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用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体
被引量：
1
1
作者
潘淑媛
高丽华
+6 位作者
胡显文
杨波
殷亮
胥照平
张正光
郗永义
陈惠鹏
《高技术通讯》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第8期834-840,共7页
将二氢叶酸还原酶基因（dhfr）克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒（ECMV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游，构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤（MTX）加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载...
将二氢叶酸还原酶基因（dhfr）克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒（ECMV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游，构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤（MTX）加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂（LMW—uPA）突变体（缺失尿激酶原的1—143位氨基酸，Arg156→Lys，Asn302→Ala），用脂质体转染方法将表达载体pIRES—dhfr／LMW—UK转染CHO—dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选，几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW—UK，其中约50％为表达水平较接近（500—5000IU／10^6cells／d）的高表达阳性克隆。用转瓶无血清培养表达水平约为17．5pg／cell／d的rCHO细胞系LB2-UK，收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后，获得的重组蛋白的纯度可以达到99％。用S-2444发色底物法检测，所获得的突变体双链UK比例大于98％。
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关键词
低分子量尿激酶
突变体
内部核糖体进入位点
二氢叶酸还原酶基因
重组CHO细胞
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职称材料
溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达
被引量：
3
2
作者
张磊亮
焦建伟
+2 位作者
邵开峰
俞梅敏
茹炳根
《高等学校化学学报》
SCIE
EI
CAS
CSCD
北大核心
2004年第6期1046-1050,共5页
将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥...
将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥功能 .根据大肠杆菌偏好密码子合成 Decorsin的基因 ,与 scu PA-3 2 k基因融合在一起 ,构建新的嵌合体基因 dscu PA,并在大肠杆菌中通过 IPTG进行诱导表达 ,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在 .对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质 .用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为 92 0 0 0 IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似 ,且有较强的抑制血小板聚集的功能 .重组蛋白 dscu PA不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 .
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关键词
低分子量尿激酶
原
抗栓肽
血小板聚集
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职称材料
题名
用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体
被引量：
1
1
作者
潘淑媛
高丽华
胡显文
杨波
殷亮
胥照平
张正光
郗永义
陈惠鹏
机构
军事医学科学院生物工程研究所
吉林大学生命科学院
出处
《高技术通讯》
CAS
CSCD
北大核心
2006年第8期834-840,共7页
基金
863计划（Z18-03-12）资助项目.
文摘
将二氢叶酸还原酶基因（dhfr）克隆至pIRES载体中弱化的脑心肌炎病毒（ECMV）内部核糖体进入位点（IRES）的下游，构建了含有弱化dhfr筛选标记和可用氨甲蝶呤（MTX）加压提高表达水平的双顺反子真核表达载体pIRES—dhfr。利用该表达载体表达了一种无糖基化和具有凝血酶抗性的低分子量尿激酶型纤溶酶原激活剂（LMW—uPA）突变体（缺失尿激酶原的1—143位氨基酸，Arg156→Lys，Asn302→Ala），用脂质体转染方法将表达载体pIRES—dhfr／LMW—UK转染CHO—dhfr-细胞后经过一轮MTX筛选，几乎所有获得的单克隆细胞株都表达LMW—UK，其中约50％为表达水平较接近（500—5000IU／10^6cells／d）的高表达阳性克隆。用转瓶无血清培养表达水平约为17．5pg／cell／d的rCHO细胞系LB2-UK，收集的上清经过阳离子交换柱和凝胶过滤层析两步纯化后，获得的重组蛋白的纯度可以达到99％。用S-2444发色底物法检测，所获得的突变体双链UK比例大于98％。
关键词
低分子量尿激酶
突变体
内部核糖体进入位点
二氢叶酸还原酶基因
重组CHO细胞
Keywords
low molecular weight urokinase, mutant, internal ribosome entry site, dhfr, recombinant CHO cell
分类号
Q782 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达
被引量：
3
2
作者
张磊亮
焦建伟
邵开峰
俞梅敏
茹炳根
机构
北京大学生命科学学院
出处
《高等学校化学学报》
SCIE
EI
CAS
CSCD
北大核心
2004年第6期1046-1050,共5页
基金
国家自然科学基金 (批准号 :3 0 2 0 0 0 5 7)资助
文摘
将抗栓肽 ( Decorsin)嫁接到低分子量尿激酶原 ( scu PA-3 2 k)上 ,可以期望获得既具有抗血小板聚集活性 ,又具有溶栓活性的新型基因工程蛋白质分子 .利用计算机辅助分子设计手段模拟了该融合蛋白的分子结构 ,证明其活性区可以正常发挥功能 .根据大肠杆菌偏好密码子合成 Decorsin的基因 ,与 scu PA-3 2 k基因融合在一起 ,构建新的嵌合体基因 dscu PA,并在大肠杆菌中通过 IPTG进行诱导表达 ,该重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体的形式存在 .对包涵体进行变性和复性并通过层析纯化得到目的蛋白质 .用纤维蛋白平板法测得重组蛋白的比活为 92 0 0 0 IU/mg.激活纤溶酶原的酶促动力学性质与天然低分子量尿激酶相似 ,且有较强的抑制血小板聚集的功能 .重组蛋白 dscu PA不但具有较强的溶栓功能 ,而且具有抗栓功能 .
关键词
低分子量尿激酶
原
抗栓肽
血小板聚集
Keywords
ScuPA-32k
Decorsin
Platelet aggregation
分类号
Q786 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
用弱化dhfr双顺反子载体在CHO细胞中高效表达低分子量尿激酶突变体
潘淑媛
高丽华
胡显文
杨波
殷亮
胥照平
张正光
郗永义
陈惠鹏
《高技术通讯》
CAS
CSCD
北大核心
2006
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
溶栓与抗栓双功能尿激酶原突变体的模拟、构建与表达
张磊亮
焦建伟
邵开峰
俞梅敏
茹炳根
《高等学校化学学报》
SCIE
EI
CAS
CSCD
北大核心
2004
3
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职称材料
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