永生化猪视网膜色素上皮细胞的建立及初步应用

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作者 唐青海 刘博 +6 位作者 谢金文 魏凤 谷英华 高翠翠 曹宗喜 张艳 王文秀 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2024年第2期22-31,共10页

【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代... 【目的】建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料。【方法】合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定。提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs)。检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析。分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度。【结果】PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功。将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致。PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为10^(5.25)TCID_(50)/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(10^(8.125) TCID_(50)/mL)。PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为10^(6.125)TCID_(50)/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106.0 TCID_(50)/mL)。PRV Bartha-K61毒株感染猪RPECs后,CPE明显,病毒滴度为10^(8.75)TCID_(50)/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID_(50)/mL)。【结论】成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料。 展开更多

关键词 猪视网膜色素上皮细胞 永生化 猪流行性腹泻病毒 猪圆环病毒2型 猪伪狂犬病毒

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树鼩角膜基质永生化细胞系的构建及其在病毒感染性方面的研究 被引量：1

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作者 丁相荣 陈柳 +6 位作者 霍姝汭 杞梦迪 刘欣 王文广 李娜 代解杰 陆彩霞 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期610-619,共10页

目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学... 目的建立树鼩永生化角膜基质细胞(corneal stromal cells,CSCs)系,并探讨其在病毒感染中的应用。方法利用组织块贴壁培养法分离培养树鼩原代CSCs,将携带SV40T基因的慢病毒转染细胞后,再挑取单克隆进行传代培养,传至50代以上进行形态学观察并与40代细胞形态进行比较,波形蛋白(vimentin)和SV40T基因免疫荧光鉴定、核型鉴定、细胞增殖曲线测定。用单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus-1,HSV-1)(McKrae株)、寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及甲型流感病毒H1N1(PR8株)在该细胞上进行病毒感染实验。结果传至50代以上的树鼩永生化CSCs呈梭形,细胞形态结构与40代相比仍较好。vimentin和SV40T基因免疫荧光表达阳性。增殖曲线结果显示:细胞生长旺盛,第4~5天时处于对数生长期。原代细胞核型的染色体数稳定为62条,而永生化细胞第21、56代突变为64条且保持稳定。病毒感染实验显示:树鼩永生化CSCs对HSV-1(McKrae株)、ZIKV(GZ01株)、登革病毒Ⅱ型以及H1N1(PR8株)病毒敏感,产生较高感染滴度,分别为1.32×105、5.62×106、2.69×107、7.76×104CCID50/mL。结论成功建立了树鼩永生化CSCs细胞系,提示该细胞系可用于单纯疱疹病毒、寨卡病毒、登革病毒和甲型流感病毒感染眼角膜疾病的作用机制及抗病毒药物的研究。 展开更多

关键词 树鼩 角膜基质细胞 永生化 病毒扩增

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鬼臼毒素纳米脂质载体的制备及体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用 被引量：8

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作者 种树彬 曾抗 +3 位作者 李国锋 任非 朱晓亮 周金洁 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1023-1028,共6页

目的研究鬼臼毒素纳米脂质载体（POD-NLC）的体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用。方法采用乳化蒸发法制备POD-NLC,分别应用扫描电镜、粒径仪、高效液相法等方法研究其表征,并观察其稳定性。分别以不同浓度（0.00011μg/ml）的P... 目的研究鬼臼毒素纳米脂质载体（POD-NLC）的体外对HPV感染的永生化人宫颈上皮细胞的作用。方法采用乳化蒸发法制备POD-NLC,分别应用扫描电镜、粒径仪、高效液相法等方法研究其表征,并观察其稳定性。分别以不同浓度（0.00011μg/ml）的POD-NLC和鬼臼毒素（POD）处理H8细胞,采用MTT法检测细胞的增殖活性,以荧光显微镜观察细胞的形态变化,流式细胞术（FCM）检测其凋亡率和细胞周期。结果①制备的POD-NLC扫描电镜下呈球形,有较好的稳定性,粒径为（85.6±10.25）nm,电位为（26.2±4.1）mV,包封率为（88.56±3.1）%;②POD-NLC能较强地抑制H8细胞的增殖,其抑制作用呈现时间和剂量依赖性;POD-NLC和POD作用72h对H8细胞的抑制率最高分别为95.8%、65.6%,半数抑制浓度（IC50）分别为0.015、0.13μg/ml;空白NLC对H8细胞的增殖无影响;③浓度为0.01μg/ml的POD-NLC和POD分别处理H8细胞48h后,H8细胞的凋亡率分别为（88.30±4.28）%和（59.95±3.26）%;荧光显微镜观察,均出现了核固缩、染色质高度凝聚、凋亡小体等典型的凋亡形态改变;与空白对照组相比,POD-NLC组和POD组G2/M期细胞比例明显增多,S期细胞比例无明显变化,G0/G1期细胞比例明显减少,但两组间细胞周期时相比例的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论该制备工艺可行;与POD相比,POD-NLC对H8细胞具有更强的增殖抑制和凋亡诱导效果,可使细胞阻滞于G2/M期。 展开更多

关键词 鬼臼毒素 纳米结构脂质载体 细胞凋亡 永生化人宫颈上皮细胞

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基于永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02对猪源益生性乳酸菌的筛选 被引量：2

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作者 王大会 赵献军 +3 位作者 齐雪峰 苏运芳 李义 佟琪 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第11期12-18,共7页

【目的】从健康仔猪的粪便及各肠段内容物和黏液中分离乳酸菌,并以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02为体外细胞模型对猪源益生性乳酸菌进行筛选。【方法】采用分离培养和常规生化试验对乳酸菌进行分离与鉴定。用永生化猪小肠上皮细胞ZYM-... 【目的】从健康仔猪的粪便及各肠段内容物和黏液中分离乳酸菌,并以永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02为体外细胞模型对猪源益生性乳酸菌进行筛选。【方法】采用分离培养和常规生化试验对乳酸菌进行分离与鉴定。用永生化猪小肠上皮细胞ZYM-SIEC02作为体外模型,通过黏附性试验、耐酸耐胆盐试验和对致病菌的黏附抑制试验对菌株进行筛选。【结果】分离筛选出了12株乳酸菌,其黏附能力存在差异。Y091231、Y091221、Y224031、X302032、Y223052和Y223072等6株菌的黏附性较好,黏附指数依次为:2 903.25±83.33,2 320.37±81.02,1 965.43±37.72,1 416.12±62.74,1 100.00±68.10,988.73±17.06。对其进行耐酸耐胆盐试验和抑菌试验,结果表明,菌株Y091231、Y091221和Y224031对致病菌均具有较强的黏附抑制能力,且对高胆盐、低pH具有较强的耐受性。其中Y091231对大肠杆菌C83921的黏附抑制率可达(99.40±3.17)%,Y091221对致病性沙门氏菌的黏附抑制率为(97.10±2.04)%,Y091231对金黄色葡萄球菌CVCC2258的黏附抑制率为(98.00±2.31)%。Y091231、Y091221和Y224031 3株菌分别被鉴定为发酵乳杆菌、乳酸乳杆菌和嗜酸乳杆菌。【结论】筛选得到的3株益生性乳酸菌,不仅具有耐酸耐胆盐能力,而且对小肠黏膜上皮细胞具有强黏附性,对大肠杆菌C83921、致病性沙门氏菌和金黄色葡萄球菌CVCC2258具有较强的黏附抑制能力,可作为肠道微生态制剂的候选菌株。 展开更多

关键词 永生化猪小肠上皮细胞 猪源乳酸菌 黏附性 黏附抑制

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表达hTERT及SV40T永生化奶牛乳腺上皮细胞系的建立 被引量：5

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作者 上官陶 王洪梅 +2 位作者 冯敏燕 仲跻峰 何洪彬 《山东农业科学》 2013年第2期1-4,共4页

构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结... 构建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T载体,线性化后,共转染荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞,研究人端粒酶逆转录酶(hTERT)和猿猴病毒40大T抗原(SV40 T)对荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞体外培养的作用,并对细胞进行RT-PCR检测分析及免疫荧光鉴定。结果表明,hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮细胞中表达可以有效地延长细胞的体外培养时间,增加细胞传代次数,获得的细胞系可以正常表达角蛋白。说明在体外培养的乳腺细胞中共表达hTERT和SV40 T可以有效延长细胞寿命且不影响乳腺细胞特性。 展开更多

关键词 荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞 永生化 端粒酶 猿猴空泡病毒40大T抗原

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挥发性有机物对永生化支气管上皮细胞的急性毒性 被引量：3

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作者 刘东山 张桂芝 金银龙 《首都医科大学学报》 CAS 2005年第6期662-666,共5页

目的评估家装材料中典型挥发性有机物(VOCs)混合物体外条件下对永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)所致的急性毒性。方法选取装修材料中常见的12种挥发性有机物及其混合物作为研究对象,以液体染毒方式处理细胞,检测染毒后细胞的LC50、克隆... 目的评估家装材料中典型挥发性有机物(VOCs)混合物体外条件下对永生化支气管上皮细胞(BEAS-2B)所致的急性毒性。方法选取装修材料中常见的12种挥发性有机物及其混合物作为研究对象,以液体染毒方式处理细胞,检测染毒后细胞的LC50、克隆存活、活性氧(ROS)产生和胞外乳酸脱氢酶(LDH)的变化,确定VOCs混合物的急性毒性。结果各VOCs作用于细胞后,其LC50值由0.70 g/L到22.80 g/L不等,而VOCs混合物细胞的LC50和克隆存活的LC50分别为0.82 g/L和0.30 g/L,毒性明显升高,展示出独特的化学性质和毒性特质,表明VOCs混合物的毒性效应是12种成分毒性效应的联合作用(协同、加强、超相加)的结果。同时VOCs混合物还诱导BEAS-2B细胞产生大量活性氧.OH和O2.-,使胞外LDH升高,且各效应与毒物作用剂量成正相关关系。结论VOCs混合物细胞毒性明显升高,表现为各成分的联合作用。它可诱导BEAS-2B细胞产生活性氧(ROS),引起细胞膜受损而死亡。且VOC混合物的急性毒性效应在高剂量时呈现细胞致死效应,较低剂量时呈现一种细胞转化效应。 展开更多

关键词 挥发性有机物(VOCs) 人支气管上皮细胞 急性毒性 永生化

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信号传导及转录激活子3通路参与卷烟烟气凝集物诱导永生化人支气管上皮细胞的恶性转化 被引量：1

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作者 袁娜娜 李伟 +9 位作者 陈余清 张佳秀 洪磊 蒋鹏 周继红 王效静 朱茂祥 潘秀颉 杨陟华 顾永清 《中国药理学与毒理学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期1182-1191,共10页

目的检测肺鳞癌组织、鳞状细胞不典型增生组织和癌旁组织中磷酸化信号传导及转录激活子3(p STAT3)蛋白的表达,比较其表达与吸烟的关系;探讨STAT3通路在烟草诱导细胞恶性转化过程中的作用。方法免疫组化法检测288例肺鳞癌组织、108例鳞... 目的检测肺鳞癌组织、鳞状细胞不典型增生组织和癌旁组织中磷酸化信号传导及转录激活子3(p STAT3)蛋白的表达,比较其表达与吸烟的关系;探讨STAT3通路在烟草诱导细胞恶性转化过程中的作用。方法免疫组化法检测288例肺鳞癌组织、108例鳞状细胞不典型增生组织、112例癌旁组织中p STAT3蛋白的表达,比较其表达与吸烟的相关性。构建卷烟烟气凝集物(CSC)诱导第10,20,30,40,50,60及70代细胞(P10,P20,P30,P40,P50,P60及P70)永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化模型。从血清抗性及锚着独立性等方面对CSC诱导各代BEP2D细胞的恶性转化特征进行鉴定。Western蛋白印迹法检测CSC诱导各代BEP2D细胞中p STAT3的表达。MTT法和流式细胞术分别检测JSI-124 0.25~10μmol·L^(-1)对P70细胞存活及凋亡的影响。JSI-124处理CSC诱导P70 24 h后检测存活蛋白表达的变化。结果 p STAT3蛋白在肺鳞癌组织中表达高于鳞状细胞不典型增生和癌旁组织(P<0.05);p STAT3在目前吸烟者中的表达均高于曾经吸烟者和从不吸烟者(P<0.05),且随着吸烟指数增加两者表达水平逐渐升高(P<0.01)。随着转化代数的增高,细胞血清抗性增加,锚着独立性增强,P30细胞以后尤为明显。p STAT3在正常对照组和乙醇对照组中弱表达,且两者之间无显著性差异;CSC诱导的各组BEP2D细胞中,p STAT3的表达均显著高于正常对照组和乙醇对照组(P<0.05),并随细胞代数的增高而增高。JSI-124抑制P70细胞增殖、促进P70细胞凋亡呈浓度及时间依赖性。JSI-124 1μmol·L^(-1)作用P70细胞24 h后,存活蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论 STAT3信号通过调控存活蛋白表达抑制细胞凋亡,参与烟草诱导永生化人支气管上皮细胞的恶性转化。 展开更多

关键词 信号传导及转录激活子3 卷烟烟气凝集物 永生化人支气管上皮细胞

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涎腺上皮细胞永生化细胞系及其意义 被引量：1

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作者 刘霞 孙宏晨 欧阳喈 《口腔医学研究》 CAS CSCD 2003年第3期228-229,共2页

关键词 涎腺上皮细胞 永生化细胞系 基因转染 无血清培养法 转基因动物 二阶段假说

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HPV16 E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮—间叶变

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作者 潘红芽 张志愿 +3 位作者 周晓健 蒋欣泉 李江 陈万涛 《上海第二医科大学学报》 CSCD 北大核心 2005年第4期330-333,共4页

目的研究人乳头状瘤病毒HPV16E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮—间叶变(EMT),以及发生EMT细胞的生物学特征。方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16E6/E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变;透射电镜观察细胞间桥粒形成情况;RT... 目的研究人乳头状瘤病毒HPV16E6/E7永生化口腔上皮细胞的上皮—间叶变(EMT),以及发生EMT细胞的生物学特征。方法相差显微镜、微分干涉显微镜观察HPV16E6/E7永生化口腔上皮细胞系HIOEC细胞形态学改变;透射电镜观察细胞间桥粒形成情况;RTPCR比较正常口腔上皮细胞和HIOEC细胞中βcatenin、上皮钙黏蛋白(Ecadherin)、wnt4、wnt5a、snail基因的转录情况;免疫组化检测HIOEC细胞中细胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vim)的表达。免疫荧光、激光共聚焦显微镜观察Actin细胞骨架的改变。结果HIOEC细胞呈梭形成纤维细胞样改变,细胞分散生长;RTPCR结果显示HIOEC细胞Ecadherin、wnt4转录水平下调,wnt5a转录水平上调,βcatenin、snail基因无明显改变。HIOEC细胞共表达CK和Vim。Actin细胞骨架在HIOEC细胞中更显丰富,呈束排列。结论HPV16E6/E7永生化口腔上皮HIOEC细胞发生上皮—间叶变,细胞表现间叶细胞的部分生物学特征。 展开更多

关键词 人乳头状瘤病毒 口腔上皮细胞 永生化 上皮-间叶变 细胞形态学 透射电镜

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人类输卵管上皮永生化细胞系的建立及鉴定 被引量：8

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作者 高雯 臧荣余 +5 位作者 王雁 杨丽娜 刘杨 亓子豪 尹胜 杨恭 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期241-247,共7页

背景与目的:最近研究表明卵巢高级别浆液性癌可能起源于输卵管上皮。本课题通过基因沉默和端粒酶导入技术将原代输卵管上皮细胞永生化,为以后建立恶性转化细胞系和卵巢癌动物模型奠定基础。方法:分离并培养输卵管上皮细胞,导入p53和pRb ... 背景与目的:最近研究表明卵巢高级别浆液性癌可能起源于输卵管上皮。本课题通过基因沉默和端粒酶导入技术将原代输卵管上皮细胞永生化,为以后建立恶性转化细胞系和卵巢癌动物模型奠定基础。方法:分离并培养输卵管上皮细胞,导入p53和pRb shRNA结合hTERTcDNA,建立p53和pRb基因同时沉默并过表达hTERT的永生化细胞系,并对永生化细胞系进行连续传代、沉默基因的蛋白质印迹法(Western blot)测定、SA-β-gal染色和非停泊生长实验及体内致瘤活性鉴定。结果:我们建立了稳定表达p53、pRbshRNA和hTERT的永生化输卵管上皮细胞系:FTE248116/p53i+pRbi+hTERT及FTE312249/p53i+pRbi+hTERT。结论:可以通过导入端粒酶基因及敲除抑癌基因p53和pRb来建立永生化细胞系,并有望于构建恶性转化细胞系和人类高级别浆液性卵巢癌动物模型。 展开更多

关键词 输卵管上皮细胞 P53 PRB HTERT 永生化

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一株永生化的BRCA1突变型人卵巢表面上皮细胞系的建立及初步分析 被引量：2

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作者 任春霞 夏小艾 +2 位作者 杨树东 吕蓓 童国庆 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期693-699,共7页

背景与目的:BRCA1突变女性患乳腺癌和卵巢癌的风险增加,然而,目前尚不清楚BRCA1的单个等位基因突变如何导致癌症的发生,建立BRCA1突变的永生化细胞系可能为此类肿瘤发生的研究提供一个有用的模型。方法:从无锡市人民医院收治的1例携带BR... 背景与目的:BRCA1突变女性患乳腺癌和卵巢癌的风险增加,然而,目前尚不清楚BRCA1的单个等位基因突变如何导致癌症的发生,建立BRCA1突变的永生化细胞系可能为此类肿瘤发生的研究提供一个有用的模型。方法:从无锡市人民医院收治的1例携带BRCA1单等位基因185delAG突变患者的正常卵巢组织中分离和建立了卵巢表面上皮细胞系OSE236;然后利用反转录病毒系统介导的技术,用特异的shRNA稳定沉默p53表达,并导入人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)催化亚基和致癌基因HRAS,构建了系列细胞系并测定了其生长、衰老、细胞周期及致瘤特性。结果:成功建立了永生化细胞系OSE236/p53i/hTERT,但在该永生化细胞中导入致癌基因HRAS所构建的细胞系OSE236/p53i/hTERT/HRAS并未在体外和体内诱导肿瘤的转化。对该系列细胞系进行研究发现,与原代细胞系OSE236相比,永生化细胞系OSE236/p53i/hTERT中的β-半乳糖苷酶活性明显降低,而该BRCA1突变在所有系列细胞系中都存在,细胞周期随永生化明显增强,相关细胞周期调节蛋白(如CDK4、Cyclin B1/Cyclin D1/Cyclin E)上调,该永生化细胞系目前已在体外传代超过100代。结论:尽管未能在体外和体内将该永生化细胞系转化为癌细胞,但该携带BRCA1-185delAG突变的永生化人卵巢表面上皮细胞可能为研究BRCA1突变相关卵巢癌或乳腺癌提供了一个很有价值的细胞模型。 展开更多

关键词 卵巢上皮细胞 永生化 p53 人端粒酶反转录酶 BRCA1突变

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细胞角蛋白在食管永生化上皮细胞和恶性转化细胞系的表达 被引量：2

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作者 彭燕 陈海滨 +2 位作者 苏中静 张锦堃 沈忠英 《实用医学杂志》 CAS 2005年第14期1491-1493,共3页

目的:研究细胞角蛋白(cytokeratin,CK)在食管永生化上皮细胞株SHEE和由SHEE恶性转化而来的细胞株SHEEmt之间的差异表达。方法:采用免疫细胞化学染色和免疫印迹的方法,观察SHEE细胞和SHEEmt细胞中CK的表达。结果:免疫细胞化学染色显示两... 目的:研究细胞角蛋白(cytokeratin,CK)在食管永生化上皮细胞株SHEE和由SHEE恶性转化而来的细胞株SHEEmt之间的差异表达。方法:采用免疫细胞化学染色和免疫印迹的方法,观察SHEE细胞和SHEEmt细胞中CK的表达。结果:免疫细胞化学染色显示两种细胞均呈CK染色阳性,阳性反应位于胞浆;SHEE细胞染色弱阳性,SHEEmt细胞染色中等强度阳性。免疫印迹分析在两种细胞中抗角蛋白抗体均与分子量52.5ku、46ku和45ku的抗原同时发生反应;但SHEEmt细胞中的3条阳性反应带均强于SHEE细胞。结论:CK阳性表达支持两种细胞来源于非角化型或胎儿型鳞状上皮;随着永生化细胞转化为恶性细胞,某些角蛋白表达上调,可能与细胞恶性转化后的分化程度相关。 展开更多

关键词 细胞角蛋白 永生化 转化细胞系 食管 免疫细胞化学染色 抗角蛋白抗体 免疫印迹分析 细胞恶性转化 阳性反应 细胞染色 上皮细胞株 差异表达 中等强度 同时发生 鳞状上皮 细胞来源 阳性表达 恶性细胞 细胞转化 表达上调 分化程度

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16型人乳头瘤病毒E5基因对永生化口腔上皮细胞EGFR、p21、p53和Rb基因表达的影响 被引量：3

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作者 李迪 江彤 陈传俊 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2017年第9期1288-1293,共6页

目的分析16型人乳头瘤病毒E5基因(HPV16 E5)对永生化口腔上皮细胞(HIOEC)肿瘤相关基因表皮生长因子受体(EGFR)、p21、p53和Rb表达的影响,探究HPV16 E5在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中的潜在作用机制。方法将含有目的基因HPV16 E5的慢病... 目的分析16型人乳头瘤病毒E5基因(HPV16 E5)对永生化口腔上皮细胞(HIOEC)肿瘤相关基因表皮生长因子受体(EGFR)、p21、p53和Rb表达的影响,探究HPV16 E5在口腔鳞状细胞癌发生发展过程中的潜在作用机制。方法将含有目的基因HPV16 E5的慢病毒载体p LOV-E5及对照病毒载体p LOV-N分别转染HIOEC细胞,并筛选出各自稳定转染的细胞株。RT-q PCR和Western blot法分别检测EGFR、p21、p53和Rb基因mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT法分析HPV16 E5对HIOEC细胞增殖活性的影响。结果p LOV-E5转染的HIOEC细胞中,p21和p53的mRNA转录水平较对照组显著提高(P=0.00、0.02),但EGFR的mRNA转录水平较对照组无明显变化;EGFR、p21和p53的蛋白表达水平较对照组均显著提高,Rb基因的mRNA和蛋白表达水平较对照组均无明显变化。MTT法检测结果表明,p LOV-E5转染HIOEC的增殖活力较对照组显著提高(P=0.00)。结论 HPV16 E5可以促进HIOEC的增殖,同时上调EGFR、p21和p53在HIOEC中的表达水平。 展开更多

关键词 人乳头瘤病毒 永生化 上皮细胞 HPV16 E5基因

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永生化上皮细胞系及肺鳞癌细胞系基因组DNA拷贝数变异的比较研究

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作者 路丹 曹邦荣 +4 位作者 冯林 郭素平 程书钧 高燕宁 张开泰 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2012年第20期1497-1500,共4页

目的:通过分析比较支气管上皮永生化细胞系与肺鳞癌细胞系的拷贝数变异探讨肿瘤早期发展的分子机制。方法:用人类比较基因组杂交芯片(aCGH)分别测定支气管上皮细胞系Y-BE和肺鳞癌细胞系NCI-H2170的拷贝数,经数据校正,对拷贝数变异基因进... 目的:通过分析比较支气管上皮永生化细胞系与肺鳞癌细胞系的拷贝数变异探讨肿瘤早期发展的分子机制。方法:用人类比较基因组杂交芯片(aCGH)分别测定支气管上皮细胞系Y-BE和肺鳞癌细胞系NCI-H2170的拷贝数,经数据校正,对拷贝数变异基因进行GO(Gene Ontology)富集分析。结果:永生化上皮细胞系早代Yp21仅出现了少量的DNA拷贝数变异,而在染色体20 q11～12区段Yp21细胞与HCI-H2170细胞出现了相似的拷贝数变异结果;永生化上皮细胞系晚代Yp113具有类神经细胞黏附基因的拷贝数增加现象;整体来看,从永生化上皮细胞早代到晚代,再与肿瘤细胞比较,DNA拷贝数变异频率不断升高,基因组稳定性逐渐下降结论:通过对永生化上皮细胞拷贝数变异的研究,成功建立了肺癌癌前模型的拷贝数变异谱,部分拷贝数变异可能代表了肿瘤发生发展早期的分子事件,预示了细胞的潜在恶性,这些发现可能为阐明肿瘤发生发展的分子机制提供了条件。 展开更多

关键词 永生化上皮细胞 拷贝数变异 肺鳞癌

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烟草悬凝物诱导永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的研究

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作者 谢俊豪 吴庆琛 +4 位作者 张诚 李强 朱茂祥 杨陟华 潘秀颉 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期49-51,共3页

目的:探讨人支气管上皮细胞(BEP-2D)恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的变化。方法:选取正常BEP-2D细胞及经烟草悬凝物处理后的第15代(P-15)、25代(P-25)、38代(P-38)BEP-2D细胞共4组细胞株作为研究对象,采用半定量反转录PCR(Retro... 目的:探讨人支气管上皮细胞(BEP-2D)恶性转化过程中survivin基因及蛋白表达的变化。方法:选取正常BEP-2D细胞及经烟草悬凝物处理后的第15代(P-15)、25代(P-25)、38代(P-38)BEP-2D细胞共4组细胞株作为研究对象,采用半定量反转录PCR(Retro-translation PCR,RT-PCR)检测各组细胞株中survivin基因变化,免疫组织化检测各组中survivin蛋白的表达。结果:1.survivin mRNA在正常细胞BEP-2D中的表达强度为0.08,在转化的肺癌细胞P-15、P-25和P-38中分别为0.56、0.80和0.81。2.survivin蛋白在正常BEP-2D细胞株中表达阴性,在转化的3组细胞中表达阳性,且survivin蛋白在正常细胞与转化细胞株中的表达存在明显差异,其中在P-15具有明显差异(P<0.05)。结论:survivin基因及蛋白的表达水平可作为早期肺癌的一个检测指标。 展开更多

关键词 烟草悬凝物 永生化人支气管上皮细胞 survivin基因及蛋白 免疫组化 半定量反转录PCR

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体外诱导人羊膜上皮细胞分化为角膜上皮样细胞的初步研究

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作者 姚敏 陈剑 +4 位作者 王文娟 张晓玲 杨筱曦 周清 徐锦堂 《眼科新进展》 CAS 北大核心 2012年第9期801-805,共5页

目的探索以人永生化角膜上皮细胞( immortalized human corneal epithelial cells,ihCEC) 培养液体外模拟角膜上皮细胞微环境,诱导人羊膜上皮细胞( human corneal epithe-lial cells,hAEC) 分化为角膜上皮样细胞的可行性。方法取( 37 &#... 目的探索以人永生化角膜上皮细胞( immortalized human corneal epithelial cells,ihCEC) 培养液体外模拟角膜上皮细胞微环境,诱导人羊膜上皮细胞( human corneal epithe-lial cells,hAEC) 分化为角膜上皮样细胞的可行性。方法取( 37 ± 1) 周剖宫产人羊膜组织,酶消化法提取 hAEC; 流式细胞仪测 CD29、CD90、CD105、CD34、HLA-DR 的表达。复苏培养 ihCEC,以 0 mg·L- 1、10 mg·L- 1、20 mg·L- 1、30 mg·L- 1、40 mg·L- 1丝裂霉素 37℃作用 2 h,吸去丝裂霉素,继续培养 72 h 后 CCK8 测吸光度并计算增殖抑制率。10 mg·L- 1、20 mg·L- 1丝裂霉素处理细胞后 12 h、24 h 收集细胞培养液培养 hAEC,CCK8 测吸光度绘制生长曲线; 收集 ihCEC 细胞培养液,制备条件培养基( CM) 培养 hAEC 10 d,倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光检测 CK12 的表达。结果 hAEC 可表达 CD29、CD90、D105,不表达 CD34、HLA-DR; 各浓度丝裂霉素组增殖抑制率分别为 10 mg·L- 1( 65. 48% ±1. 03) 、20 mg · L- 1( 77. 01% ± 0. 99) 、30 mg · L- 1( 75. 25% ± 0. 71) 、40 mg · L- 1( 76. 90% ±0. 97) ;20 mg·L- 1丝裂霉素培养 12 h 收集的细胞培养液对 hAEC 具有明显促增殖作用; 诱导分化后 hAEC 可表达 CK12。结论以 ihCEC 细胞培养液模拟的角膜上皮细胞微环境可诱导 hAEC 分化为角膜上皮样细胞。 展开更多

关键词 人永生化角膜上皮细胞 人羊膜上皮细胞 丝裂霉素 微环境 组织工程

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人类永生化角膜内皮细胞的生物学特性

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作者 王帆 宋柏林 +1 位作者 徐丽伟 Christian Ohrloff 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2010年第5期390-393,共4页

目的探讨人类永生化角膜内皮细胞在免疫反应中的分子表达及其刺激T淋巴细胞活化的能力。方法人类永生化角膜内皮细胞分别培养在含干扰素-γ(IFN-γ)(1000U/mL)和不包含IFN-γ(1000U/mL)的F99和M199培养液中,按照1∶1等比例混合并含有5%... 目的探讨人类永生化角膜内皮细胞在免疫反应中的分子表达及其刺激T淋巴细胞活化的能力。方法人类永生化角膜内皮细胞分别培养在含干扰素-γ(IFN-γ)(1000U/mL)和不包含IFN-γ(1000U/mL)的F99和M199培养液中,按照1∶1等比例混合并含有5%小牛血清。健康志愿者采集外周血并分离外周血单核细胞(PBMCs),应用锥虫蓝染色鉴定细胞的完整性和细胞数量。免疫组织化学染色法测定人类永生化角膜内皮细胞分别在有无IFN-γ诱导条件下的HLA-DP、DQ、DR抗原及CD40的表达。同时,体外共同培养人类永生化角膜内皮细胞和PBMCs,荧光活化细胞分类(FACS)法测定活化的T淋巴细胞中CD69的表达。结果 IFN-γ能够诱导HLA-DP、DQ、DR抗原和CD40在人类永生化角膜内皮细胞上的阳性表达,表现为细胞膜和细胞质中的红色染色。CD3和CD28抗体预处理的外周血单核细胞中,20%的CD69阳性T淋巴细胞活化,无IFN-γ诱导时有10%阳性T淋巴细胞,而IFN-γ诱导组中,有12%的阳性T淋巴细胞,说明共同培养人类永生化角膜内皮细胞和PBMCs体系中,CD69阳性淋巴细胞数量增加。结论外周血中的T淋巴细胞可以被人类永生化角膜内皮细胞活化,由此人类永生化角膜内皮细胞是具有免疫学特性潜能的抗原递呈细胞。 展开更多

关键词 抗原递呈细胞 人类永生化角膜内皮细胞 外周血单核细胞 共同刺激通路 荧光活化细胞分类计 干 扰素-γ

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永生化绵羊附睾上皮细胞系的建立及其生物学特性分析 被引量：3

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作者 宋慧子 栾兆进 +3 位作者 王兆琛 杜炜 赵勇超 张家新 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1624-1633,共10页

旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免... 旨在建立绵羊附睾上皮永生化细胞系,为进一步研究绵羊附睾功能调节机制提供基础。本研究采用酶消化法分离培养原代绵羊附睾上皮细胞,利用脂质体将pCI-neo-hTERT质粒转入绵羊附睾上皮细胞(SEECs),经G418筛选得到了细胞系hTERT-SEECs,免疫荧光法鉴定其角蛋白18(CK18)和人端粒酶逆转录亚基(hTERT)表达情况;RT-PCR检测其hTERT mRNA的表达;采用CCK-8法绘制细胞生长曲线检测其增殖能力;利用流式细胞仪检测其周期和细胞凋亡情况;核型分析检测其倍体情况;从mRNA和蛋白水平检测其谷胱甘肽过氧化物酶5(GPX5)和雄激素受体(AR)的表达情况。结果显示,原代绵羊附睾上皮细胞呈典型的铺路石状形态。hTERT成功转入绵羊附睾上皮细胞,传45代后,hTERT-SEECs仍呈铺路石状;hTERT-SEECs仍可稳定表达CK18和hTERT,并且拥有正常的二倍体核型;hTERT-SEECs增殖能力高于原代细胞,hTERT-SEECs处于G1期的细胞比例显著低于SEECs(P<0.05),处于S期细胞比例显著高于SEECs(P<0.05),且其活细胞率显著高于SEECs(P<0.05),凋亡率显著低于SEECs(P<0.05);hTERT-SEECs和SEECs的GPX5和AR蛋白表达量差异不显著(P>0.05)。本研究所建立的hTERT-SEECs经长期培养后仍具有正常的附睾上皮细胞形态,增殖能力强并保留了附睾上皮细胞的生物学特性。 展开更多

关键词 绵羊附睾上皮细胞 永生化 HTERT 基因表达

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HIF-1α的RNA干涉可引起缺氧条件下人角膜上皮细胞VEGF表达下调和PEDF表达上调 被引量：4

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作者 张晓玲 陈剑 +2 位作者 姚敏 刘小勇 周清 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期880-884,共5页

目的探讨shRNA干扰HIF-1α表达对缺氧条件下人角膜上皮细胞(h CEC)血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法针对HIF-1αmRNA序列靶点设计及合成3个小发夹RNA(shRNA),分别在体外转染自发永生化人角膜上皮细胞(S-... 目的探讨shRNA干扰HIF-1α表达对缺氧条件下人角膜上皮细胞(h CEC)血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法针对HIF-1αmRNA序列靶点设计及合成3个小发夹RNA(shRNA),分别在体外转染自发永生化人角膜上皮细胞(S-ihCEC),转染后的S-ihCEC在1 mmol/L Co Cl2中缺氧诱导培养6 h,实时定量PCR检测HIF-1α、VEGF、PEDF的mRNA表达,Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,ELISA检测PEDF的水平。结果与缺氧组比较,转染HIF-1αshRNA的S-ihCEC中HIF-1αmRNA表达下调、HIF-1α蛋白表达下调,VEGF mRNA表达下调、VEGF蛋白表达下调,PEDF mRNA表达上调(1. 22±0. 18)倍,PEDF水平升高。结论针对HIF-1α的shRNA能有效干扰S-ihCEC中HIF-1α的表达,并下调VEGF表达、上调PEDF的表达。 展开更多

关键词 缺氧 小发夹RNA 自发永生化人角膜上皮细胞 缺氧诱导因子-1α 血管内皮生长因子 色素上皮生长因子

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猪小肠上皮细胞分离培养与鉴定 被引量：12

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作者 詹康 左晓昕 +3 位作者 陈银银 贡笑笑 占今舜 赵国琦 《动物营养学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期1477-1484,共8页

为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细... 为建立功能性永生化的猪小肠上皮细胞系,并为猪肠道营养吸收与免疫调控以及仔猪肠道疾病发病机制的研究提供细胞模型,本试验采用组织块培养法来分离纯化猪小肠上皮细胞,并通过细胞角蛋白18、细胞增殖曲线、核型分析来鉴定猪小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块培养法能够成功培养猪小肠上皮细胞并稳定传11代。2)本试验获得的猪小肠上皮细胞角蛋白18抗原鉴定为阳性,染色体核型为二倍体。3)倒置显微镜下观察培养至第11代的猪小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,呈现"铺路石"和上皮样形态。培养11代后的猪小肠上皮细胞间隙开始变大,规则不明显,细胞开始凋亡。第15代的猪小肠上皮细胞则出现大量凋亡并从瓶底脱落,仅有很少细胞贴壁生长。综上所述,采用组织块培养法能够获得生物学功能稳定的猪小肠上皮细胞系并能正常传11代,可为细胞的永生化提供试验素材。 展开更多

关键词 猪小肠上皮细胞 功能性 肠道营养与免疫 永生化

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