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猪细小病毒NS1蛋白单链抗体库的构建及筛选
1
作者 张丽萌 李闰婷 +6 位作者 宋月 聂晓宁 孔莉 单靖微 许盈盈 王林青 陈龙欣 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第7期3276-3285,共10页
【目的】筛选特异性抗猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)非结构蛋白NS1的单链抗体(scFv),为后续研究PPV奠定基础。【方法】通过原核表达系统诱导表达并纯化PPV NS1蛋白,利用重组NS1蛋白进行动物免疫,检测血清效价水平后,采集小鼠脾脏... 【目的】筛选特异性抗猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)非结构蛋白NS1的单链抗体(scFv),为后续研究PPV奠定基础。【方法】通过原核表达系统诱导表达并纯化PPV NS1蛋白,利用重组NS1蛋白进行动物免疫,检测血清效价水平后,采集小鼠脾脏提取总RNA并逆转录成cDNA,以其为模板扩增抗体重链可变区(variable domain of heavy chains,VH)和轻链可变区(variable domain of light chains,VL)序列;通过重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,将其与酶切的pSEXRTL2噬菌体载体连接并电转化大肠杆菌XLⅠ-Blue感受态细胞,构建鼠源性抗PPV NS1的scFv抗体文库,并测定文库质量及库容量;利用噬菌体展示技术筛选对NS1蛋白具有特异性的scFv,通过ELISA和Western blotting检测抗原与阳性噬菌体克隆的亲和力。【结果】本试验成功表达纯化获得可溶性PPV NS1重组蛋白;构建的鼠源抗NS1 scFv文库的库容量为2.7×10^(7) CFU/mL,文库阳性率为87.5%;通过4轮“吸附-洗脱-富集”噬菌体筛选,最终获得2株与PPV NS1蛋白特异性结合的亲和力较高的scFv。【结论】本研究通过原核表达纯化重组蛋白NS1,成功构建鼠源抗PPV NS1蛋白的scFv噬菌体文库,利用噬菌体展示技术筛选获得了可与NS1重组蛋白特异性结合的scFv。试验结果为进一步研发抗PPV药物及诊断试剂提供依据。 展开更多
关键词 猪细小病毒(PPV) 单链抗体(scfv) NS1蛋白 噬菌体文库
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人源性抗SARS-CoV-2单链抗体文库的构建及广谱中和抗体的筛选与鉴定
2
作者 尹慧敏 吕海 +3 位作者 迟莹 刘静娴 焦永军 卫平民 《细胞与分子免疫学杂志》 北大核心 2025年第2期154-160,共7页
目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA... 目的构建人源性抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)单链可变片段(scFv)抗体文库,并筛选具有广谱中和活性的抗体,为诊断和治疗制剂的开发提供候选分子。方法从新型冠状病毒感染康复者外周血中分离单个核淋巴细胞(PBMC),提取总RNA,逆转录成cDNA,以此为模板构建人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库;利用噬菌体展示技术筛选对SARS-CoV-2 S蛋白具有特异性的scFv抗体。通过序列分析和人源IgG抗体表达,合成IgG全抗体,并评估其对SARS-CoV-2的结合能力及中和活性。结果成功构建了库容量为1.56×10^(7)CFU的SARS-CoV-2人源性scFv抗体文库,筛选出两种特异性scFv抗体;并将scFv抗体表达成IgG形式的全抗体(IgG-A10和IgG-G6),其中IgG-A10对SARS-CoV-2原始株(WT)和奥密克戎亚型变异毒株XBB(XBB)毒株均具有较好中和活性,对奥密克戎BA.2.86变异株的第二代亚分支JN.1(JN.1)毒株中和效果一般。结论本研究从康复者外周血中成功构建了人源性抗SARS-CoV-2 scFv抗体文库,并筛选表达出具有中和活性的抗SARS-CoV-2 IgG抗体,为SARS-CoV-2感染的预防、诊断和治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 SARS-CoV-2 单链可变片段(scfv) 噬菌体展示技术 中和抗体
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抗犬瘟热病毒犬源化嵌合单链抗体scFv-Fc的制备与活性分析
3
作者 刘雅坤 毕振威 +6 位作者 夏兴霞 莫菲 徐司雨 钱晶 谭业平 诸玉梅 赵建军 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5762-5773,共12页
为减少和改善鼠源单克隆抗体在犬临床治疗中的异源性和功效,用RT-PCR方法从分泌抗犬瘟热病毒(CDV)中和单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞中扩增抗体重链可变区(V H)和轻链可变区(V L),通过Linker将V H和V L连接获得单链抗体(scFv)基因,选择犬... 为减少和改善鼠源单克隆抗体在犬临床治疗中的异源性和功效,用RT-PCR方法从分泌抗犬瘟热病毒(CDV)中和单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞中扩增抗体重链可变区(V H)和轻链可变区(V L),通过Linker将V H和V L连接获得单链抗体(scFv)基因,选择犬源抗体IgG B恒定区(Fc)连接到scFv的C末端获得犬源化嵌合单链抗体(scFv-Fc)基因;分别构建鼠源scFv与犬源化scFv-Fc的原核表达载体,通过大肠杆菌表达、纯化,用ELISA、IPMA、细胞融合抑制和中和试验检测表达抗体的特异性和中和活性。结果显示:CDV鼠源scFv、犬源化scFv-Fc的ELISA最低检出浓度分别为14.38和102.75μg·mL^(-1);与表达的CDV H蛋白和CDV均发生特异性反应;能够抑制CDV H和F蛋白介导的细胞膜融合,完全保护细胞不出现病变的最低浓度分别为0.72和0.64μg·mL^(-1)。本研究成功制备了鼠源scFv与犬源化scFv-Fc嵌合抗体,为犬瘟热的临床治疗提供了候选抗体药物。 展开更多
关键词 犬瘟热病毒 中和活性 单链抗体 嵌合抗体
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抗黄曲霉毒素B1单链抗体(scFv)库的建立和筛选 被引量：4
4
作者 庄振宏 李兰 +4 位作者 孙宪连 张新艳 单超 汪世华 王宗华 《热带作物学报》 CSCD 2009年第1期64-69,共6页
从抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体细胞系中扩增到重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),经PCR将VH、Linker和VL连接成单链抗体(scFv),并克隆到载体pCANTAB-5E,经电转化大肠杆菌TG1,构建了库容量为1×108的单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感... 从抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体细胞系中扩增到重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),经PCR将VH、Linker和VL连接成单链抗体(scFv),并克隆到载体pCANTAB-5E,经电转化大肠杆菌TG1,构建了库容量为1×108的单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到客容量为1×108的噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗-富集-扩增"4轮以后,得到针对AFB1特异性的噬菌体抗体。进一步以噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在细菌细胞周质中可溶性大量表达,最终经竞争ELISA分析表明获得了3株可以稳定分泌抗黄曲霉毒素B1 scFv菌株,分别命名为3C3、3B3和4A2。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素B1 单链抗体 抗体库 抗黄曲霉毒素B1 scfv菌株
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抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFv-M97基因克隆及分泌性表达 被引量：8
5
作者 周春水 江敏 +1 位作者 徐琳娜 甄永苏 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 1998年第2期81-88,共8页
目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。... 目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体。结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732bp。其中V_H351bp,编码117个氨基酸;V_L336bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gl_(y_4)Ser)_3相连。阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20h,培养液上清中有2μg/ml可溶性单链抗体。免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力。结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 单链Fv抗体 基因克隆 表达 肿瘤侵袭 肿瘤转移
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卵巢癌抗独特型单链抗体3D_5ScFv的高效表达 被引量：2
6
作者 昌晓红 刘蓓 +5 位作者 李艺 程洪艳 付天云 叶雪 冯捷 崔恒 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期810-814,共5页
对 3D5卵巢癌抗独特型单链抗体进行原核系统的高效表达 .采用DNA重组技术 ,将 3D5ScFv克隆到原核表达载体pTMF中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;IPTG诱导表达 ,SDS PAGE鉴定蛋白质的分子量约为 2 8kD ;通过直接ELISA、竞争抑制实验... 对 3D5卵巢癌抗独特型单链抗体进行原核系统的高效表达 .采用DNA重组技术 ,将 3D5ScFv克隆到原核表达载体pTMF中 ,重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ;IPTG诱导表达 ,SDS PAGE鉴定蛋白质的分子量约为 2 8kD ;通过直接ELISA、竞争抑制实验和Western印迹分别检测其活性 .3D5ScFv以包涵体的形式获得高效表达 ,占菌体总蛋白 36 % ,变性复性后蛋白的纯度大于 90 % ,表达蛋白能与卵巢癌抗体OC12 5特异性结合 ,并能有效抑制卵巢癌抗原CA 12 5与卵巢癌抗体OC 12 5的特异性的结合 .3D5ScFv在原核系统中获得了高效表达 ,并具有较好的活性 。 展开更多
关键词 抗独特型抗体 单链抗体 卵巢癌 高效表达
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斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库的构建及初步鉴定 被引量：1
7
作者 王辉 邹世平 《湖北农业科学》 北大核心 2011年第24期5239-5242,5249,共5页
以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料,取其新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和轻链cDNA,以纯化的VH、VL基因为模板,以与VH基因3′-端和VL基因-5′端序列互补的Linker—Primer Mix为引物,将VH、VL随机... 以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料,取其新鲜外周血,分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和轻链cDNA,以纯化的VH、VL基因为模板,以与VH基因3′-端和VL基因-5′端序列互补的Linker—Primer Mix为引物,将VH、VL随机拼接为ScFv。通过酶切连接,依次将PCR产物插入质粒p3MH相应位点,热激法转化大肠杆菌XL1-Blue,加入辅助噬菌体VCSM 13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑点叉尾天然单链(ScFv)噬菌体抗体库成功构建为进一步筛选特异性抗体及从斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免疫治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 斑点叉尾 抗体库 噬菌体展示 抗体单链(scfv)
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抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体单链抗体ScFv的构建和表达 被引量：2
8
作者 付建芳 黄威权 +1 位作者 夏永娟 杨安钢 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期735-738,共4页
目的:克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法:从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,克隆该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-AL1,转... 目的:克隆抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体ScFv。方法:从分泌抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2F4)中提取总RNA,利用RT-PCR技术,克隆该抗体重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过基因重组构建VH-VL的表达载体pTAT-AL1,转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达。结果:VH基因序列全长369碱基对,编码123个氨基酸,VL基因序列全长339碱基对,编码113个氨基酸,二者均符合小鼠免疫球蛋白可变区基因特征,含有4个框架区(FRs)、3个抗原互补决定区(CDRs)及抗体特征性的两个半胱氨酸残基。ELISA测定显示基因工程抗体ScFv与原代抗体一样,具有较高的抗原亲和力。结论:成功构建了抗溶藻弧菌独特型抗体ScFv基因并表达于细菌壁膜间隙和包涵体中,为溶藻弧菌独特型抗体单链抗体ScFv成为新一代基因工程疫苗奠定了初步基础。 展开更多
关键词 溶藻弧菌 单链抗体 基因工程疫苗
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三肽囊素(Bursin)同功单链抗体(ScFv)的构建研究 Ⅰ.鸡脾脏组织细胞总RNA提取方法研究 被引量：1
9
作者 邬向东 曲悦 谌南辉 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 2003年第2期289-291,共3页
分离纯净、完整的细胞总RNA对于分子克隆的实验十分重要 ,但自然界中RNA酶广泛存在且稳定性很高 ,RNA极易被RNA酶污染而降解。快速提取RNA可以减少RNA酶污染的机会而成为RNA提取的首选方法。选用 3种快速RNA提取法 (方法I、II、III) ,... 分离纯净、完整的细胞总RNA对于分子克隆的实验十分重要 ,但自然界中RNA酶广泛存在且稳定性很高 ,RNA极易被RNA酶污染而降解。快速提取RNA可以减少RNA酶污染的机会而成为RNA提取的首选方法。选用 3种快速RNA提取法 (方法I、II、III) ,发现方法III最好 ,电泳可见 3个RNA条带清晰无降解 ,纯度也最高 ;方法II较差 ,虽然操作时间最短 ,但却易降解 ,而且电泳时多出一条明显的DNA条带 ;方法I也能提取到较好的RNA ,但纯度不如方法III。 展开更多
关键词 三肽囊素同功单链抗体 RNA 提取方法 组织细胞 RNA酶
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人源化抗肾小球基底膜抗体的单链抗体scFv3的原核表达及鉴定
10
作者 肖静 刘章锁 +2 位作者 王雅楠 赵国强 王沛 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期50-53,共4页
目的:在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3,并鉴定其活性。方法:用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因,将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接,构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性;测序检... 目的:在原核细胞中构建并表达抗肾小球基底膜(GBM)抗体单链抗体scFv3,并鉴定其活性。方法:用PCR扩增抗GBM抗体单链抗体scFv3基因,将scFv3 DNA与pGEM-T Easy质粒连接,构建克隆载体pGEM-scFv3。用酶切后电泳鉴定构建载体的正确性;测序检测质粒重组后序列有无改变。再将scFv3亚克隆入表达载体pQE-80L,构建pQE80L-scFv3重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta2,酶切鉴定。IPTG诱导表达蛋白后,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物的抗体活性。结果:PCR扩增scFv3 DNA片段约为750 bp,与预期结果相同;克隆载体pGEM-scFv3酶切后显示scFv3成功的克隆入pGEM-T Easy质粒;测序验证插入片段全序列无改变;表达载体pQE80L-scFv3酶切图谱与预期相同;SDS-PAGE显示,在分子量约为27 kD处可见目的蛋白带,Western blot证实scFv3能与抗GBM抗体结合。结论:成功构建并表达了抗GBM抗体的单链抗体scFv3蛋白,为进一步研究scFv3的生物学特性和基因工程抗体的制备奠定了基础。 展开更多
关键词 抗GBM抗体 单链抗体scfv3 原核表达 鉴定
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人源性抗地高辛单链抗体(scFv)及diabody的获取
11
作者 陈宇萍 张国民 +4 位作者 乔媛媛 王刚 刘玉峰 化冰 王琰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期710-713,共4页
目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody)。方法:以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序... 目的:从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛单链抗体(scFv),并构建双价抗体(diabody)。方法:以固相化的Dig对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,4轮后挑取集落,用ELISA法鉴定其特异性,并对抗Dig阳性抗体基因进行DNA指纹分析及测序分析。选取活性好的抗体基因进行改造,构建diabody。结果:在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得4株可与Dig特异性结合的人源单链抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同抗体基因,分泌抗Dig抗体的阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第1亚群,重链基因分别属于第3和第4亚群。选取4号克隆进行基因改造,构建diabody的表达载体,获得活性较好的diabody。结论:利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗Dig的抗体,并改造成应用前景较好的diabody,为临床诊断及治疗洋地黄类药物的中毒提供了具有实用价值的人源抗体。 展开更多
关键词 噬菌体抗体库 地高辛 单链抗体 双价抗体
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人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体的构建和表达
12
作者 李丙所 马龙洋 +3 位作者 周红兵 党军强 任彦顺 窦科峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期493-494,共2页
目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSectag2/scFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达。方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体pSectag2,构建重组载... 目的:构建人源肝癌单链抗体(scFv)基因真核表达载体pSectag2/scFv并在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中获得表达。方法:利用噬菌体细胞内重组技术筛选得到了肝癌特异性scFv,用PCR技术及核酸内切酶技术将其克隆入真核表达载体pSectag2,构建重组载体pSectag2/scFv,测序鉴定后,电转染CHO细胞,利用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达情况。结果:将750bp人源肝癌scFv插入真核表达载体pSectag2,经DNA测序鉴定正确,成功构建了pSectag2/scFv。将pSectag2/scFv转染CHO细胞后获得目的蛋白表达。SDS-PAGE和Western blot检测表明目的蛋白Mr约为34000。结论:成功地构建抗scFv真核表达载体pSectag2/scFv,并在CHO细胞中获得表达,为人源肝癌scFv的进一步的应用研究提供依据。 展开更多
关键词 肝癌 单链抗体 CHO细胞 基因表达
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人源抗乳腺癌单链抗体ScFv的基因克隆
13
作者 杨春 贾文祥 +2 位作者 邱岳 郑崛村 李学儒 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期587-588,共2页
乳腺癌的发病率在我国呈上升趋势.鼠源性单克隆抗体(mAb)抗不适用于人体, 而人源化mAb则在乳腺癌的诊断、靶向治疗中具有较高的应用价值[1,2].为此,我们从乳腺癌细胞体外致敏乳腺癌患者外周血中分离的淋巴细胞, 利用噬菌体抗体库技术克... 乳腺癌的发病率在我国呈上升趋势.鼠源性单克隆抗体(mAb)抗不适用于人体, 而人源化mAb则在乳腺癌的诊断、靶向治疗中具有较高的应用价值[1,2].为此,我们从乳腺癌细胞体外致敏乳腺癌患者外周血中分离的淋巴细胞, 利用噬菌体抗体库技术克隆了人抗体基因, 以期获得抗乳腺癌的人源化单链抗体. 展开更多
关键词 乳腺癌 单链抗体 PCR
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超抗原葡萄球菌肠毒素与抗人大肠癌单链抗体ND-1 scFv融合基因的构建、表达及活性分析
14
作者 陈航 李莉 方瑾 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期400-403,共4页
目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。N... 目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化。间接免疫荧光法检测融合蛋白的靶向结合活性,MTT法检测靶向杀伤效率。结果:成功构建了融合基因ND-1scFv/SEA,实现功能性表达,纯化的ND-1scFv/SEA融合蛋白与表达有ND-1相应抗原的大肠癌细胞CCL-187有高度亲和活性,通过激活外周血单核细胞,可特异性杀伤靶细胞,在4μg/mL浓度下对CCL-187的杀伤率达到91%,明显优于SEA的杀伤活性。结论:融合蛋白ND-1 scFv/SEA对大肠癌细胞CCL-187具有靶向结合和杀伤活性,为SEA用于靶向性的大肠癌治疗奠定了基础。 展开更多
关键词 ND-1单克隆抗体 单链抗体Fv 葡萄球菌肠毒素A 大肠癌
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抗人TNF-α单链抗体rScFvW13B1原核表达、纯化及功能鉴定
15
作者 骆群 潘纪春 +1 位作者 于洋 林周 《科学技术与工程》 2006年第23期4767-4769,共3页
应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体。将单链抗体W13B1基因克隆到PET32-c原核表达载体中,通过酶切及测序鉴定正确后,进行原核诱导表达并纯化,并检测纯化得到的单链抗体的功能。DNA琼脂糖凝胶电泳表明,单链抗体基因... 应用PET32-c原核表达载体快速、高效地表达及纯化单链抗体。将单链抗体W13B1基因克隆到PET32-c原核表达载体中,通过酶切及测序鉴定正确后,进行原核诱导表达并纯化,并检测纯化得到的单链抗体的功能。DNA琼脂糖凝胶电泳表明,单链抗体基因克隆成功;SDS-PAGE结果表明,单链抗体得到成功表达和纯化;ELISA和WesternBlot结果表明,单链抗体W13B1能够特异性结合人TNF-α。说明可成功地表达及纯化抗人TNF-α单链抗体rScFv-W13B1。 展开更多
关键词 单链抗体 原核表达 纯化
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HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析 被引量：2
16
作者 杨雄 刘秀侠 +2 位作者 南昊 许晓东 陈红英 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2014年第5期205-210,216,共7页
【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结... 【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体pETb12-scFv。将pETb12-scFv转入大肠杆菌BL21StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析;用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行分离纯化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测纯化蛋白与HIV-1gp120的结合活性。【结果】得到了b12的单链抗体基因b12-scFv,长度为768bp;SDS-PAGE电泳结果显示,b12-scFv表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体;纯化后蛋白的产量约为2mg/L;活性检测结果表明,b12-scFv对分泌表达和锚定在细胞膜表面的HIV-1gp120都具有良好的特异性结合活性。【结论】单链抗体b12-scFv可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测。 展开更多
关键词 HIV-1 单链抗体 B12 载体构建 亲和纯化 抗原结合活性
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表面等离子共振法测β-淀粉样多肽人源性单链抗体E3 scfv的亲和力 被引量：1
17
作者 解鹏 李玥 陈琪 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1389-1392,共4页
目的:采用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器测定β-淀粉样多肽(Ap)人源性单链抗体E3 scfv的亲和力。方法:将Aβ_(1-40)固定于传感芯片表面,以E3 scfv等抗体为流动相,实时监测抗原抗体的结合和解离过程,并对其... 目的:采用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)生物传感器测定β-淀粉样多肽(Ap)人源性单链抗体E3 scfv的亲和力。方法:将Aβ_(1-40)固定于传感芯片表面,以E3 scfv等抗体为流动相,实时监测抗原抗体的结合和解离过程,并对其相互作用模式和动力学常数进行分析。结果:E3 scfv、阳性对照抗体DE284均能与Aβ_(1-40)发生特异性免疫结合反应,阴性对照抗体9E10则不能结合Aβ_(1-40);Aβ_(1-40)与E3 scfv及DF284的结合呈现快结合慢解离的动力学过程,其中DE284与Aβ_(1-40)的亲和力为6.77×10^(-7)mol/L,E3 scfv的亲和力为5.38×10^(-6)mol/L。结论:SPR适宜用作测定E3 scfv与Aβ_(1-40)的亲和力。 展开更多
关键词 Β-淀粉样多肽 单链抗体 表面等离子共振 亲和力
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人源抗c-Met单链抗体腹腔注射可抑制A549肺腺癌荷瘤小鼠移植瘤生长
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作者 安然 刘明珠 +4 位作者 张露 彭上 甄翔程 闵静婷 李正红 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期549-555,共7页
目的 该实验旨在验证间质上皮转化单链抗体(Met scFv)在体内对皮下移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用。方法 建立裸鼠肿瘤模型,皮下注射A549肺腺癌细胞,成瘤后通过腹腔注射IRDye680 LT N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯标记的Met scFv,借助小动物成像仪进... 目的 该实验旨在验证间质上皮转化单链抗体(Met scFv)在体内对皮下移植瘤裸鼠的抗肿瘤作用。方法 建立裸鼠肿瘤模型,皮下注射A549肺腺癌细胞,成瘤后通过腹腔注射IRDye680 LT N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯标记的Met scFv,借助小动物成像仪进行实时监测以观察该抗体在荷瘤小鼠体内的动态分布情况,检测肿瘤组织细胞c-Met与抗体的亲和力,定期尾静脉注射Met scFv,观察肿瘤体积变化并绘制肿瘤生长曲线。免疫组织化学染色法检测Met scFv是否能有效结合肿瘤组织中的c-Met抗原。结果 裸鼠体内分布结果表明,在最初的3 h内,Met scFv主要分布于腹腔内。经过大约48 h,荧光信号开始在肿瘤组织中聚集。瘤体免疫组织化学染色结果显示,肿瘤组织中c-Met高表达;定期尾静脉注射Met scFv,可使小鼠瘤体生长明显减缓。结论 Met scFv在体内特异性识别肿瘤细胞且表现出显著的抗肿瘤活性。 展开更多
关键词 细胞间质上皮转化(c-Met) 单链抗体(scfv) 抗原识别 抗肿瘤活性
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日本血吸虫未成熟卵单链抗体库的构建、筛选及初步应用 被引量：13
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作者 何卓 汪世平 +4 位作者 肖小芹 曾少华 刘明社 李林 周帅锋 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第8期921-928,共8页
运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28k... 运用噬菌体展示技术构建日本血吸虫未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA)单链抗体(scFv)表达文库,以天然分子候选疫苗SIEA26～28ku为靶抗原筛选SIEA单链抗体库,获得特异性单链抗体.并将该scFv基因亚克隆至原核高效表达载体PET32a,诱导SIEA26～28ku特异性scFv大量表达.随后以此为探针筛选日本血吸虫尾蚴cDNA文库,以期获得SIEA26～28ku天然分子候选疫苗相关的编码基因.结果显示,所获得的SIEA26～28ku特异性scFv,表达量高,采用该探针初步筛选出相关基因核糖体蛋白S4.SIEA26～28ku特异性scFv的获得,为进一步筛选、分析鉴定抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗SIEA26～28ku的编码基因奠定了基础. 展开更多
关键词 日本血吸虫 未成熟虫卵可溶性抗原(SIEA) 单链抗体(scfv) 噬菌体展示抗体库 CDNA文库
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全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定 被引量：5
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作者 张倩倩 赵茜 +7 位作者 张晓 丁贵鹏 金秋 高畅 熊四平 陈玉平 朱进 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期927-931,共5页
目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scF... 目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。 展开更多
关键词 狂犬病病毒G蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体(scfv) 中和活性
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