双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米SSⅠ与PPDK1之间的蛋白互作 被引量：5

1

作者 崔喜艳 张继晓 +3 位作者 窦瑶 孙小杰 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2013年第7期49-53,59,共6页

【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达... 【目的】分析玉米胚乳可溶性淀粉合成酶(SSⅠ)与质体型糖酵解途径关键催化酶丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)的蛋白互作关系,揭示可能发生互作的亚细胞位置。【方法】采用酶切连接的方法构建326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1双分子荧光互补表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶片组织,激光共聚焦显微镜下观察SSⅠ和PPDK1相互作用产生的荧光信号。【结果】双酶切试验鉴定表明,326-CYCHA-ss1和326-CYNEE-ppdk1重组载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;双分子荧光互补试验中,可观测到SSⅠ和PP-DK1相互结合而产生的黄色荧光信号。【结论】证实SSⅠ和PPDK1能够在植物活体细胞内发生真实的蛋白互作。 展开更多

关键词 SSⅠ PPDK1 双分子荧光互补技术(bifc) 瞬时转化 蛋白质互作

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双分子荧光互补技术(BiFC)分析玉米MAPK5与bZIP72蛋白的相互作用 被引量：2

2

作者 曹建美 《安徽农业科学》 CAS 2016年第14期152-154,161,共4页

[目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5... [目的]分析玉米MAPK5与b ZIP72蛋白之间的相互作用。[方法]构建双分子荧光互补表达载体p N-MAPK5和p C-b ZIP72,应用基因枪轰击洋葱表皮细胞瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察MAPK5与b ZIP72蛋白相互作用产生的荧光信号。[结果]ZmMAPK5与Zmb ZIP72的Bi FC融合载体同时轰击洋葱表皮细胞,细胞核中能发出黄色荧光。[结论]Zm MAPK5与Zmb ZIP72在植物细胞核内相互作用。 展开更多

关键词 ZmMAPK5 ZmbZIP72 双分子荧光互补(bifc) 蛋白互作 ZmMAPK5 ZmbZIP72 Bimolecular FLUORESCENCE COMPLEMENTATION (bifc)

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玉米AGPasebt2与GPN1蛋白互作的双分子荧光互补技术研究 被引量：1

3

作者 崔喜艳 赵吉元 +3 位作者 胡广宇 窦瑶 刘相国 韩四平 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第6期99-104,共6页

【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-... 【目的】解析玉米淀粉合成限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase-bt2)与糖酵解关键酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GPN1)在植物体内是否存在相互作用。【方法】首先克隆获得AGPase-bt2和GPN1基因,然后采用双分子荧光互补技术(BiFC),构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-GPN1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,并用2种载体共同瞬时侵染烟草叶肉细胞,48h后在激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2与GPN1的相互作用。【结果】AGPase-bt2基因长1 428bp,GPN1基因长1 497bp。双酶切鉴定结果表明,326-CYCHA-AGPasebt2、326-CYNEE-GPN1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;携带有共转化基因的烟草叶肉细胞在激光共聚焦显微镜下观察到明显的黄色荧光现象,且黄色荧光与叶绿体自发的红色荧光位置重合。【结论】AGPase-bt2与GPN1在植物细胞中真实地存在蛋白互作。 展开更多

关键词 AGPasebt2 GPN1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作

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双分子荧光互补试验研究水稻NH1家族蛋白之间相互作用 被引量：1

4

作者 白薇 孙海莲 +3 位作者 Mawsheng Chern Randy Ruan Pam Ronald 樊明寿 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2011年第2期30-34,共5页

NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源... NPR1(Non-expresser of pathogenesis related genes 1)是水杨酸(Salicilic acid,SA)介导的系统获得抗性(Sys-temic aquired resistance,SAR)的关键调控因子,在水稻中过量表达拟南芥NPR1和水稻NH1/OsNPR1(NPR1 homo-logue 1)(NPR1的同源物)可增强抗病性。水稻基因组中还有4个NPR1旁系同源物(Paralog),为NH1的家族蛋白。本试验利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC,or split YFP)研究了水稻NH1家族蛋白之间在活体内的相互作用,发现除NH2外,NH1、NH3、NH4和NH5都会和自身的蛋白互作,产生荧光信号,并且它们还会和家族成员的其他蛋白相互结合产生荧光信号。 展开更多

关键词 水稻 NH1家族蛋白 双分子荧光互补试验 蛋白互作

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双分子荧光互补技术及其在蛋白质相互作用研究中的应用 被引量：9

5

作者 严晶 霍克克 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第6期589-595,共7页

双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)分析技术,是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表... 双分子荧光互补(bimolecularfluorescencecomplementation,BiFC)分析技术,是由Hu等在2002年最先报道的一种直观、快速地判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的新技术.该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达,如果荧光蛋白活性恢复则表明两目标蛋白发生了相互作用.其后发展出的多色荧光互补技术(multicolorBiFC),不仅能同时检测到多种蛋白质复合体的形成,还能够对不同蛋白质间产生相互作用的强弱进行比较.目前,该技术已用于转录因子,G蛋白βγ亚基的二聚体形式,不同蛋白质间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作上. 展开更多

关键词 双分子荧光互补(bifc) 蛋白质相互作用 亚细胞定位

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葡萄脱落酸受体VvPYL4互作蛋白的筛选及互作蛋白基因表达

6

作者 刘丽 王辉 +2 位作者 关天舒 李柏宏 于舒怡 《生物技术通报》 北大核心 2025年第4期188-197,共10页

【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构... 【目的】ABA受体PYRl/PYLs/RCARs在ABA信号转导通路中起着重要作用。通过酵母双杂交技术筛选葡萄VvPYL4的互作蛋白,探究VvPYL4在葡萄应答霜霉病菌胁迫信号通路中的作用。【方法】以霜霉病菌侵染‘贝达’葡萄叶片为材料,构建cDNA文库;构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,通过酵母双杂交技术从cDNA文库中筛选与VvPYL4相互作用的蛋白;通过实时荧光定量PCR分析候选互作蛋白基因在葡萄霜霉病菌诱导下的表达模式,并通过双分子荧光互补技术进行互作蛋白的验证。【结果】构建的酵母双杂交cDNA文库库容为7.16×107 CFU/mL,重组率100%,插入片段大小在1000 bp左右。成功构建诱饵表达载体pGBKT7-VvPYL4,且在酵母细胞中无自激活活性。诱饵载体与酵母双杂交文库共转酵母AH109菌株后,经多次筛库、测序、BLAST比对和回转验证,最终获得53个候选互作蛋白,这些蛋白涉及信号转导、植物生长发育及环境胁迫响应等多个方面。基于实时荧光定量PCR分析,编码4个蛋白的基因均受葡萄霜霉病菌诱导表达。通过双分子荧光互补试验发现,在共转pSPYCEPP2C24和pSPYNE-PYL4表达载体的本氏烟草叶片中可观察到强烈的黄色荧光信号,表明PYL4与PP2C24蛋白之间能够发生相互作用。【结论】成功构建霜霉病菌侵染葡萄叶片的cDNA文库,并筛选出53个与VvPYL4相互作用的候选蛋白,其中4个编码蛋白的基因均响应葡萄霜霉病菌的胁迫诱导,验证了VvPYL4与PP2C24蛋白之间存在相互作用关系。 展开更多

关键词 葡萄霜霉病 脱落酸受体PYL4 cDNA文库筛选 酵母双杂交系统 双分子荧光互补 互作蛋白 蛋白磷酸酶2C

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应用双分子荧光互补技术研究靶标肽与互补肽之间的互作关系

7

作者 梁洪宇 刘成倩 +3 位作者 高骏 周佳明 司伏生 易建中 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2023年第2期427-434,共8页

【目的】基于双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术研究依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白受体结合位点肽段的靶标肽与互补肽在活细胞内的相互作用关系以及定位情况,为进一步利用该多肽进行猪流行性腹泻... 【目的】基于双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)技术研究依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白受体结合位点肽段的靶标肽与互补肽在活细胞内的相互作用关系以及定位情况,为进一步利用该多肽进行猪流行性腹泻病毒的检测积累前期基础和提供理论支撑。【方法】依据靶标蛋白的氨基酸组成、所带电荷种类、形成分子间氢键的能力、极性的强弱、疏水性能等理化特性设计出靶标肽;根据靶标蛋白的氨基酸组成,设计出在理论上与其相互作用的互补肽,并利用生物信息学工具对靶标肽与互补肽进行预测分析;将靶标肽与互补肽的核苷酸序列分别插入EcoRΙ/XhoΙ双酶切后的pBiFC-VC155与NotΙ/SalΙ双酶切后的pBiFC-VN173载体中,构建出BiFC真核表达载体,经酶切及测序验证正确后转染Vero细胞来研究靶标肽与互补肽的互作关系以及形成的BiFC复合物在细胞内的精确定位。【结果】生物信息学分析表明靶标肽和互补肽分别带有亲水性和疏水性结构域,亲水性结构域都带有正负电荷,能够产生静电引力;酶切鉴定和测序结果表明成功构建了pBiFC-VC155-靶标肽和pBiFC-VN173-互补肽真核表达质粒;细胞转染试验表明重组质粒共同转染后靶标肽和互补肽能够在Vero细胞内形成BiFC复合物,表明两者发生了相互作用;间接免疫荧光试验证实该BiFC复合物主要分布于细胞核中。【结论】研究证实了基于猪流行性腹泻病毒S蛋白受体结合位点肽段设计的多肽能够在活细胞内发生相互作用,表明该肽段用于检测的可行性。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 靶标肽 互补肽 蛋白互作 双分子荧光互补 病原诊断

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双分子荧光互补技术 被引量：15

8

作者 樊晋宇 崔宗强 张先恩 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期767-774,共8页

双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相... 双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)是近年发展起来的用于体内或体外检测蛋白质相互作用的一项新技术.该技术是将荧光蛋白在合适的位点切开形成不发荧光的2个片段,这2个片段借助融合于其上的目标蛋白的相互作用,彼此靠近,重新形成能具有活性的荧光蛋白.BiFC方法简单直观,既可以检测蛋白之间的相互作用,也可以定位相互作用蛋白质的位点.多色BiFC系统共用或与荧光共振能量转移(FRET)技术联用,还可以检测细胞内多个蛋白质的相互作用. 展开更多

关键词 双分子荧光互补(bifc) 蛋白质相互作用 检测 定位

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调控棘孢木霉几丁质酶Tachi2基因的转录因子和蛋白的互作研究

9

作者 曲珊 赵月 +2 位作者 李雅华 郑桂玲 咸洪泉 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期310-319,共10页

【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关... 【目的】生防菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)TD3104产生的几丁质酶Tachi2在植物病害防治过程中发挥重要作用,47号转录因子作用于特异响应几丁质诱导的Tachi2基因启动子顺式作用元件。探究47号转录因子与一种新调控蛋白H63的互作关系,为解析几丁质诱导调控基因转录表达机制提供科学依据。【方法】利用酵母双杂交系统对棘孢木霉几丁质酶基因Tachi2中47号转录因子的候选互作蛋白H63进行体内点对点互作鉴定;采用大肠杆菌表达系统分别对H63蛋白与47号转录因子基因进行原核诱导表达,利用亲和层析技术纯化融合蛋白,通过GST pull-down实验进行体外蛋白互作检测;利用农杆菌介导的洋葱表皮细胞亚细胞定位技术和BiFC实验进一步检测细胞内蛋白的相互作用。【结果】H63蛋白与47号转录因子在酵母细胞内存在互作关系;原核表达的重组H63蛋白、47号转录因子大小分别为36 kD和18 kD,二者在体外存在互作关系;成功构建了双分子荧光互补载体,证实H63蛋白与47号转录因子在洋葱内表皮细胞中存在相互作用,并且互作发生在细胞核内。【结论】证实H63蛋白与47号转录因子在细胞内外均存在相互作用,为解析真菌几丁质酶基因的表达调控、几丁质酶在农业和生物医药领域的开发利用奠定理论基础。 展开更多

关键词 棘孢木霉 几丁质酶 转录因子 基因表达 互作蛋白 酵母双杂交 GSTPull-down 双分子荧光互补

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水稻草状矮化病毒外壳蛋白CP自身互作研究

10

作者 胡昱颛 程淑媛 +6 位作者 王全兴 杜磊 张金艺 高欣语 刘冰 蒋军喜 熊桂红 《江西农业大学学报》 北大核心 2025年第1期32-40,共9页

【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过... 【目的】明确水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)外壳蛋白CP的自身互作,为揭示CP蛋白在RGSV侵染中的功能提供理论依据。【方法】利用酵母双杂交(Y2H)技术鉴定RGSV CP与CP蛋白之间的互作。提取感染RGSV水稻叶片的总RNA,通过RT-PCR扩增得到CP基因。将CP基因分别构建到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7上,利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将酵母质粒组合pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照pGADT7-T/pGBKT7-53、阴性对照pGADT7-T/pGBKT7-Lam分别转化到酵母感受态细胞Y2HGold中,先后涂布于缺陷型培养基SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal上。通过观察酵母细胞在缺陷培养基上的生长和显色情况鉴定CP蛋白的毒性、自激活活性和自身互作关系。利用亚细胞定位和双分子荧光互补(BiFC)鉴定CP在本氏烟中的定位及互作。将CP构建到植物瞬时表达载体pEarleyGate101(101)、pEarleyGate202-YN(YN)、pEarleyGate202-YC(YC)上,并利用菌液PCR鉴定阳性克隆。将阳性克隆101-CP、YN-CP、YC-CP、空载体YN、YC分别转化到农杆菌GV3101中。将含阳性质粒101-CP的农杆菌单独注射本氏烟叶片;将含阳性质粒YN-CP/YC-CP、阴性对照YN-CP/YC、YN/YC-CP的农杆菌共注射本氏烟叶片;利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的发光和定位。【结果】RT-PCR扩增得到CP基因,其大小为978bp。成功构建酵母表达载体pGBKT7-CP和pGADT7-CP。含质粒pGBKT7-CP/pGADT7、pGBKT7-CP/pGADT7-CP、阳性对照和阴性对照的酵母菌均能在缺陷培养基SD/-Leu/-Trp平板上生长,且含质粒pGBKT7-CP/pGADT7的酵母菌的生长情况与对照一致,说明CP蛋白对酵母菌无毒性。但仅含质粒pGBKT7-CP/pGADT7-CP的酵母菌和阳性对照可在缺陷培养基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-gal平板上生长并显色,表明CP蛋白无自激活活性,且CP蛋白在酵母细胞中能够自身互作。成功构建CP基因的植物表达载体;亚细胞定位结果显示,CP蛋白主要定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜上。BiFC结果显示CP存在自身互作,且互作也定位于本氏烟细胞的细胞核和细胞膜。【结论】水稻草状矮化病是由水稻草状矮化病毒引起的,给粮食产量造成了严重威胁。RGSVCP是该病毒的外壳蛋白,可能在病毒复制、装配、侵染等过程中发挥着重要的作用。通过亚细胞定位、Y2H和BiFC鉴定了RGSVCP的定位和自身互作,为CP蛋白的功能研究提供参考,为解析RGSV的致病机制提供依据。 展开更多

关键词 水稻草状矮化病毒 外壳蛋白 载体构建 酵母双杂交 亚细胞定位 双分子荧光互补 蛋白互作

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木薯花叶病毒AC4蛋白与AtPARN互作研究 被引量：3

11

作者 刘琳玉 赵平娟 +3 位作者 符艳 刘志昕 任艳利 张秀春 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第1期197-204,共8页

木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之... 木薯(Manihot esculenta Crantz)作为重要的热带作物,是全球六大粮食作物之一,并为全球近七亿人口提供主粮,然而病毒侵染引起的病害在全球范围内严重威胁木薯产业的发展。木薯花叶病毒病(cassava mosaic disease,CMD)是最有威胁的病害之一,造成严重的经济损失。斯里兰卡木薯花叶病毒(SriLankancassavamosaicvirus,SLCMV)是引发木薯花叶病的病原物之一,SLCMV是典型的双组分双生病毒,其基因组由DNA-A和DNA-B两个环状组分组成。无义介导的mRNA降解(nonsense-mediatedmRNAdecay,NMD)是真核细胞mRNA降解的主要途径之一,也是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。越来越多的研究显示,NMD不仅是真核生物重要的mRNA数量、质量调控机制,还与转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)同样能降解病毒RNA,是真核生物普遍存在的抗病毒防御机制。NMD的mRNA衰减过程包括PTC的识别、脱腺苷酸、脱帽和最后的核酸外切酶降解4个过程,UPF1、PARN、DCP2和XRN4分别是上述4个过程中的关键蛋白。病毒是专性寄生生物,必须逃避或耐受寄主细胞的降解,才能成功感染。聚腺苷酸特异性核糖核酸酶[poly(A)-specific ribonuclease,PARN]是NMD信号通路的一个关键因子。目前,关于SLCMV抵御寄主NMD的分子机制尚不明确。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system)和荧光双分子互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验证明斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV)编码的沉默抑制子AC4与拟南芥PARN相互作用。据此推测SLCMV AC4蛋白可能通过与AtPARN相互作用而抑制寄主NMD的病毒防御功能帮助病毒逃避或耐受寄主细胞的降解。研究结果为阐明木薯花叶病毒调控寄主NMD抗病毒防御功能的分子机理奠定基础。 展开更多

关键词 斯里兰卡木薯花叶病毒(SLCMV) AC4蛋白 聚腺苷酸特异性核糖核酸酶(PARN) 酵母双杂交(Y2H) 荧光双分子互补(bifc)

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受青枯菌诱导的花生根酵母双杂交文库构建和AhRRS5互作蛋白的筛选 被引量：12

12

作者 陈玉婷 刘露 +6 位作者 楚盼盼 魏嘉贤 钱慧娜 陈华 蔡铁城 庄伟建 张冲 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第11期2134-2146,共13页

前期研究报道超表达花生AhRRS5基因能够显著提高烟草抗青枯病水平,为进一步探究NBS-LRR类抗病蛋白AhRRS5在花生应答青枯菌胁迫的信号通路,本研究在构建花生受青枯菌诱导的根部组织均一化三框文库的基础上,通过酵母双杂交技术筛选AhRRS5... 前期研究报道超表达花生AhRRS5基因能够显著提高烟草抗青枯病水平,为进一步探究NBS-LRR类抗病蛋白AhRRS5在花生应答青枯菌胁迫的信号通路,本研究在构建花生受青枯菌诱导的根部组织均一化三框文库的基础上,通过酵母双杂交技术筛选AhRRS5的互作蛋白。通过改良的CTAB法提取青枯菌诱导后不同时间点的花生根部组织样品总RNA,分离纯化mRNA并合成双链cDNA,并基于同源重组方法分别构建酵母双杂交初级和次级文库。构建的酵母双杂交次级cDNA文库库容为1.44×10^(7) cfu mL^(-1),重组率为100%,插入片段大小在1000 bp以上。通过酶切连接法构建pGBKT7-AhRRS5诱饵载体,在酵母细胞中无自激活和毒性活性,与酵母双杂交文库共转酵母Y2H Gold菌株后,经多次筛库和回转验证,最终获得12个候选互作蛋白,这些蛋白涉及到植物生长发育、能量代谢、激素信号转导、胁迫响应等多个方面。通过双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)验证了AhSBT1.6和AhRRS5的体内互作。转录组数据显示,花生AhSBT1.6基因在不同组织中表达差异显著;实时荧光定量PCR显示,该基因在抗青枯病花生品种中受青枯菌诱导上调表达,推测AhSBT1.6可能参与调控花生青枯病抗性。研究结果为进一步研究NBS-LRR类抗病蛋白AhRRS5和互作蛋白在花生青枯病抗性防御的作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 花生 青枯病 酵母双杂交 互作蛋白 AhSBT1.6 双分子荧光互补

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ZmJAZ与ZmMYC2的BiFC互作研究 被引量：3

13

作者 吕迪 陈茹梅 周晓今 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第1期77-85,共9页

JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要。通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成... JAZ(jasmonate ZIM-domain)蛋白是茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径中关键的负调控因子,明确JAZ蛋白和MYC2之间的结合关系对整个JA信号通路至关重要。通过qRT-PCR筛选了在籽粒中较特异表达的ZmJAZ4、生殖器官中高表达的ZmJAZ8以及组成型表达的ZmJAZ12,利用玉米叶肉细胞原生质体瞬时表达体系,通过亚细胞定位和双分子荧光互作(bimolecular fluorescence complementation)研究了这些JAZ蛋白的定位以及是否可以与ZmMYC2相互作用。研究结果发现ZmJAZ4、ZmJAZ8和ZmJAZ12均定位于细胞核,同时BiFC结果显示这些JAZ蛋白都可与ZmMYC2在细胞核中相互作用,证实了ZmJAZ家族蛋白可与JA信号通路关键转录因子ZmMYC2结合的功能,提示它们可通过与ZmMYC2的结合影响其转录调控活性。 展开更多

关键词 茉莉酸 JAZ蛋白 MYC2转录因子 双分子荧光互作(bifc)

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利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系 被引量：4

14

作者 严茗 黄兵 +6 位作者 赵其平 韩红玉 朱顺海 赵宗平 陈婷 吕凌 董辉 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2019年第4期32-38,共7页

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E t... 为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。 展开更多

关键词 柔嫩艾美耳球虫 顶膜抗原1 棒状体颈部蛋白2 双分子荧光互补技术 互作蛋白

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楸子叶片酵母文库构建及甘油二酯激酶MpDGK7互作蛋白鉴定 被引量：1

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作者 冷凇凝 谭延肖 +3 位作者 张煜 吴玉森 韩双 陈晓乐 《核农学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1691-1698,共8页

为探究MpDGK7参与调控苹果对非生物胁迫响应的机制,本研究通过构建苹果属植物楸子(Malus prunifolia)叶片的酵母双杂交cDNA文库,筛选与甘油二酯激酶MpDGK7互作的蛋白并进行验证。结果显示,本研究构建的cDNA文库库容达到1.5×107 CFU... 为探究MpDGK7参与调控苹果对非生物胁迫响应的机制,本研究通过构建苹果属植物楸子(Malus prunifolia)叶片的酵母双杂交cDNA文库,筛选与甘油二酯激酶MpDGK7互作的蛋白并进行验证。结果显示,本研究构建的cDNA文库库容达到1.5×107 CFU,重组率100%,平均插入片段长度大于1200 bp。利用MpDGK7构建诱饵载体pBT3-N-MpDGK7,质粒无毒性且不存在自激活,通过共转化方法从文库中筛选到13个与MpDGK7互作的蛋白。选取4个代表性互作蛋白(KAN4、MYC2、BTB/POZ和金属硫蛋白)进行点对点验证,发现它们均与MpDGK7发生互作。双分子荧光互补(BiFC)验证结果表明,MpKAN4与MpDGK7互作主要发生在细胞膜和细胞核上,MpBTB与MpDGK7互作主要发生在细胞膜上。因此,推测MpDGK7可能通过参与KAN4、MYC2、BTB/POZ和金属硫蛋白等介导的胞内信号转导过程来影响苹果对逆境胁迫的响应。本研究结果为进一步阐明DGK基因参与苹果抗逆分子调控的机理奠定了基础。 展开更多

关键词 苹果 MpDGK7 酵母双杂交 双分子荧光互补 蛋白互作

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DdSOC1基因调控德阳柿成花分子机制

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作者 万建琦 丁瑜 +4 位作者 任晗 李雯霞 杨勇 黄金盟 关长飞 《果树学报》 北大核心 2025年第2期276-287,共12页

【目的】探究DdSOC1基因调控德阳柿(Diospyros deyangensis)成花的分子机制。【方法】通过生物信息学、基因表达量分析、酵母双杂筛库和双杂互作验证等方法,解析DdSOC1基因在调控成花中的功能。【结果】德阳柿DdSOC1序列和君迁子DlSOC1... 【目的】探究DdSOC1基因调控德阳柿(Diospyros deyangensis)成花的分子机制。【方法】通过生物信息学、基因表达量分析、酵母双杂筛库和双杂互作验证等方法,解析DdSOC1基因在调控成花中的功能。【结果】德阳柿DdSOC1序列和君迁子DlSOC1序列遗传距离较近;在成花诱导过程中,DdSOC1在茎、叶、芽中随开花进程出现差异表达;基于柿酵母文库,筛选获得7个DdSOC1的互作蛋白(MIOX、AGL14、JOINTLESS、GL2、NOVEIN、NBS、UBC7),酵母双杂交和双分子荧光互补试验表明,DdSOC1和上述7个蛋白均互作;qRT-PCR结果显示,一年生已开花的德阳柿SOC1、AGL14、JOINTLESS、NOVEIN、GL2、UBC7、NBS的表达量,幼叶高于成龄叶;二年生实生苗中,SOC1表达量差异不大,而AGL14、JOINTLESS、GL2、UBC7、MIOX表达量在开花实生苗中的表达量高于未开花实生苗。【结论】DdSOC1及其互作蛋白在德阳柿成花转变中发挥着重要作用,为探究德阳柿短童期分子调控网络提供了更多理论依据。 展开更多

关键词 德阳柿 DdSOC1 互作蛋白 酵母双杂交 双分子荧光互补 实时荧光定量分析

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水稻条纹病毒NS3蛋白与水稻3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)间的互作 被引量：3

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作者 肖冬来 贾东升 +4 位作者 吴建国 杜振国 谢荔岩 吴祖建 谢联辉 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期493-496,共4页

水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)NS3蛋白为病毒的沉默抑制子。利用酵母双杂交技术,从水稻cDNA文库中筛选出一个与RSV NS3蛋白互作的基因片段。推测该基因的功能是编码水稻3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge... 水稻条纹病毒(rice stripe virus,RSV)NS3蛋白为病毒的沉默抑制子。利用酵母双杂交技术,从水稻cDNA文库中筛选出一个与RSV NS3蛋白互作的基因片段。推测该基因的功能是编码水稻3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。双分子荧光互补实验进一步验证了NS3与GAPDH存在互作。瞬时表达实验表明,GAPDH与GFP基因融合蛋白在本氏烟表皮细胞细胞质中大量积累。此外,讨论了GAPDH蛋白在RSV侵染水稻过程中可能的功能。 展开更多

关键词 水稻条纹病毒 蛋白功能 互作 酵母双杂交 双分子荧光互补

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烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用 被引量：3

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作者 刘敏 顾志敏 《安徽农业科学》 CAS 2014年第16期5002-5006,共5页

[目的]获得高产量的烟草叶片原生质体。[方法]在前人的基础上,在酶浓度和酶解时间上,对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索;并以此为基础,通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用。[结果]在纤... [目的]获得高产量的烟草叶片原生质体。[方法]在前人的基础上,在酶浓度和酶解时间上,对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索;并以此为基础,通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用。[结果]在纤维素酶浓度为1.3%,离析酶浓度为0.4%,果胶酶浓度为0.3%,酶解4 h,酶解温度28℃,并在简易纯化的条件下制备原生质体,所得到的完整原生质体产量最高,并且细胞碎片和杂质均最少。[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考。 展开更多

关键词 烟草(Nicotiana benthamiana) 原生质体制备 双分子荧光互补试验 蛋白互作

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拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

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作者 张小红 许鹏博 +4 位作者 郭萌萌 徐兆师 李连城 陈明 马有志 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1952-1961,共10页

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较... 拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100μmol L–1Al3+处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。 展开更多

关键词 G蛋白 泛素分离系统 蛋白互作 铝离子胁迫 双分子荧光互补

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玉米质体型AGPase小亚基和糖酵解关键酶PPDK1互作关系的研究

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作者 崔喜艳 王阔 +4 位作者 张继晓 鹿丹 范贝 尹悦佳 刘相国 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第7期47-52,60,共7页

【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转... 【目的】利用双分子荧光互补(BiFC)技术,在烟草叶肉细胞中分析玉米ADP-葡萄糖焦磷酸化酶质体型小亚基(AGPase-bt2)与丙酮酸磷酸双激酶(PPDK1)之间的相互作用。【方法】构建326-CYCHA-AGPase-bt2和326-CYNEE-PPDK1双分子荧光表达载体,转化农杆菌EHA105,瞬时浸染烟草叶肉细胞,激光共聚焦显微镜下观察AGPase-bt2和PPDK1的相互作用。【结果】双酶切试验表明,326-CYCHA-AGPase-bt2、326-CYNEE-PPDK1载体构建正确;PCR结果证实,植物表达载体成功转化到农杆菌EHA105中;浸染烟草叶片后,AGPase-bt2和PPDK1在叶肉细胞中高效表达,出现BiFC荧光信号。【结论】AGPase-bt2和PPDK1在植物细胞内存在真实互作关系。 展开更多

关键词 AGPase-bt2 PPDK1 双分子荧光互补技术 蛋白质互作

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