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链间二硫键增强抗前胃泌素释放肽单链抗体稳定性
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作者 郭玉凤 刘佳玉 +5 位作者 许静 张婷 张超 孔晓娜 周小林 王伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1418-1425,共8页
前胃泌素释放肽(pro-gastrin-releasing peptide,ProGRP)是小细胞肺癌的特异性标志物,^(131)I标记的抗ProGRP单克隆抗体对小细胞肺癌具有明显的抑制作用。抗ProGRP单链抗体的制备具有重要的应用前景。本研究以抗ProGRP单克隆细胞株E-B_(... 前胃泌素释放肽(pro-gastrin-releasing peptide,ProGRP)是小细胞肺癌的特异性标志物,^(131)I标记的抗ProGRP单克隆抗体对小细胞肺癌具有明显的抑制作用。抗ProGRP单链抗体的制备具有重要的应用前景。本研究以抗ProGRP单克隆细胞株E-B_(5) cDNA为模板,扩增获得VH和VL序列,并对其进行序列比对和同源建模,分析引入链间二硫键的突变位点。通过基因合成获得单链抗体Scfv_(ProGRP)和单链二硫键稳定抗体Sdsfv_(ProGRP)基因,并将其分别构建在质粒pET-28a,获得重组表达质粒pET28a-His-Scfv_(ProGRP)和pET28a-His-Sdsfv_(ProGRP)。重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达出的ScFv_(ProGRP)和SdsFv_(ProGRP)以包涵体的形式存在。包涵体经变复性后进行纯化,获得ScFv_(ProGRP)和SdsFv_(ProGRP)的纯度分别为87.38%和95.73%。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测显示,0.021 mg/mL ScFv_(ProGRP)和0.026 mg/mL SdsFv_(ProGRP)可以与抗原ProGRP特异性结合。SdsFv_(ProGRP)稳定性高于ScFv_(ProGRP)。结果表明,重组表达的抗ProGRP单链抗体识别ProGRP,具有免疫学活性,链间二硫键增强了抗前胃泌素释放肽单链抗体稳定性,研究为ProGRP人源化单链抗体的制备提供了新的数据。 展开更多
关键词 前胃泌素释放肽 二硫键 单链抗体 原核表达 稳定性
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人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv抗体片段基因的构建与表达 被引量:3
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作者 赵小玲 荫俊 +2 位作者 陈伟强 杨冠 张素娟 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期124-127,共4页
目的构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv(dsFv)抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段。方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链(VH、VL)突变基因,NdeⅠ和NotⅠ双酶切后分... 目的构建人源抗狂犬病毒二硫键稳定性Fv(dsFv)抗体基因,并在原核系统中实现高效表达,制备有活性的人源抗狂犬病毒dsFv抗体片段。方法采用PCR定点突变的方法,构建抗狂犬病毒dsFv抗体的重、轻链(VH、VL)突变基因,NdeⅠ和NotⅠ双酶切后分别插入pET-22b(+)表达质粒中,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达。将VL、VH包涵体蛋白经盐酸胍变性,按比例混合在复性折叠缓冲液中,使二者折叠形成dsFv抗体片段。并以其母本抗体scFv作对照,对其抗原特异性和稳定性进行初步评价。结果在VH的第44位氨基酸和VL的第100位氨基酸引入了半胱氨酸,成功构建了抗狂犬病毒dsFv抗体基因,并在原核系统中实现了对二者的高效表达,VH、VL蛋白在复性缓冲液中正确折叠形成了dsFv抗体片段。结论对筛选获得的抗狂犬病毒scFv成功进行了稳定性改构,制备了有活性的dsFv抗体片段,改构以后的dsFv保持了对狂犬病毒的特异结合活性,而其在血清中的稳定性有明显改进,而且其热稳定性和抵抗尿素化学变性的能力亦大大改进。 展开更多
关键词 狂犬病病毒 二硫键稳定性Fv抗体 基因表达
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抗人氨基末端脂多糖结合蛋白二硫键稳定性Fv抗体的制备及生物学活性的初步研究 被引量:1
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作者 邹佳 葛晓冬 +1 位作者 杨艳丽 刘友生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第14期1308-1311,共4页
目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH... 目的制备抗人氨基末端脂多糖结合蛋白(N-terminal fragment of human lipopolysaccharide binding protein,NH-LBP)的二硫键稳定性Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragment,dsFv),并初步测定其生物学活性。方法将含有dsFv-VL与dsFvVH包涵体蛋白经复性、折叠和纯化,获得完整的dsFv抗体。通过ELISA、TNF-α分泌等方法,初步测定dsFv抗体在体内外的生物学活性。结果获得dsFv抗体蛋白约2.1mg,dsFv与NH-LBP有较好的结合能力,并在动物体内减轻了LPS所诱导的炎症反应,发挥了一定的保护活性。结论通过分别表达VL和VH片段,再制备dsFv抗体是可行的,dsFv能部分抑制LBP的生物学功能。 展开更多
关键词 人氨基末端脂多糖结合蛋白 包涵体 二硫键稳定性Fv抗体
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抗伏马菌素B_1单链抗体的原核表达及其抗体活性和稳定性分析 被引量:1
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作者 陈静 邹龙 +3 位作者 许杨 李燕萍 何庆华 黄运红 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期1-6,共6页
研究了对抗伏马菌素B1单链抗体在不同原核表达条件下表达情况及其抗体稳定性,以促进其在免疫学分析中的应用。通过构建表达载体pET22b-1D11和pMAL-1D11,分析了诱导温度、诱导剂浓度、宿主菌和高溶解性标签蛋白对单链抗体表达形式的影响... 研究了对抗伏马菌素B1单链抗体在不同原核表达条件下表达情况及其抗体稳定性,以促进其在免疫学分析中的应用。通过构建表达载体pET22b-1D11和pMAL-1D11,分析了诱导温度、诱导剂浓度、宿主菌和高溶解性标签蛋白对单链抗体表达形式的影响;采用酶联免疫吸附实验法(ELISA)分析了单链抗体的热稳定性和有机溶剂耐受性。结果表明:条件优化后,单链抗体及其融合蛋白主要以包涵体形式表达;热处理会降低单链抗体活性甚至使其完全失活,甲醇会降低基于单链抗体的ELISA体系的灵敏度。 展开更多
关键词 伏马菌素B1 单链抗体 原核表达 活性分析 热处理 稳定性
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二硫键稳定单链抗体融合PE38免疫毒素的构建及活性分析 被引量:10
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作者 王建丽 郑玉玲 +3 位作者 王保莉 郭霭光 马茹 姜永强 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期74-77,共4页
目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-... 目的构建二硫键稳定单链抗体(B3dsscFv)融合PE38原核表达载体,实现其高效表达,并对初步纯化后的复性产物的稳定性、对肿瘤细胞的结合和杀伤活性进行测定。方法重叠PCR连接B3抗体的VH和VL片段,并将PCR产物克隆至pET22b表达载体(B3dsscFv-pET22b)。测序正确的PE38基因片段经酶切连接至B3dsscFv-pET22b,构建B3dsscFv-PE38-pET22b表达载体。IPTG诱导转化菌,将表达的包涵体进行变性、复性后用阳离子柱Q-Sepharose进行了初步纯化,ELISA测定此融合蛋白中单链抗体的结合活性及其在37℃的稳定性,并采用MTT法检测其对B3抗原表面阳性细胞HT-29的杀伤作用。结果双酶切鉴定表明成功地构建了B3dsscFv-PE38-pET表达载体,表达产物以包涵体形式存在,占总蛋白量的45%左右。复性后的B3dsscFv-PE38保持单链抗体的结合活性,并且对结肠癌HT-29细胞具有一定的杀伤作用,最大杀伤率可达96%。该蛋白在37℃孵育16h后,仍能保持大部分活性。结论所获B3dsscFv-PE38免疫毒素具备导向和杀伤肿瘤细胞的双重功能和良好的稳定性,为其研制有效的肿瘤免疫治疗靶向药物提供一定的基础。 展开更多
关键词 单克隆抗体 B3 二硫键稳定单链抗体 PE38 肿瘤导向
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单链二硫键稳定抗体靶向超抗原SEA(D227A)分子的表达、纯化及鉴定 被引量:3
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作者 郝淮杰 郑玉玲 +2 位作者 余多慰 马茹 姜永强 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期269-272,共4页
目的:提高抗肝癌靶向超抗原SEA(D227A)的产量和稳定性,构建单链二硫键稳定抗体靶向超抗原分子scdsFv-SEA(D227A)。方法:构建scdsFv SEA(D227A)表达质粒,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21plusS表达。包涵体经洗涤和复性后,用QSepharoseHP和Hip... 目的:提高抗肝癌靶向超抗原SEA(D227A)的产量和稳定性,构建单链二硫键稳定抗体靶向超抗原分子scdsFv-SEA(D227A)。方法:构建scdsFv SEA(D227A)表达质粒,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21plusS表达。包涵体经洗涤和复性后,用QSepharoseHP和Hiprep26/60SephacrylS-200HR纯化。纯化蛋白经AMS烷化处理并结合PAGE电泳来检测二硫键形成情况,并通过ELISA和MTS分别检测重组蛋白与肝癌细胞的结合活性、稳定性和细胞杀伤活性。结果:重组蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上。通过复性及QSepharoseHP离子交换柱和Hiprep26/60SephacrylS-200H凝胶过滤两步纯化后,获得目的蛋白,每升诱导菌液的产量高达60mg。活性测定结果表明,相比与单链抗体靶向超抗原和二硫键抗体靶向超抗原SEA,二硫键抗体靶向超抗原在不影响结合活性和杀伤效果的情况下,稳定性有了较大提高。结论:建立了一种新的稳定的免疫毒素和提高其产量的方法,为hscFv25抗体靶向超抗原的临床应用奠定了基础,同时为其他低稳定性或低产量抗体的改造提供了借鉴的方法。 展开更多
关键词 单链二硫键稳定抗体 产量 超抗原 SEA(D227A) 稳定性
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人源抗破伤风毒素单链二硫键稳定抗体的重组设计与表达 被引量:3
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作者 王晗 于蕊 +7 位作者 张晓鹏 任军 谢娜 樊红艳 张金龙 房婷 于长明 陈薇 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第1期60-64,共5页
目的构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并进行原核表达和生物学特性鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,获得二硫键稳定的抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)单链抗体基因(27G-scdsFv)。连接pET22b(+)载体,转化大肠... 目的构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并进行原核表达和生物学特性鉴定。方法采用PCR定点突变的方法,获得二硫键稳定的抗破伤风毒素重链C端(TeNT-Hc)单链抗体基因(27G-scdsFv)。连接pET22b(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot法鉴定表达产物。ELISA检测27G-scdsFv体外抗原特异结合活性和抗体相对稳定性;非竞争酶免法检测抗体亲和力。采用免疫荧光法检测27G-scdsFv体外中和活性。结果测序结果显示获得正确的27G-scdsFv基因。原核表达scdsFv以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的50%。复性后的27G-scdsFv保持了与TeNT-Hc的特异结合活性,亲和力较其scFv形式略有提升,KD=0.93×10-7mol/L,1 L培养物可获得5 mg scdsFv蛋白。27G-scdsFv的稳定性较scFv形式明显增强。27G-scdsFv在体外可以明显抑制TeNT-Hc与神经元细胞的结合。结论成功构建人源抗破伤风毒素重链C端单链二硫键稳定抗体原核表达载体,并获得有活性的目的蛋白,为27G-scdsFv的进一步生物学功能研究奠定基础。 展开更多
关键词 单链二硫键稳定抗体 亲和力 原核表达 破伤风痉挛毒素C端
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二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体的构建 被引量:2
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作者 李黄金 陈伟 +2 位作者 赵林 柴伟佳 唐伟 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2010年第21期271-274,共4页
为构建一种食品残留检测用二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体(sdsFvCAP)。以抗氯霉素抗体可变区基因为模板,通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别引入一个半胱氨酸定点突变,以重叠延伸PCR组装成sdsFvCAP。在大肠杆菌系统强启动子T7驱动... 为构建一种食品残留检测用二硫键稳定的抗氯霉素单链抗体(sdsFvCAP)。以抗氯霉素抗体可变区基因为模板,通过引物突变PCR在轻链和重链的可变区分别引入一个半胱氨酸定点突变,以重叠延伸PCR组装成sdsFvCAP。在大肠杆菌系统强启动子T7驱动下,sdsFvCAP基因不能单独表达,而通过同义突变降低其5'端序列GC含量则可实现高效表达。表达产物主要以包涵体形式存在,经β-环糊精分子伴侣系统复性可获得亲和力与母本抗体相似的sdsFvCAP。所构建的sdsFvCAP具有取代单克隆抗体用于氯霉素残留检测的潜力。 展开更多
关键词 氯霉素 二硫键稳定单链抗体 高效表达 β-环糊精分子伴侣 复性
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纳米抗体的稳定性及其结构基础研究进展 被引量:21
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作者 何晓婷 董洁娴 +3 位作者 沈兴 王弘 沈玉栋 徐振林 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1004-1017,共14页
驼类纳米抗体结构简单、易于改造,且具有低免疫原性、高稳定性、高特异性、高亲和力等特点,因而具有广泛的应用前景。纳米抗体的优势之一在于其具有较高的稳定性,比常规抗体更易于储藏和运输,甚至在高温、化学和压力等极端条件下变性后... 驼类纳米抗体结构简单、易于改造,且具有低免疫原性、高稳定性、高特异性、高亲和力等特点,因而具有广泛的应用前景。纳米抗体的优势之一在于其具有较高的稳定性,比常规抗体更易于储藏和运输,甚至在高温、化学和压力等极端条件下变性后仍可有效地重折叠并恢复其抗原亲和力。本文综述了纳米抗体稳定性与其结构基础方面的研究进展,阐述了纳米抗体氨基酸序列、二硫键、结构域等与其稳定性的关系,揭示了高度稳定性的纳米抗体普遍具有的结构特征。基于这些结构特征,讨论了几种纳米抗体的稳定性优化策略,包括共有序列驱动的序列修复、替换易于修饰的氨基酸、净蛋白质电荷的改变、非天然二硫键的引入以及CDR超变区的移植。预期对纳米抗体的稳定性调控提供理论指导,以拓展其作为治疗药物、诊断试剂和生物传感器等方面的应用。 展开更多
关键词 纳米抗体 稳定性 结构 序列 二硫键
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二硫键稳定的双特异diabody的构建及表达
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作者 陈宇萍 乔媛媛 +1 位作者 马大龙 王琰 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期39-42,共4页
目的 :在双特异diabody中设计和引入二硫键结构 ,提高其稳定性。 方法 :在抗HBsAg/RBC双特异dia body表达载体中分别将抗HBsAg或抗RBC抗体的轻重链可变区基因适当部位进行突变 ,引入半胱氨酸残基 ,使diabody结构中形成共价键。大肠杆菌... 目的 :在双特异diabody中设计和引入二硫键结构 ,提高其稳定性。 方法 :在抗HBsAg/RBC双特异dia body表达载体中分别将抗HBsAg或抗RBC抗体的轻重链可变区基因适当部位进行突变 ,引入半胱氨酸残基 ,使diabody结构中形成共价键。大肠杆菌中分泌表达或包含体表达。 结果 :使抗HBsAg/RBC双特异diabody的热稳定性和在尿素中的稳定性得到了较大程度的提高 ,改善了diabody的性能。 结论 展开更多
关键词 DIABODY 二硫键 双特异性 生物合成 药物稳定性 二聚体抗体 表达 构建
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人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达 被引量:2
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作者 江乐 阎瑾琦 +2 位作者 郭炳冉 任杰 于继云 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期391-394,共4页
目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在... 目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。 展开更多
关键词 干扰素Α 肝炎表面抗原 乙型 二硫键稳定性Fv抗体 质粒 基因表达
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抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段抗体dsFv V_L链的构建、表达和鉴定 被引量:1
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作者 葛晓冬 邹佳 +1 位作者 杨艳丽 刘友生 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第14期1364-1367,共4页
目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL2... 目的将抗人脂多糖结合蛋白氨基端片段(NH-LBP)抗体的Fv L链引入半胱氨酸(Cys),并表达、纯化。方法应用mega-primer PCR方法,在抗NH-LBP单克隆Fab抗体的轻链基因骨架区中引入编码Cys的基因序列,将目的序列放入载体pET-28a(+),于工程菌BL21star(DE3)中表达及TALON柱芯亲合纯化,通过ELISA法初步鉴定其与NH-LBP的结合力。结果dsFv VL链的Thr21替换为Cys,扩增出基因片段长约为650bp,经BL21star(DE3)菌表达出相对分子质量约为28×103的目的蛋白,与NH-LBP具有一定的结合力。结论抗体轻链中成功引入了Cys。 展开更多
关键词 脂多糖结合蛋白氨基端片段 二硫键稳定性Fv抗体 半胱氨酸
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抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及活性分析 被引量:6
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作者 李霄 金宁一 +6 位作者 李昌 田明尧 陈漉 贾鹏 刘立明 刘妍 高鹏 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2009年第4期682-686,共5页
结合生物信息学方法与已知癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单链抗体(Single chainFv fragment,scFv)核苷酸序列,经分子设计和密码子优化后,通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体(Disulfide stabilized single chain F... 结合生物信息学方法与已知癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)特异性单链抗体(Single chainFv fragment,scFv)核苷酸序列,经分子设计和密码子优化后,通过化学方法合成CEA二硫键稳定性单链抗体(Disulfide stabilized single chain Fv fragments,scdsFv)基因片段.将凋亡素基因(Apoptin)通过一段柔性连接肽(Linker)连接在CEA scdsFv基因下游,并克隆入大肠杆菌表达载体质粒pET28a,转化BL21感受态菌后经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导,表达融合蛋白CAtin.SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,目的蛋白得到良好表达,经条件优化后表达量最高可达44.1 mg/L.融合蛋白经分步洗涤法和谷胱甘肽对表达的目的蛋白进行初步纯化和复性后,利用人肝癌细胞(HCC)对所制备融合蛋白进行亲和力测定、细胞结合活性测定和特异性细胞杀伤活性分析.结果显示,所制备融合蛋白不仅能够有效地与上述肿瘤细胞结合,并对其具有明显的杀伤活性,表明成功制备了具有特异性识别和特异性杀伤活性的双特异抗肿瘤免疫导向制剂. 展开更多
关键词 癌胚抗原 二硫键稳定性单链抗体 凋亡素基因 原核表达
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