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刚地弓形虫重组亚单位疫苗的研究进展
1
作者 罗心如 曹玉蝶 +4 位作者 李丹 汤新明 梁瑞英 李子彬 左宗辉 《中国兽医杂志》 北大核心 2025年第8期69-77,共9页
刚地弓形虫是一种重要的人兽共患寄生虫,在全球广泛分布,严重危害公共卫生安全和畜禽健康。弓形虫疫苗是防控弓形虫病的关键手段,目前重组亚单位疫苗以其安全、有效、易于生产和标准化的特点,展现出良好的应用前景。本文从弓形虫关键抗... 刚地弓形虫是一种重要的人兽共患寄生虫,在全球广泛分布,严重危害公共卫生安全和畜禽健康。弓形虫疫苗是防控弓形虫病的关键手段,目前重组亚单位疫苗以其安全、有效、易于生产和标准化的特点,展现出良好的应用前景。本文从弓形虫关键抗原靶点、免疫佐剂、动物模型、免疫途径和免疫剂量等方面,对当前弓形虫重组亚单位疫苗的研究进展和存在问题等进行综述,并提出未来可通过生物信息学手段设计多表位抗原、实施多抗原联合免疫策略及利用病毒载体递送系统实现重组蛋白的高效靶向递送,这些将是突破现存问题的关键途径,可为弓形虫重组亚单位疫苗的研究提供参考。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 重组亚单位疫苗 抗原 佐剂 动物模型
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弓形虫TR与ROP5双基因缺失株的构建及其生物学功能研究
2
作者 耿小玲 李瑞芳 +7 位作者 徐卫兵 杜晶莹 张曼玉 孙卿 蒋蔚 米荣升 陈兆国 王权 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3408-3422,共15页
为了探究弓形虫TR与ROP5在抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TR与ROP5双基因缺失株(TR-ROP5-KO)弓形虫。通过体外增殖、入侵及小鼠体内毒力试验发现,与RH株、TR基因缺失株(TR-KO)及ROP5基因缺失株(R... 为了探究弓形虫TR与ROP5在抗宿主ROS损伤中是否具有协同作用,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了TR与ROP5双基因缺失株(TR-ROP5-KO)弓形虫。通过体外增殖、入侵及小鼠体内毒力试验发现,与RH株、TR基因缺失株(TR-KO)及ROP5基因缺失株(ROP5-KO)相比,TR-ROP5-KO株在体外细胞中入侵、增殖能力及小鼠体内毒力作用减弱,表明弓形虫TR与ROP5基因双缺失不仅导致虫体在体外细胞中的生存活力减弱,还降低对宿主的毒力作用;通过检测TR/ROP5基因缺失株的氧化应激水平以及感染RAW264.7细胞的活性氧(ROS)水平发现,TR-ROP5-KO株引发的氧化应激水平虽然显著高于RH株(P<0.05),但与TR-KO株无显著差异(P>0.05);利用RT-qPCR检测TR/ROP5基因缺失株感染RAW264.7细胞的NF-κB、IL-12、IFN-γmRNA水平和ELISA检测小鼠血清中IL-12的水平发现,TR-ROP5-KO株感染组虽显著高于RH株感染组(P<0.05),但却未显著高于TR-KO株感染组(P>0.05),表明弓形虫的TR与ROP5在抗宿主ROS损伤中不存在协同作用。本研究构建TR与ROP5的双基因缺失株的方法探究两者在抗宿主ROS损伤中并无协同作用,为后续解析弓形虫多个基因功能的研究提供了方法依据,为弓形虫免疫逃避机制的研究提供了基础材料。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 CRISPR/Cas9 TR ROP5 ROS
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影响刚地弓形虫组织包囊体内外形成因素的研究进展 被引量：2
3
作者 徐丰慧 孟欣 崔平 《现代畜牧兽医》 2024年第3期86-90,共5页
在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)发育为成熟组织包囊(bradyzoites)和卵囊(sporozoites)的两个时期,传统上需要进行动物试验,这极大地阻碍了对这些阶段的形态和代谢的生物学研究,而此阶段对弓形虫的感染至关重要。因此,在研究组织包囊... 在刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)发育为成熟组织包囊(bradyzoites)和卵囊(sporozoites)的两个时期,传统上需要进行动物试验,这极大地阻碍了对这些阶段的形态和代谢的生物学研究,而此阶段对弓形虫的感染至关重要。因此,在研究组织包囊时利用体外诱导的方法成为研究的重要途径,近年来这方面的研究也取得了一些突破性进展。文章综述了影响组织包囊形成的因素,旨在为弓形虫病的研究、预防和控制提供参考。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 组织包囊 缓殖子分化 体内外诱导包囊
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核糖体蛋白RPS2对刚地弓形虫体外侵入小鼠巨噬细胞Ana-1功能的影响
4
作者 杨晨晨 齐玮瑜 +3 位作者 王晓娟 姜宇宸 李相辰 张莉 《中国预防兽医学报》 CSCD 北大核心 2024年第11期1174-1182,共9页
为研究刚地弓形虫核糖体蛋白RPS2(TgRPS2)对弓形虫侵入小鼠巨噬细胞Ana-1功能的影响,本研究采用系列分子生物学软件分析TgRPS2的生物信息学,通过PCR从弓形虫中扩增TgRPS2基因构建重组表达质粒pET32a-TgRPS2,经双酶切和测序鉴定正确后与p... 为研究刚地弓形虫核糖体蛋白RPS2(TgRPS2)对弓形虫侵入小鼠巨噬细胞Ana-1功能的影响,本研究采用系列分子生物学软件分析TgRPS2的生物信息学,通过PCR从弓形虫中扩增TgRPS2基因构建重组表达质粒pET32a-TgRPS2,经双酶切和测序鉴定正确后与pET-32a分别转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后采用镍柱亲和层析法纯化表达的重组TgRPS2蛋白(r TgRPS2)和空载体蛋白,采用SDS-PAGE检测两种蛋白的表达及纯化效果并经BCA法测定两种纯化蛋白的浓度。将r TgRPS2以300μg的剂量免疫小鼠6次,制备TgRPS2多克隆抗体(PAb),采用western blot鉴定r TgRPS2与弓形虫抗体、弓形虫可溶性蛋白与rTgRPS2 PAb的反应性。结果显示,分别在47.3 ku及18 ku处出现目的蛋白和空载体蛋白条带,且目的蛋白主要以包涵体的形式表达,空载体蛋白以上清形式表达,纯化后二者在相应位置均出现单一目的条带,测得rTgRPS2及空载体蛋白的浓度分别为1 949.54μg/mL和2 827.15μg/mL。Western blot结果显示,rTgRPS2能够与兔源弓形虫PAb反应,rTgRPS2 PAb也可以与弓形虫可溶性蛋白反应。将20μg/mL及不同浓度的rTgRPS2分别与小鼠巨噬细胞Ana-1共培养后,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测rTgRPS2与小鼠巨噬细胞Ana-1的结合;利用CCK-8试剂盒及流式细胞术分别检测不同浓度rTgRPS2对巨噬细胞增殖能力、吞噬能力及凋亡的影响,利用ELISA检测各组巨噬细胞中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10和转化生长因子β1(TGF-β1)的分泌水平,利用试剂盒检测各组巨噬细胞NO的含量。结果显示,rTgRPS2能够与小鼠巨噬细胞紧密结合,在细胞质中出现红色荧光,而阴性对照及Mock组细胞均无红色荧光。不同浓度的rTgRPS2对巨噬细胞的增殖均无影响。与空载蛋白对照组相比,不同浓度rTgRPS2作用后巨噬细胞Ana-1的吞噬能力均极显著增强(P<0.001);10μg/mL~40μg/mL的rTgRPS2作用后,巨噬细胞Ana-1的凋亡率均极显著升高(P<0.01、P<0.001);不同浓度的r TgRPS2作用后巨噬细胞中促炎细胞因子TNF-α的分泌水平显著和极显著升高(P<0.05、P<0.001),但促炎细胞因子IL-6的分泌水平无显著变化;5μg/mL和10μg/mL的rTgRPS2作用后巨噬细胞中抑炎细胞因子TGF-β1的分泌水平显著和极显著下降(P<0.05、P<0.01);40μg/mL和80μg/mL的rTgRPS2作用后巨噬细胞中抑炎细胞因子IL-10的分泌水平极显著升高(P<0.001);40μg/mL和80μg/mL的rTgRPS2作用后巨噬细胞中总NO的含量显著和极显著升高(P<0.05、P<0.01)。上述研究结果首次证实rTgRPS2有较强的反应原性,能够与巨噬细胞结合,促进巨噬细胞的吞噬能力与凋亡,并通过多种方式双向调节巨噬细胞的炎症反应及免疫应答方式。本研究为探究弓形虫体内感染巨噬细胞的免疫反应机制奠定基础,也为弓形虫疫苗抗原的筛选、亚单位疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 核糖体RPS2蛋白 原核表达 小鼠巨噬细胞 免疫功能
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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)不同地理株对钴^(60)丙线敏感性的比较研究
5
作者 干小仙 沈丽英 +2 位作者 袁行政 丁建祖 宋昌存 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 1998年第5期17-19,共3页
对中国NT株弓形虫和美国的ME—49株及TS—2株弓形虫的包囊进行了抗丙线耐受性的比较，试验采用上述三株弓形虫包囊为材料，分设0．4、0．5、0．6、0．7、1．OKGy丙线剂量组和不经照射处理的对照组。通过感染小鼠和幼猫的生物学检测，求... 对中国NT株弓形虫和美国的ME—49株及TS—2株弓形虫的包囊进行了抗丙线耐受性的比较，试验采用上述三株弓形虫包囊为材料，分设0．4、0．5、0．6、0．7、1．OKGy丙线剂量组和不经照射处理的对照组。通过感染小鼠和幼猫的生物学检测，求得使包囊丧失感染性的丙线剂量，得出不同株包囊对丙线的敏感性。结果表明：丙线控制中国NT株的最小有效剂量为0．55KGy，控制ME—49株和TS—2株的感染性的最小有效剂量为0．60KGy。两者接近，提示这三个地理株的弓形虫包囊对钴60丙线的敏感性虽略有差异，但其差异并不明显。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 辐照 丙线敏感性 钴60
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牛羊弓形虫屠宰检疫技术及处理措施
6
作者 郭洪然 李凤华 《中国畜牧业》 2025年第5期119-120,共2页
弓形虫病是牛羊养殖过程中常见的寄生虫性人畜共患病,并被列为二类动物疫病,主要由刚地弓形虫感染引起。刚地弓形虫是一种专性细胞内原虫,广泛分布于世界各地。牛羊作为弓形虫的中间宿主,感染后主要临床症状包括贫血、高热和繁殖障碍,... 弓形虫病是牛羊养殖过程中常见的寄生虫性人畜共患病,并被列为二类动物疫病,主要由刚地弓形虫感染引起。刚地弓形虫是一种专性细胞内原虫,广泛分布于世界各地。牛羊作为弓形虫的中间宿主,感染后主要临床症状包括贫血、高热和繁殖障碍,严重影响牛羊的生产性能。由于牛羊已成为常见的肉类来源,人们对牛羊肉的需求不断增加。然而,研究表明,弓形虫作为三大致死性食源性病原之一,其感染对人类健康构成严重威胁。食用含有弓形虫包囊的生肉、冷冻肉或未充分煮熟的肉被认为是人类弓形虫感染的主要途径,且人类通过食源途径感染弓形虫的致死率高达24%。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 人畜共患病 屠宰检疫 弓形虫感染 繁殖障碍 寄生虫性 弓形虫病 牛羊养殖
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刚地弓形虫peroxiredoxin基因的克隆表达与免疫原性分析 被引量：14
7
作者 刘转转 王海龙 +3 位作者 殷国荣 马广源 张建中 凡振伟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期334-337,共4页
目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PC... 目的对刚地弓形虫peroxiredoxin(TgPrx)基因进行克隆、表达和免疫原性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取总RNA;设计合成引物并引入EcoRI和XhoI酶切位点,RT-PCR扩增编码TgPrx的基因片段克隆到原核质粒pET30a(+)中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE进行鉴定,重组蛋白用Western blotting分析其免疫原性。结果从弓形虫RH株cDNA中扩增出591bp的TgPrx基因片段,并成功构建重组质粒pET30a(+)/TgPrx;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌BL21/DE3中高效表达。重组蛋白的相对分子量约32kDa,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结论RH株刚地弓形虫peroxiredoxin可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 PEROXIREDOXIN 克隆 原核表达 免疫原性
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刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文) 被引量：9
8
作者 张佃波 魏庆宽 +7 位作者 宰德富 崔勇 李瑾 高红刚 柏雪莲 赵立江 韩广东 刘克义 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期538-543,共6页
目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PC... 目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30和ROP2基因 融合蛋白 WESTERN blot.
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刚地弓形虫醛缩酶蛋白的表达及其多克隆抗体的纯化 被引量：8
9
作者 尹志奎 邓智建 郑斌 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第10期1114-1116,共3页
目的:体外制备弓形虫醛缩酶(aldolase)蛋白及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增醛缩酶基因,构建aldolase/pET30a原核表达系统;IPTG诱导表达aldolase-His6蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗... 目的:体外制备弓形虫醛缩酶(aldolase)蛋白及其多克隆抗体。方法:以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增醛缩酶基因,构建aldolase/pET30a原核表达系统;IPTG诱导表达aldolase-His6蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗体,亲和层析纯化并分析抗体的效价。结果:构建了aldolase原核表达系统,表达并纯化了aldolase-His6蛋白;获得了抗该蛋白的大鼠源性抗血清,纯化后的多克隆抗体效价为1∶4000。结论:在体外制备并纯化了aldolase-His6蛋白及其多克隆抗体,为后续研究aldolase的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 醛缩酶 蛋白表达 多克隆抗体
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刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌细胞ct26体外增殖和细胞周期的影响 被引量：6
10
作者 高剑 叶彬 +1 位作者 武卫华 孔璟 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1088-1092,共5页
目的研究刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖和细胞周期的影响,并探讨其作用的分子机制。方法取对数生长期的小鼠结肠癌ct26细胞,建立弓形虫与ct26复合感染度(moi)分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1的共培养试验模型... 目的研究刚地弓形虫RH株速殖子对小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖和细胞周期的影响,并探讨其作用的分子机制。方法取对数生长期的小鼠结肠癌ct26细胞,建立弓形虫与ct26复合感染度(moi)分别为1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、16∶1的共培养试验模型,台盼兰排斥试验连续7d绘制细胞生长曲线;流式细胞仪检测8∶1共培养模型组6h、12h、24h、48h细胞周期改变;采用半定量RT-PCR方法分别检测ct26细胞cyclinB1、cdc2基因转录水平变化;Westernblot方法检测细胞周期蛋白cyclinB1蛋白水平变化。结果台盼兰排斥试验发现各比例组弓形虫均能有效抑制小鼠ct26细胞的体外增殖,且呈现前4d缓慢抑制,4d后细胞大量死亡的现象,以8∶1模型组的增殖抑制作用最明显,感染7d后细胞抑制率达80.77%(P<0.01);流式细胞仪检测发现8∶1模型组弓形虫可在各作用时间明显改变ct26细胞周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高(P<0.01),24h达到作用高峰,使G2/M期百分比升高12.77%,48h则细胞G2/M期百分比下降;弓形虫感染ct26细胞3～24h,细胞cdc2转录水平在各个时间点未见明显变化,细胞cyclinB1从转录水平和蛋白水平均呈现为感染3h时表达增强,随后各时间点均明显降低的现象,cyclinB1基因转录水平在感染后24h只达到对照组的16.55%。结论弓形虫RH株速殖子可明显抑制小鼠结肠癌ct26细胞体外增殖,感染前期以诱导细胞发生G2/M期阻滞为主要机制,细胞周期蛋白cyclinB1活性下降在G2/M期阻滞中起主要作用。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 小鼠结肠癌ct26细胞 周期阻滞 细胞周期蛋白
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刚地弓形虫对HUVEC、Vero和J774A.1、THP-1侵入的比较研究* 被引量：6
11
作者 李立伟 邵浙新 严杰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期597-600,共4页
目的探讨刚地弓形虫对不同类型传代细胞的侵入能力和致凋亡作用及其差异。方法实验中采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)、小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)和人单核细胞系(THP-1)细胞株。采用透射电镜和吉姆萨染色法... 目的探讨刚地弓形虫对不同类型传代细胞的侵入能力和致凋亡作用及其差异。方法实验中采用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)、小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)和人单核细胞系(THP-1)细胞株。采用透射电镜和吉姆萨染色法,观察刚地弓形虫RH株侵入以上细胞的能力以及细胞骨架抑制剂秋水仙素、细胞松弛素D对其影响。用流式细胞术检测弓形虫引起的细胞凋亡。结果弓形虫RH株能侵入以上4种细胞,在胞内均有纳虫泡形成。其侵入率以J774A.1和THP-1略高。细胞骨架抑制剂细胞松弛素D可以明显降低速殖子对THP-1和J774A.1细胞的侵入率,对速殖子侵入HUVEC和Vero细胞的能力影响较小。弓形虫侵入HUVEC和J774A.1细胞均可不同程度地引起细胞凋亡和坏死,但前者以凋亡为主,后者以坏死为主。结论弓形虫可能通过不同的机制侵入非吞噬性细胞和吞噬性细胞。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 HUVEC THP-1 VERO J774A.1
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刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3的克隆与原核表达 被引量：4
12
作者 苟惠天 王艳华 +3 位作者 李文卉 李航 付宝权 张德林 《甘肃农业大学学报》 CAS CSCD 2008年第5期1-5,共5页
根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓... 根据Genbank中编码MIC3的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术对刚地弓形虫GJS株微线体蛋白基因MIC3进行克隆、表达及鉴定.结果表明:克隆的MIC3基因的开放阅读框与Genbank收录的MIC3基因在核菌酸和氨基酸水平上高度一致,说明弓形虫MIC3蛋白的高度保守性;构建的原核细胞表达质粒PET-MIC3表达产物分子量为46 ku,且经Western-blot显示可被猪抗弓形虫免疫血清识别. 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体 克隆 表达
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刚地弓形虫DXR基因的克隆表达与生物学特性分析 被引量：3
13
作者 章莹 宗红英 +1 位作者 何立 蔡国斌 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1091-1095,共5页
目的对刚地弓形虫1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(TgDXR)基因进行克隆、表达、纯化和生物学特性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取cDNA和基因组DNA;PCR扩增TgDXR的基因片段;构建成熟TgDXR/pET-24b重组原核表达载体;经双... 目的对刚地弓形虫1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(TgDXR)基因进行克隆、表达、纯化和生物学特性分析。方法收集、纯化RH株弓形虫速殖子,提取cDNA和基因组DNA;PCR扩增TgDXR的基因片段;构建成熟TgDXR/pET-24b重组原核表达载体;经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆;在大肠杆菌BL21中用IPTG诱导表达。亲和层析纯化重组TgDXR蛋白,并对该蛋白的生物学特性和酶的动力学活性进行分析。结果从弓形虫RH株的cDNA和基因组DNA中分别扩增出长度为1 542bp和5 464bp的TgDXR片段,成功构建重组质粒;SDS-PAGE结果表明,目的基因在大肠杆菌中高效表达。重组蛋白的相对分子量约50kDa。酶活性实验显示,Mg2+、Mn2+是最佳金属螯合离子,反应最佳pH值为7.5,该酶活性抑制剂膦胺霉素(Fosmidomycin)对该酶蛋白的IC50为0.52μmol/L。结论 RH株刚地弓形虫TgDXR可在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有生物学活性,并有望作为弓形虫特异性药物靶标。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 DXR 克隆表达 膦胺霉素
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刚地弓形虫P30两个不同片段的克隆、表达及鉴定 被引量：2
14
作者 褚宏亮 姚永伟 +5 位作者 芦王英 刘剑南 陈玲 侯敏 章子豪 张耀娟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期275-279,共5页
目的:构建刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因的2个不同片段的克隆并进行表达、鉴定。方法:根据已发表的弓形虫P30基因序列,参考有关文献设计合成两对引物,用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段,分别构建T-... 目的:构建刚地弓形虫(简称弓形虫)主要表面抗原P30基因的2个不同片段的克隆并进行表达、鉴定。方法:根据已发表的弓形虫P30基因序列,参考有关文献设计合成两对引物,用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出P30基因的两个不同片段,分别构建T-A克隆,经PCR扩增及酶切鉴定后,进行测序,再亚克隆入pMAL-p2质粒并转化DH5α感受态细胞,于氨苄青霉素LB平板上初步筛选阳性克隆,再经酶切及PCR扩增鉴定重组子。将重组子转入表达菌BL21,用IPTG进行诱导表达,并对所表达的蛋白以western blot鉴定。结果:成功构建相应的T-A克隆及pMAL-p2亚克隆,经诱导、表达和鉴定,证实2个表达产物均为目的蛋白,其分子量分别为70和73Ku。结论:成功获得弓形虫主要表面抗原P30的2个表达产物,为其进一步的纯化及应用奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30 克隆 表达
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刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达 被引量：2
15
作者 张理航 刘茂军 +4 位作者 吕芳 李贺侠 吴叙苏 冯志新 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第1期147-150,共4页
参考Genbank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)P30全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30基因片段,然后构建重组表达质粒pET-32 a(+)/P30,用IPTG诱导,在表达菌BL21(DE3)表达出分子量为4.83×10... 参考Genbank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)P30全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30基因片段,然后构建重组表达质粒pET-32 a(+)/P30,用IPTG诱导,在表达菌BL21(DE3)表达出分子量为4.83×104的融合蛋白,经W estern-b lotting鉴定目的蛋白具有良好的免疫学活性,为刚地弓形虫疫苗的制备及猪弓形虫抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 P30基因 克隆 表达
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刚地弓形虫NT株MIC3基因的克隆和原核表达 被引量：2
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作者 白昀 刘茂军 +5 位作者 冯志新 白方方 熊祺琰 孔猛 吴叙苏 邵国青 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2011年第6期1295-1299,共5页
为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除... 为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除信号肽的MIC3基因,将该基因克隆入pET-32a(+)表达载体,构建pET-32a(+)表达载体,并转化入大肠杆菌(Escherichia.coli)Trans 5α感受态细胞。扩增的MIC3基因与GenBank中相应基因序列(AF509564.1)的同源性达99.9%。将阳性重组表达质粒转化入E.coli BL21-codon plus,经IPTG20℃低温诱导表达,SDS-PAGE分析结果显示,MIC3融合蛋白分子量约为56 000。Western-blotting分析鉴定结果表明,MIC3融合蛋白可被猪抗弓形虫免疫血清所识别。获得的MIC3融合蛋白具有一定的反应原性,为下一步利用重组蛋白建立弓形虫的诊断方法和研制弓形虫的亚单位疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 MIC3基因 克隆 原核表达
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刚地弓形虫苹果酸脱氢酶基因编码蛋白主要特性与抗原表位的生物信息学分析 被引量：4
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作者 刘转转 杨燕萍 +1 位作者 郑葵阳 刘宜升 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期472-475,共4页
目的用生物信息学方法分析刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HNN、MotifScan和NCBI上的ORF finder、SignalP、Bcep... 目的用生物信息学方法分析刚地弓形虫苹果酸脱氢酶(TgMDH)基因编码蛋白的结构与抗原表位,预测该蛋白的免疫原性。方法利用蛋白分析专家系统(ExPASy)提供的ProtParam、SOSUI、TMPRED、HNN、MotifScan和NCBI上的ORF finder、SignalP、Bcepred等生物信息学在线分析程序,结合Gene Runner和DNAMAN等生物信息学软件,分析并预测TgMDH蛋白的开放阅读框、理化性质、可溶性、信号肽、跨膜区、表面可及性、可塑性、亲(疏)水性、翻译后修饰位点、二级结构及抗原表位,通过CPHmodels程序预测该蛋白的三维空间结构。结果 TgMDH蛋白由316个氨基酸组成,分子式为C1498H2454N402O440S20,分子质量单位为33 777.5,等电点为6.01,波长280nm时的吸光度(A)值为0.364,半衰期为30h,有9个表面可及性参数≥1.9的区域、4个亲水性参数得分≥1.9的区域、7个柔韧性参数得分≥2的区域、14个翻译后修饰位点和14个潜在抗原表位,为可溶性表达蛋白。结论 TgMDH基因编码蛋白为可溶性蛋白,有多个抗原表位,具有免疫原性,可作为弓形虫病疫苗候选抗原。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 苹果酸脱氢酶 生物信息学 抗原表位 免疫原性
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刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的克隆与表达 被引量：2
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作者 余南 何蔼 +6 位作者 郑小英 申川军 郑斌 郑焕钦 李卓雅 曹爱莲 詹希美 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第4期331-334,共4页
目的　克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体pET MMIC3,并在大肠杆菌BL2 1株中表达。方法　采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载... 目的　克隆编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,构建原核表达载体pET MMIC3,并在大肠杆菌BL2 1株中表达。方法　采用PCR技术从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码微线体蛋白MIC3成熟肽的基因,并克隆到T载体上,经测序鉴定后,将目的基因亚克隆到表达载体pET30a(+)上,构建质粒pET MMIC3。表达产物用Westernblot进行进一步确认。结果　经初步菌液PCR鉴定,提取质粒双酶切鉴定并测序,确认插入T载体的序列为所需的目的序列;亚克隆构建pET -MMIC3,转化到宿主菌大肠杆菌BL2 1,得到分子量为37.2kDa的重组表达蛋白,Westernblot的结果与预测相符。结论　成功的克隆并融合表达了刚地弓形虫RH株微线体蛋白MIC3成熟肽,为进一步研究其在弓形虫粘附和入侵中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 微线体 克隆 表达
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刚地弓形虫醛缩酶基因及其内含子的分析 被引量：3
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作者 余南 何蔼 +2 位作者 李卓雅 郑斌 詹希美 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2005年第7期580-583,共4页
目的刚地弓形虫醛缩酶是其速殖子入侵宿主细胞过程中的一个重要分子,本研究对该酶基因序列及其内含子进行实验和分析。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子基因组DNA和总RNA,采用PCR技术分别从基因组DNA和cDNA中扩增编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶... 目的刚地弓形虫醛缩酶是其速殖子入侵宿主细胞过程中的一个重要分子,本研究对该酶基因序列及其内含子进行实验和分析。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子基因组DNA和总RNA,采用PCR技术分别从基因组DNA和cDNA中扩增编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶的基因,并克隆到T载体上,经测序鉴定后对其基因组序列和cDNA序列进行比较分析。通过NCBI数据库资源对醛缩酶内含子的分布及大小进行比较分析。结果根据醛缩酶基因设计的引物从基因组DNA扩增得到的片段长度为1315bp,从cDNA扩增得到的片段为993bp。比对结果显示来源于基因组DNA的序列在对应于编码序列起始密码子下游109bp后有一个322bp的内含子。通过在线工具收集得到NCBI及EMBL数据库中来源于不同物种的32种醛缩酶数据,分析显示推断氨基酸序列具有保守性。结论编码刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)RH株果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因编码区内存在一个322bp的内含子。醛缩酶氨基酸序列保守性较高。内含子在不同进化等级之间插入位置数目及大小两方面均存在明显的增加趋势。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 果糖1 6-二磷酸醛缩酶 内含子
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刚地弓形虫对荷瘤小鼠肿瘤组织微血管生成的抑制作用 被引量：3
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作者 孔璟 高剑 +1 位作者 叶彬 武卫华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期522-525,共4页
目的观察刚地弓形虫感染对BALB/c小鼠ct26细胞皮下移植瘤血管生成的抑制作用及其作用机理。方法建立刚地弓形虫感染的小鼠结肠癌ct26皮下移植瘤模型,观察弓形虫感染对小鼠的生存延长率、对肿瘤的质量抑制率,并采用免疫组化方法检测弓形... 目的观察刚地弓形虫感染对BALB/c小鼠ct26细胞皮下移植瘤血管生成的抑制作用及其作用机理。方法建立刚地弓形虫感染的小鼠结肠癌ct26皮下移植瘤模型,观察弓形虫感染对小鼠的生存延长率、对肿瘤的质量抑制率,并采用免疫组化方法检测弓形虫感染对肿瘤组织MVD、VEGF、TSP-1表达的影响。结果弓形虫感染的小鼠生存时间比对照组长(P<0.05),生存延长率为57.45%,肿瘤质量抑制率为47.23%;弓形虫感染的小鼠肿瘤组织中MVD及VEGF表达水平低于对照组(P=0.005,P=0.03),TSP-1表达高于对照组(P=0.005)。结论弓形虫感染能抑制荷瘤小鼠肿瘤组织微血管生成;下调VEGF及上调TSP-1与弓形虫感染抗肿瘤血管生成有关。 展开更多
关键词 刚地弓形虫 肿瘤 血管生成 微血管密度 血管内皮生长因子 血小板反应素-1
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