目的:探讨微小核糖核酸(microRNA)-24(miR-24)对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节的分子机制及其对血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响。方法:构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根...目的:探讨微小核糖核酸(microRNA)-24(miR-24)对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节的分子机制及其对血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响。方法:构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据转染质粒将实验细胞分为:miR-24高表达组、miR-24干扰组和空白质粒对照组。用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测HUVECs增殖能力,划痕和Transwell试验检测细胞的迁移能力,人工基底膜检测细胞的管腔形成能力;分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测eNOS和Sp1转录因子m RNA和蛋白表达水平。结果:(1)与空白质粒对照组比较,miR-24高表达组细胞增殖能力降低45.45%(0.36±0.04 vs 0.66±0.08,P<0.05);miR-24高表达组细胞迁移速度明显减缓,且迁移数目降低74.75%(30.25±3.78 vs 119.80±10.94,P<0.01),未能形成明显管腔样结构。(2)与空白质粒对照组比,miR-24高表达组eNOS m RNA降低46.2%(0.49±0.02vs 0.91±0.01,P<0.05),蛋白表达减少49.07%(0.55±0.05 vs 1.08±0.05,P<0.05);同时Sp1 m RNA降低44.9%(0.49±0.01 vs 0.89±0.02,P<0.05),其蛋白质表达量也相应减少54.90%(0.46±0.02 vs 1.02±0.04,P<0.05)。在miR-24抑制组中,上述指标较空白质粒对照组降低,但比miR-24高表达组显著升高,特别是小管形成数量、及管腔长度与空白质粒对照组相近。结论:miR-24显著抑制HUVECs的增殖、迁移和管腔形成的能力,并且与miR-24对eNOS的表达调控有关;miR-24明显抑制eNOS表达,Sp1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。展开更多
目的探讨氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)对剪切力诱导的人主动脉内皮细胞(HAEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。方法将HAEC分为对照组和实验组,2组均采用精密输液泵施加剪切力,实验组同时给予oxLDL 100μg/ml共刺激。2组根据剪切力施...目的探讨氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)对剪切力诱导的人主动脉内皮细胞(HAEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。方法将HAEC分为对照组和实验组,2组均采用精密输液泵施加剪切力,实验组同时给予oxLDL 100μg/ml共刺激。2组根据剪切力施加梯度,又各分为3个亚组:无剪切力组(n=5)、低剪切力组(n=5)和高剪切力组(n=5),剪切力分别为0、4、15dyn/cm2(1dyn/cm2=0.1Pa)。采用RT-PCR及Western blot技术检测eNOS mRNA和蛋白的表达,采用硝酸盐还原酶法测定NO含量。结果实验组、对照组的NO、eNOS mRNA和eNOS蛋白的表达量低剪切力组明显低于无剪切力组,高剪切力组明显高于无剪切力组和低剪切力组;实验组无剪切力组、低剪切力组及高剪切力组NO[(1.09±0.33)μmol/L vs(2.27±0.90)μmol/L、(0.20±0.08)μmol/L vs(0.71±0.36)μmol/L、(3.03±0.71)μmol/L vs(4.93±1.16)μmol/L]、eNOS mRNA(0.65±0.20 vs 1.11±0.32、0.22±0.13 vs 0.49±0.22、1.05±0.22 vs 1.90±0.56)和eNOS蛋白(0.50±0.19 vs 1.10±0.26、0.18±0.52 vs 0.62±0.19、1.07±0.20 vs 1.70±0.38)的表达量均明显低于对照组相同亚组,低剪切力组NO下降率明显高于无剪切力组,高剪切力组eNOS蛋白、eNOS mRNA和NO下降率明显低于低剪切力组。结论 oxLDL可削弱高梯度剪切力诱导的内皮细胞活性,也可加剧低梯度剪切力诱导的内皮细胞功能紊乱。展开更多
文摘目的:探讨微小核糖核酸(microRNA)-24(miR-24)对内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达调节的分子机制及其对血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成能力的影响。方法:构建miR-24及其反义序列的高表达质粒,分别转染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据转染质粒将实验细胞分为:miR-24高表达组、miR-24干扰组和空白质粒对照组。用四甲基偶氮唑盐(MTT)检测HUVECs增殖能力,划痕和Transwell试验检测细胞的迁移能力,人工基底膜检测细胞的管腔形成能力;分别用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测eNOS和Sp1转录因子m RNA和蛋白表达水平。结果:(1)与空白质粒对照组比较,miR-24高表达组细胞增殖能力降低45.45%(0.36±0.04 vs 0.66±0.08,P<0.05);miR-24高表达组细胞迁移速度明显减缓,且迁移数目降低74.75%(30.25±3.78 vs 119.80±10.94,P<0.01),未能形成明显管腔样结构。(2)与空白质粒对照组比,miR-24高表达组eNOS m RNA降低46.2%(0.49±0.02vs 0.91±0.01,P<0.05),蛋白表达减少49.07%(0.55±0.05 vs 1.08±0.05,P<0.05);同时Sp1 m RNA降低44.9%(0.49±0.01 vs 0.89±0.02,P<0.05),其蛋白质表达量也相应减少54.90%(0.46±0.02 vs 1.02±0.04,P<0.05)。在miR-24抑制组中,上述指标较空白质粒对照组降低,但比miR-24高表达组显著升高,特别是小管形成数量、及管腔长度与空白质粒对照组相近。结论:miR-24显著抑制HUVECs的增殖、迁移和管腔形成的能力,并且与miR-24对eNOS的表达调控有关;miR-24明显抑制eNOS表达,Sp1的参与可能是这一调节过程的重要分子机制之一。
文摘目的探讨氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)对剪切力诱导的人主动脉内皮细胞(HAEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达的影响。方法将HAEC分为对照组和实验组,2组均采用精密输液泵施加剪切力,实验组同时给予oxLDL 100μg/ml共刺激。2组根据剪切力施加梯度,又各分为3个亚组:无剪切力组(n=5)、低剪切力组(n=5)和高剪切力组(n=5),剪切力分别为0、4、15dyn/cm2(1dyn/cm2=0.1Pa)。采用RT-PCR及Western blot技术检测eNOS mRNA和蛋白的表达,采用硝酸盐还原酶法测定NO含量。结果实验组、对照组的NO、eNOS mRNA和eNOS蛋白的表达量低剪切力组明显低于无剪切力组,高剪切力组明显高于无剪切力组和低剪切力组;实验组无剪切力组、低剪切力组及高剪切力组NO[(1.09±0.33)μmol/L vs(2.27±0.90)μmol/L、(0.20±0.08)μmol/L vs(0.71±0.36)μmol/L、(3.03±0.71)μmol/L vs(4.93±1.16)μmol/L]、eNOS mRNA(0.65±0.20 vs 1.11±0.32、0.22±0.13 vs 0.49±0.22、1.05±0.22 vs 1.90±0.56)和eNOS蛋白(0.50±0.19 vs 1.10±0.26、0.18±0.52 vs 0.62±0.19、1.07±0.20 vs 1.70±0.38)的表达量均明显低于对照组相同亚组,低剪切力组NO下降率明显高于无剪切力组,高剪切力组eNOS蛋白、eNOS mRNA和NO下降率明显低于低剪切力组。结论 oxLDL可削弱高梯度剪切力诱导的内皮细胞活性,也可加剧低梯度剪切力诱导的内皮细胞功能紊乱。
