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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作 被引量：5
1
作者 崔喜艳 张继晓 +3 位作者 窦瑶 孙小杰 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第7期49-53,59,共6页
【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达... 【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。 展开更多
关键词 SSⅠ PPDK1 双分子荧光互补技术(bifc) 瞬时转化 蛋白质互作
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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白的相互作用 被引量：2
2
作者 曹建美 《安徽农业科学》 CAS 2016年第14期152-154,161,共4页
[目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5... [目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与Zmb ZIP72的Bi FC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞,细胞核中能发出黄色荧光。[结论]Zm MAPK5与Zmb ZIP72在植物细胞核内相互作用。 展开更多
关键词 ZmMAPK5 ZmbZIP72 双分子荧光互补(bifc) 蛋白互作 ZmMAPK5 ZmbZIP72 Bimolecular FLUORESCENCE COMPLEMENTATION (bifc)
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双分子荧光互补技术 被引量：15
3
作者 樊晋宇 崔宗强 张先恩 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期767-774,共8页
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相... 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新形成能具有活性的荧光蛋白.BiFC方法简单直观,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位相互作用蛋白质的位点.多色BiFC系统共用或与荧光共振能量转移(FRET)技术联用,还可以检测细胞内多个蛋白质的相互作用. 展开更多
关键词 双分子荧光互补(bifc) 蛋白质相互作用 检测 定位
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玉米AGPasebt2与GPN1蛋白互作的双分子荧光互补技术研究 被引量：1
4
作者 崔喜艳 赵吉元 +3 位作者 胡广宇 窦瑶 刘相国 韩四平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第6期99-104,共6页
【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-... 【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-AGPasebt2、326-CYNEE-GPN1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;携带有共转化基因的烟草叶肉细胞在激光共聚焦显微镜下观察到明显的黄色荧光现象,且黄色荧光与叶绿体自发的红色荧光位置重合。【结论】AGPase-bt2与GPN1在植物细胞中真实地存在蛋白互作。 展开更多
关键词 AGPasebt2 GPN1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作
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Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用
5
作者 杨磊 朱正 +4 位作者 王博永 梁谦学 吴文德 李恭贺 郑喜邦 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第8期2444-2453,共10页
【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、... 【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果,并与其他常用检测方法比较,以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK 293TGFP11-MSTN细胞,经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒,然后以慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞,采用潮霉素B筛选mCherry阳性(mCherry+)细胞,再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01,下同),其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3,该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制;得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒,荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明,GFP+细胞数量明显减少,GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符,说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达,发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳,其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调,且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降,与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符,证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。 展开更多
关键词 肌肉生长抑制素(MSTN) RNA干涉(RNAi) shRNA 慢病毒 Split-GFP双分子荧光互补技术
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双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用 被引量：9
6
作者 严晶 霍克克 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第6期589-595,共7页
双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)分析技术,是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表... 双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)分析技术,是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达,如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolorBiFC),不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成,还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前,该技术已用于转录因子,G蛋白βγ亚基的二聚体形式,不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上. 展开更多
关键词 双分子荧光互补(bifc) 蛋白质相互作用 亚细胞定位
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应用双分子荧光互补技术研究靶标肽与互补肽之间的互作关系
7
作者 梁洪宇 刘成倩 +3 位作者 高骏 周佳明 司伏生 易建中 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期427-434,共8页
【目的】基于双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术研究依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白受体结合位点肽段的靶标肽与互补肽在活细胞内的相互作用关系以及定位情况,为进一步利用该多肽进行猪流行性腹泻... 【目的】基于双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术研究依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白受体结合位点肽段的靶标肽与互补肽在活细胞内的相互作用关系以及定位情况,为进一步利用该多肽进行猪流行性腹泻病毒的检测积累前期基础和提供理论支撑。【方法】依据靶标蛋白的氨基酸组成、所带电荷种类、形成分子间氢键的能力、极性的强弱、疏水性能等理化特性设计出靶标肽;根据靶标蛋白的氨基酸组成,设计出在理论上与其相互作用的互补肽,并利用生物信息学工具对靶标肽与互补肽进行预测分析;将靶标肽与互补肽的核苷酸序列分别插入EcoRΙ/XhoΙ双酶切后的pBiFC-VC155与NotΙ/SalΙ双酶切后的pBiFC-VN173载体中,构建出BiFC真核表达载体,经酶切及测序验证正确后转染Vero细胞来研究靶标肽与互补肽的互作关系以及形成的BiFC复合物在细胞内的精确定位。【结果】生物信息学分析表明靶标肽和互补肽分别带有亲水性和疏水性结构域,亲水性结构域都带有正负电荷,能够产生静电引力;酶切鉴定和测序结果表明成功构建了pBiFC-VC155-靶标肽和pBiFC-VN173-互补肽真核表达质粒;细胞转染试验表明重组质粒共同转染后靶标肽和互补肽能够在Vero细胞内形成BiFC复合物,表明两者发生了相互作用;间接免疫荧光试验证实该BiFC复合物主要分布于细胞核中。【结论】研究证实了基于猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合位点肽段设计的多肽能够在活细胞内发生相互作用,表明该肽段用于检测的可行性。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 靶标肽 互补肽 蛋白互作 双分子荧光互补 病原诊断
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荧光双分子互补分析Ezrin与L-periaxin的互作模式 被引量：2
8
作者 彭婷婷 王慧 石亚伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第1期38-46,共9页
腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病.Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用... 腓骨肌萎缩症4F亚型是Periaxin基因的突变所导致一种脱髓鞘型遗传病.Periaxin蛋白是外周神经系统中特异且大量表达的蛋白,在髓鞘成熟与维护中发挥重要作用.而Ezrin是一种膜骨架连接蛋白,在细胞形态的维持、运动、黏附等方面发挥重要作用.在前期已证实L-periaxin与Ezrin间存在蛋白互作的基础上,本文通过分子荧光互补实验,结合免疫荧光定位实验、免疫共沉淀等技术,进一步分析并揭示了L-periaxin蛋白与Ezrin蛋白之间的互作方式,具体为L-periaxin(1-200 aa)与Ezrin(1-296 aa)以及L-periaxin(1060-1461 aa)与Ezrin(475-585 aa)以"头对头"与"尾对尾"的方式发生相互作用.Ezrin可能是一种引导L-periaxin在施万细胞膜上堆积的新的分子配体,二者可能通过蛋白分子间更加紧密的方式完成在细胞膜处的堆积,参与到髓鞘的维护中. 展开更多
关键词 L-periaxin EZRIN “头对头”与“尾对尾” 蛋白相互作用 荧光双分子互补
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双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用 被引量：1
9
作者 白薇 孙海莲 +3 位作者 Mawsheng Chern Randy Ruan Pam Ronald 樊明寿 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期30-34,共5页
NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源... NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性。水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白。本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YFP)研究了水稻NH1家族蛋白之间在活体内的相互作用,发现除NH2外,NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作,产生荧光信号,并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号。 展开更多
关键词 水稻 NH1家族蛋白 双分子荧光互补试验 蛋白互作
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双分子荧光互补系统的构建及其在病毒学中的初步应用
10
作者 张荣 陈春燕 +2 位作者 韦祖樟 袁世山 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 2013年第3期27-32,共6页
双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是新近发展起来的研究蛋白质相互作用的技术,因其使用简便、检测灵敏、可在生理条件下直接观察,已在生物各领域广泛应用。本试验将黄色荧光蛋白EYFP突变为Venus,并在第17... 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是新近发展起来的研究蛋白质相互作用的技术,因其使用简便、检测灵敏、可在生理条件下直接观察,已在生物各领域广泛应用。本试验将黄色荧光蛋白EYFP突变为Venus,并在第173位氨基酸后分割为两段失去活性的VN和VC,经共转染表达不会产生荧光;在插入已被证明存在相互作用的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白经共转染表达时,可以观察到荧光;通过扩增MARC-145细胞的细胞骨架蛋白α-tubulin并插入到VN和VC,除与自身共表达时发出荧光外,与N蛋白共表达时没有荧光产生,说明该VN和VC片段用于研究蛋白互作是可靠的。本试验建立了BiFC系统,为以后应用到研究病毒编码蛋白之间及其与宿主蛋白间的相互作用奠定基础。 展开更多
关键词 双分子荧光互补 荧光蛋白 蛋白质相互作用
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基于荧光蛋白的生物探针设计策略及其应用
11
作者 张宁 田烨 《遗传》 北大核心 2025年第7期711-728,共18页
荧光蛋白的发现为细胞生物学研究带来了革命性进展。通过将荧光蛋白与目标蛋白融合,构建荧光生物探针,可以在活细胞和生物体内实时监测细胞事件的动态变化。荧光蛋白的独特理化特性,如光谱范围、发色团成熟速度、pH敏感性和稳定性等,为... 荧光蛋白的发现为细胞生物学研究带来了革命性进展。通过将荧光蛋白与目标蛋白融合,构建荧光生物探针,可以在活细胞和生物体内实时监测细胞事件的动态变化。荧光蛋白的独特理化特性,如光谱范围、发色团成熟速度、pH敏感性和稳定性等,为探针的设计提供了多样化的选择。基于这些特性,研究者开发了用于监测不同分子事件的多种荧光生物探针。本文系统总结了荧光蛋白探针设计的主要策略及其在生物学研究中的典型应用,为开发更高效、更专用的新型荧光生物探针以应对复杂生物学问题提供了参考。 展开更多
关键词 荧光蛋白 荧光生物探针 荧光时钟 循环重排荧光蛋白 双分子荧光互补 二聚化依赖荧光蛋白 荧光共振能量转移 光激活 光转换 光开关
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DdSOC1基因调控德阳柿成花分子机制
12
作者 万建琦 丁瑜 +4 位作者 任晗 李雯霞 杨勇 黄金盟 关长飞 《果树学报》 北大核心 2025年第2期276-287,共12页
【目的】探究DdSOC1基因调控德阳柿(Diospyros deyangensis)成花的分子机制。【方法】通过生物信息学、基因表达量分析、酵母双杂筛库和双杂互作验证等方法,解析DdSOC1基因在调控成花中的功能。【结果】德阳柿DdSOC1序列和君迁子DlSOC1... 【目的】探究DdSOC1基因调控德阳柿(Diospyros deyangensis)成花的分子机制。【方法】通过生物信息学、基因表达量分析、酵母双杂筛库和双杂互作验证等方法,解析DdSOC1基因在调控成花中的功能。【结果】德阳柿DdSOC1序列和君迁子DlSOC1序列遗传距离较近;在成花诱导过程中,DdSOC1在茎、叶、芽中随开花进程出现差异表达;基于柿酵母文库,筛选获得7个DdSOC1的互作蛋白(MIOX、AGL14、JOINTLESS、GL2、NOVEIN、NBS、UBC7),酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明,DdSOC1和上述7个蛋白均互作;qRT-PCR结果显示,一年生已开花的德阳柿SOC1、AGL14、JOINTLESS、NOVEIN、GL2、UBC7、NBS的表达量,幼叶高于成龄叶;二年生实生苗中,SOC1表达量差异不大,而AGL14、JOINTLESS、GL2、UBC7、MIOX表达量在开花实生苗中的表达量高于未开花实生苗。【结论】DdSOC1及其互作蛋白在德阳柿成花转变中发挥着重要作用,为探究德阳柿短童期分子调控网络提供了更多理论依据。 展开更多
关键词 德阳柿 DdSOC1 互作蛋白 酵母双杂交 双分子荧光互补 实时荧光定量分析
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利用分裂泛素酵母双杂交技术钓取小麦TaSC互作蛋白质 被引量：3
13
作者 蔺芳芳 杨旭 +3 位作者 武小翠 刘晓梅 葛荣朝 赵宝存 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期423-430,共8页
TaSC(Triticum asetivum L.salt-tolerance related gene,Gen Bank登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC为诱饵,运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA表达文库... TaSC(Triticum asetivum L.salt-tolerance related gene,Gen Bank登录号为AY956330)是从小麦耐盐突变体RH8706-49中克隆的高盐诱导表达的耐盐相关基因。以该基因编码的蛋白质TaSC为诱饵,运用分裂泛素酵母双杂交技术从小麦cDNA表达文库中钓取互作蛋白质,筛选到一个编码小麦未知功能蛋白质的基因(GenBank登录号为AK336035),命名为TaSCIP1(TaSC interaction protein 1)。双分子荧光互补(BiFC)实验证实TaSCIP1与TaSC存在互作。该互作蛋白的分离有利于进一步研究TaSC基因的耐盐机制。 展开更多
关键词 TaSC 小麦 CDNA表达文库 分裂泛素酵母双杂交 双分子荧光互补技术
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利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系 被引量：4
14
作者 严茗 黄兵 +6 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 赵宗平 陈婷 吕凌 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第4期32-38,共7页
为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E t... 为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 顶膜抗原1 棒状体颈部蛋白2 双分子荧光互补技术 互作蛋白
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基于BiFC技术验证IMM-H004对CKLF1/CCR4结合的影响 被引量：3
15
作者 彭也 张钊 +1 位作者 楚世峰 陈乃宏 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第7期1030-1035,共6页
目的利用BiFC双分子荧光互补技术研究香豆素衍生物IMM-H004对趋化素样因子CKLF1与其受体CCR4结合的影响。方法引入BiFC技术,将CKLF1趋化活性肽段C27与CCR4分别与Venus荧光蛋白的N端(VN173)和C端(VC155)相连,C27与CCR4的结合可以Venus黄... 目的利用BiFC双分子荧光互补技术研究香豆素衍生物IMM-H004对趋化素样因子CKLF1与其受体CCR4结合的影响。方法引入BiFC技术,将CKLF1趋化活性肽段C27与CCR4分别与Venus荧光蛋白的N端(VN173)和C端(VC155)相连,C27与CCR4的结合可以Venus黄色荧光的形式体现,重组载体共转染HEK293细胞,进行氧糖剥夺/复氧损伤造模,并给予0.1、1和10μmol·L^-1 IMM-H004,观察活细胞中荧光强度。结果通过测序比对验证CKLF1/CCR4-BiFC系统构建成功,并能转染HEK293细胞正常启动,在该系统中,与Control组相比,OGD/R造模后黄色荧光强度明显增加(P<0.01),给予不同浓度IMM-H004后荧光表达均明显降低(P<0.01),差异具有统计学意义。结论通过BiFC技术,在活细胞状态下直观观察到IMM-H004在脑缺血损伤模型中具有明显的神经保护作用,可拮抗氧糖剥夺/复氧损伤造模状态下CKLF1/CCR4的结合。 展开更多
关键词 香豆素衍生物 趋化素样因子1 趋化因子受体4 双分子荧光互补技术 缺血性脑卒中 氧糖剥夺/复氧复糖
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葡萄脱落酸受体VvPYL4互作蛋白的筛选及互作蛋白基因表达
16
作者 刘丽 王辉 +2 位作者 关天舒 李柏宏 于舒怡 《生物技术通报》 北大核心 2025年第4期188-197,共10页
【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构... 【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,通过酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选与VvPYL4相互作用的蛋白;通过实时荧光定量PCR分析候选互作蛋白基因在葡萄霜霉病菌诱导下的表达模式,并通过双分子荧光互补技术进行互作蛋白的验证。【结果】构建的酵母双杂交cDNA文库库容为7.16×107 CFU/mL,重组率100%,插入片段大小在1000 bp左右。成功构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,且在酵母细胞中无自激活活性。诱饵载体与酵母双杂交文库共转酵母AH109菌株后,经多次筛库、测序、BLAST比对和回转验证,最终获得53个候选互作蛋白,这些蛋白涉及信号转导、植物生长发育及环境胁迫响应等多个方面。基于实时荧光定量PCR分析,编码4个蛋白的基因均受葡萄霜霉病菌诱导表达。通过双分子荧光互补试验发现,在共转pSPYCEPP2C24和pSPYNE-PYL4表达载体的本氏烟草叶片中可观察到强烈的黄色荧光信号,表明PYL4与PP2C24蛋白之间能够发生相互作用。【结论】成功构建霜霉病菌侵染葡萄叶片的cDNA文库,并筛选出53个与VvPYL4相互作用的候选蛋白,其中4个编码蛋白的基因均响应葡萄霜霉病菌的胁迫诱导,验证了VvPYL4与PP2C24蛋白之间存在相互作用关系。 展开更多
关键词 葡萄霜霉病 脱落酸受体PYL4 cDNA文库筛选 酵母双杂交系统 双分子荧光互补 互作蛋白 蛋白磷酸酶2C
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蛋白质相互作用实验技术的最新进展 被引量：7
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作者 王明强 武金霞 +3 位作者 张玉红 韩凝 边红武 朱睦元 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1274-1282,共9页
蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、G... 蛋白质相互作用的研究,是揭示生物体正常生长发育及其应对各种生物或(和)非生物胁迫的分子机制及其调控网络的重要途径。文章综述了近年来发展起来的研究蛋白质相互作用的常用实验性方法,如酵母双杂交系统、串联亲和纯化、免疫共沉淀、GST Pull-down、双分子荧光互补、荧光共振能量转移、表面等离子共振分析,介绍了其原理、发展进程,并分析了其优缺点。 展开更多
关键词 蛋白质相互作用 酵母双杂交系统 串联亲和纯化 免疫共沉淀 GST Pull—down 双分子荧光互补 荧光共振能量转移 表面等离子共振分析
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pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒的构建及其在活细胞内的相互作用 被引量：2
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作者 郭术俊 赵保明 +2 位作者 唐洁 胡建国 吕合作 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期137-141,共5页
目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到p... 目的构建pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒,利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在活细胞内直接观察Olig2与Id4的相互作用。方法利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增Olig2和Id4基因,分别定向克隆到pBiFC-VN173和pBiFC-VC155载体中,获得pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序;用脂质体方法共转染pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4质粒到人结肠癌细胞系SW-1116细胞中,在荧光显微镜下观察Olig2与Id4之间的相互作用。结果通过酶切鉴定和测序表明成功构建了pBiFC-VN173-Olig2和pBiFC-VC155-Id4真核表达质粒;该质粒能够有效地共同转染到靶细胞,Olig2和Id4在靶细胞中能够高效表达,并可以相互结合出现BiFC荧光信号,且该信号主要分布于胞质中。结论成功构建了用于BiFC技术的真核表达载体,并在活细胞内检测到Olig2和Id4分子的相互结合。 展开更多
关键词 OLIG2 DNA结合抑制因子4 重组质粒 转染 细胞定位 双分子荧光互补技术
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调控棘孢木霉几丁质酶Tachi2基因的转录因子和蛋白的互作研究
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作者 曲珊 赵月 +2 位作者 李雅华 郑桂玲 咸洪泉 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期310-319,共10页
【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关... 【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关系,为解析几丁质诱导调控基因转录表达机制提供科学依据。【方法】利用酵母双杂交系统对棘孢木霉几丁质酶基因Tachi2中47号转录因子的候选互作蛋白H63进行体内点对点互作鉴定;采用大肠杆菌表达系统分别对H63蛋白与47号转录因子基因进行原核诱导表达,利用亲和层析技术纯化融合蛋白,通过GST pull-down实验进行体外蛋白互作检测;利用农杆菌介导的洋葱表皮细胞亚细胞定位技术和BiFC实验进一步检测细胞内蛋白的相互作用。【结果】H63蛋白与47号转录因子在酵母细胞内存在互作关系;原核表达的重组H63蛋白、47号转录因子大小分别为36 kD和18 kD,二者在体外存在互作关系;成功构建了双分子荧光互补载体,证实H63蛋白与47号转录因子在洋葱内表皮细胞中存在相互作用,并且互作发生在细胞核内。【结论】证实H63蛋白与47号转录因子在细胞内外均存在相互作用,为解析真菌几丁质酶基因的表达调控、几丁质酶在农业和生物医药领域的开发利用奠定理论基础。 展开更多
关键词 棘孢木霉 几丁质酶 转录因子 基因表达 互作蛋白 酵母双杂交 GSTPull-down 双分子荧光互补
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水稻草状矮化病毒外壳蛋白CP自身互作研究
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作者 胡昱颛 程淑媛 +6 位作者 王全兴 杜磊 张金艺 高欣语 刘冰 蒋军喜 熊桂红 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期32-40,共9页
【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过... 【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过RT-PCR扩增得到CP基因。将CP基因分别构建到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7上,利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将酵母质粒组合pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53、阴性对照pGADT7-T/pGBKT7-Lam分别转化到酵母感受态细胞Y2HGold中,先后涂布于缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上。通过观察酵母细胞在缺陷培养基上的生长和显色情况鉴定CP蛋白的毒性、自激活活性和自身互作关系。利用亚细胞定位和双分子荧光互补(BiFC)鉴定CP在本氏烟中的定位及互作。将CP构建到植物瞬时表达载体pEarleyGate101(101)、pEarleyGate202-YN(YN)、pEarleyGate202-YC(YC)上,并利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆101-CP、YN-CP、YC-CP、空载体YN、YC分别转化到农杆菌GV3101中。将含阳性质粒101-CP的农杆菌单独注射本氏烟叶片;将含阳性质粒YN-CP/YC-CP、阴性对照YN-CP/YC、YN/YC-CP的农杆菌共注射本氏烟叶片;利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的发光和定位。【结果】RT-PCR扩增得到CP基因,其大小为978bp。成功构建酵母表达载体pGBKT7-CP和pGADT7-CP。含质粒pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照和阴性对照的酵母菌均能在缺陷培养基SD/-Leu/-Trp平板上生长,且含质粒pGBKT7-CP/pGADT7的酵母菌的生长情况与对照一致,说明CP蛋白对酵母菌无毒性。但仅含质粒pGBKT7-CP/pGADT7-CP的酵母菌和阳性对照可在缺陷培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板上生长并显色,表明CP蛋白无自激活活性,且CP蛋白在酵母细胞中能够自身互作。成功构建CP基因的植物表达载体;亚细胞定位结果显示,CP蛋白主要定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜上。BiFC结果显示CP存在自身互作,且互作也定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜。【结论】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSVCP是该病毒的外壳蛋白,可能在病毒复制、装配、侵染等过程中发挥着重要的作用。通过亚细胞定位、Y2H和BiFC鉴定了RGSVCP的定位和自身互作,为CP蛋白的功能研究提供参考,为解析RGSV的致病机制提供依据。 展开更多
关键词 水稻草状矮化病毒 外壳蛋白 载体构建 酵母双杂交 亚细胞定位 双分子荧光互补 蛋白互作
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