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大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究 被引量:13
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作者 徐卉芳 张先恩 +2 位作者 张治平 张用梅 A.E.G.CASS 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第1期89-94,共6页
大肠杆菌碱性磷酸酶 (E .colialkalinephosphatase,EAP ,EC 3 1 3 1)是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶 .采用易错聚合酶链反应 (errorpronePCR)的方法 ,在原有高活力突变株的基础上 ,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化 ,经... 大肠杆菌碱性磷酸酶 (E .colialkalinephosphatase,EAP ,EC 3 1 3 1)是一个非特异性二聚体磷酸单酯酶 .采用易错聚合酶链反应 (errorpronePCR)的方法 ,在原有高活力突变株的基础上 ,对EAP远离活性中心催化三联体的区域进行定向进化 ,经两轮errorpronePCR ,获得催化活力较亲本D10 1S突变株提高 3倍、较野生型酶提高 35倍的进化酶 4 186 ,并对该酶的催化动力学特征进行了分析 .进化酶基因的DNA测序表明 4 186含两个有义氨基酸置换 :K16 7R和S374C ,二者既不位于底物结合位点 ,也不位于酶的金属离子结合位点 . 展开更多
关键词 大肠杆菌 碱性磷酸酶 体外定向进化 催化活力
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木聚糖酶基因的体外定向进化 被引量:3
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作者 杜文 王谦 +1 位作者 王佳堃 刘建新 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期2202-2211,共10页
木聚糖酶在天然材料中基因表达水平低、活性差、生产成本高,严重限制了它的推广应用。宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在开发微生物酶资源上具有强劲的优势。体外定向进化技术模拟达尔文的自然进化论,... 木聚糖酶在天然材料中基因表达水平低、活性差、生产成本高,严重限制了它的推广应用。宏基因组学通过免培养技术,研究生境中全部微小生物遗传物质的总和,在开发微生物酶资源上具有强劲的优势。体外定向进化技术模拟达尔文的自然进化论,利用基因的突变和重组,从体外改造酶基因,产生基因多样性,并结合定向的筛选最终获得预期性状的进化酶。宏基因组技术与体外定向进化技术结合必将加速木聚糖酶的开发和产业化应用,推动半纤维类生物能源的利用。为此,本文就木聚糖酶基因的来源、宏基因组学在木聚糖酶基因开发中的应用、体外定向进化进行了系统的综述。 展开更多
关键词 木聚糖酶基因 宏基因组学 体外定向进化
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DNA展示系统介导的断裂蛋白质内含子体外定向进化方法的研究
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作者 林森珠 陈格飞 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1121-1131,共11页
蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中... 蛋白质内含子对于外显子的选择性限制了它的应用范围。目前,已经建立的卡那霉素定向进化系统适用于微小蛋白质内含子,但不适用于断裂蛋白质内含子。为了研究适用于断裂蛋白质内含子的定向进化的方法,我们引入了DNA展示系统。在该系统中,生物素化基因在人工细胞中与其表达的融合蛋白(内含子C端-外显子-生物素结合蛋白)形成DNA-蛋白质连接体。只有能与后续加入的N端蛋白质内含子前体(Flag-内含子N端)发生剪接反应的DNA-蛋白质连接体,才能被加上旗帜标签(Flag),从而被抗旗帜标签抗体纯化柱(Anti Flag antibody M2 agarose)筛选富集。为了验证该系统的可行性,实验构建了2个基因,即含有具剪接活性的蛋白质内含子的阳性基因IRC和含有不具剪接活性的蛋白质内含子的阴性基因IRCM。实验首先通过Western印迹和琼脂糖凝胶电泳证明,人工细胞中的体外转录翻译系统不仅可高表达500个氨基酸的蛋白质,而且表达的蛋白中内含子仍保持原有的剪接能力。生物素结合蛋白能结合95%的DNA,并且形成的DNA-蛋白质连接体可以被筛选富集,最终证明了该系统用于断裂蛋白质内含子定向进化筛选的可行性。随后,为了检测系统的富集效率,制备了人为的基因"突变库",即将基因IRC和IRCM以摩尔比1:10的比例混合,经过2轮筛选后,阳性基因IRC可以被10倍富集,进一步证明了体外筛选方法的可行性。该方法为后续针对不同宿主进化出不同的断裂蛋白质内含子提供筛选方法支持,也为断裂蛋白质内含子的在生物技术和研究领域的应用奠定了基础。 展开更多
关键词 断裂蛋白质内含子 体外定向进化 DNA展示系统 人工细胞 转录翻译系统
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体外分子定向进化研究进展 被引量:28
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作者 徐卉芳 张先恩 +1 位作者 张用梅 A.E.G.CASS 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第4期518-522,共5页
体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略 ,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下 ,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选 ,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质 ,使几百万年的自然进化过程在短期内得... 体外定向进化作为近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略 ,可以在未知目标蛋白三维结构信息和作用机制的情况下 ,通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选 ,获得具有改进功能或全新功能的蛋白质 ,使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现 ,因而是发现新的生物活性分子和反应途径的重要方法 ,已在短短几年内取得了令人瞩目的成就 . 展开更多
关键词 分子定向进化 研究进展 分子进化 蛋白质工程 渐进切割法产生杂和酶 基因组进化
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典型POPs的生物降解修复技术研究与发展 被引量:6
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作者 吴海珍 韦朝海 周盛 《生态环境学报》 CSCD 北大核心 2012年第1期166-171,共6页
生物吸附与降解是解决持久性有机污染物(POPs)最有潜力的方法之一,有必要介绍利用微生物把目标污染物转化为易降解的物质甚至矿化的POPs修复原理及其技术。对此,概述了近年来国内外基于微生物通过膜融合、胞质融合和核融合形成能够降解P... 生物吸附与降解是解决持久性有机污染物(POPs)最有潜力的方法之一,有必要介绍利用微生物把目标污染物转化为易降解的物质甚至矿化的POPs修复原理及其技术。对此,概述了近年来国内外基于微生物通过膜融合、胞质融合和核融合形成能够降解POPs的杂种细胞的细胞融合技术;基于降解性质粒的相容性,把能够降解不同污染物的质粒组合到一个菌种中,形成多质粒的新菌种,使微生物由于代谢途径的改变能够矿化POPs的基因工程菌构建技术;基于通过某些载体把酶固定于其中实现活性稳定、可以回收及可重复利用的酶固定化技术,以及基于降解菌活性酶分子亚基置换、降解菌活性酶的定点突变、降解酶的体外定向进化这几方面的酶构建技术;进一步分析基于分子生物学提高POPs生物修复能力的原理,指出经生物技术改造的工程菌和固定化酶未能进入实际应用的障碍所在。以多溴联苯醚(PBDEs)的微生物细胞吸收和降解机理作为典型POPs生物修复的案例,强调生物降解的过程强化需要建立多尺度上功能方面的适合;提出了分子生物学与基因工程学的结合在解决POPs环境污染方面未来的基础科学问题与研究思路。综合上述,典型POPs的生物修复技术的构建需要考虑宏观污染物协同降解的工艺理论,在基因水平、分子水平、反应器水平及工程水平上追求更高功能方面的适合。 展开更多
关键词 生物修复 持久性污染物 多溴联苯醚 细胞融合技术 酶固定化技术 基因工程 体外定向进化
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链霉菌的分子育种研究进展 被引量:2
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作者 付雯 张晓勇 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期190-191,201,共3页
大多数抗生素均是由链霉菌产生的,但随着抗生素的高剂量大面积使用,抗生素的使用寿命也随之缩短,从而使得快速选育高产量、产新抗生素的链霉菌显得尤其重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展以及对微生物次生代谢机制的进... 大多数抗生素均是由链霉菌产生的,但随着抗生素的高剂量大面积使用,抗生素的使用寿命也随之缩短,从而使得快速选育高产量、产新抗生素的链霉菌显得尤其重要。随着基因工程技术和分子生物学手段的不断发展以及对微生物次生代谢机制的进一步了解,链霉菌的选育已由原来随机诱变筛选进入到分子育种。综述了链霉菌在提高抗生素产量和产生新抗生素方面的分子育种进展。 展开更多
关键词 链霉菌 分子育种 DNA重组 分子定向进化
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胰蛋白酶改性的研究现状和展望
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作者 李秀娟 郭娟 +1 位作者 易艳 李英文 《河北渔业》 2009年第9期35-38,共4页
近年来,随着蛋白酶改性研究的不断进步,试图提高胰蛋白酶稳定性的有关研究也取得了长足的发展。本文综述了目前国内外关于胰蛋白酶的固定技术和大分子修饰技术的研究现状,并提出了通过定点改造和体外定向进化技术提高胰蛋白酶稳定性的... 近年来,随着蛋白酶改性研究的不断进步,试图提高胰蛋白酶稳定性的有关研究也取得了长足的发展。本文综述了目前国内外关于胰蛋白酶的固定技术和大分子修饰技术的研究现状,并提出了通过定点改造和体外定向进化技术提高胰蛋白酶稳定性的可能。 展开更多
关键词 胰蛋白酶 固定化技术 大分子修饰 体外定向进化
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