好的选择性和较高的活性。Ad.CEA-E1A/CMV-TK只在CEA阳性的肿瘤细胞中表达E1A。感染Ad.CEA-E1A/CMV-TK后,Lovo和SW620细胞的存活率分别为(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%,均显著低于HeLa细胞的(87.44±2.76)%(P<0.01);联合GCV对Lovo和SW620的杀伤效果增加,细胞存活率分别为(17.26±3.65)%和(23.93±5.40)%,显著低于未加GCV的(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%(P<0.01)。结论由CEA调控复制的Ad.CEA-E1A/CMV-TK对CEA阳性的结直肠癌细胞具有选择性杀伤作用,联合GCV后杀伤效果明显增强。 展开更多
关键词 结直肠癌 癌胚抗原 启动子 重组腺病毒 E1A基因 HSVtk自杀基因
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鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究 被引量：13
9
作者 李正 程相朝 +5 位作者 张春杰 李银聚 李静 张明亮 田芳华 杨宁宁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第7期534-538,共5页
为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变... 为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 鼠伤寒沙门氏菌SL1344 crp/cya基因双缺失 重组自杀性质粒
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