核因子-κB反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白报告系统的建立与应用 被引量：4

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作者 王付龙 梁华平 +2 位作者 刘昕 徐祥 王正国 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第1期78-83,共6页

建立核因子 κB (NF κB)反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白 (d2EGFP)报告系统 ,作为筛选NF κB拮抗药物及研究其相关信号转导途径的工具 .分别以EGFP与d2EGFP为报告基因、neor 为筛选基因 ,构建成 4×κB基序为增强子、SV40为基本... 建立核因子 κB (NF κB)反应性不稳定增强型绿色荧光蛋白 (d2EGFP)报告系统 ,作为筛选NF κB拮抗药物及研究其相关信号转导途径的工具 .分别以EGFP与d2EGFP为报告基因、neor 为筛选基因 ,构建成 4×κB基序为增强子、SV40为基本启动子的报告基因载体 p4κB EGFP和 p4κB d2EGFP .两载体分别与p6 5载体瞬时共转染HEK2 93细胞 ,通过比较不同时相点EGFP和d2EGFP的调控表达 ,证明 p4κB d2EGFP是较理想的NF κB反应性绿色荧光蛋白 (GFP)报告基因载体 .将 p4κB d2EGFP稳定转染HEK2 93细胞 ,从而获得NF κB反应性报告细胞株HEK d2EGFP .应用NF κB“圈套”寡核苷酸 (TFD)与 p6 5载体瞬时共转染HEK d2EGFP ,1mg/L NF κB和 2mg/LNF κBTFD组对p6 5蛋白诱导调控表达的d2EGFP具有明显拮抗作用 .结果表明 ,NF κB反应性d2EGFP报告系统可特异、灵敏、动态地反映和监测NF κB的活性变化 . 展开更多

关键词 核因子-ΚB 不稳定增强型绿色荧光蛋白报告系统 基因表达调控 寡核苷酸

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乳酸乳球菌NZ9000中增强型绿色荧光蛋白报告系统的构建 被引量：3

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作者 刘璐 艾连中 +3 位作者 夏永军 熊智强 管彤 宋馨 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期46-51,共6页

增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,eGFP)基因是遗传操作系统中常用的报告基因,以eGFP为报告基因评价不同启动子在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中的调控能力,寻找能够高效表达外源蛋白的强启动子。以实验... 增强型绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,eGFP)基因是遗传操作系统中常用的报告基因,以eGFP为报告基因评价不同启动子在乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9000中的调控能力,寻找能够高效表达外源蛋白的强启动子。以实验室构建的携带eGFP基因的pIB184-eGFP质粒为载体,PCR扩增来源于pLpCas9-0537、pMG36e、pNZ44的启动子P 11、P 32、P 44,将其分别克隆至pIB184-eGFP上,构建基于eGFP的报告系统。酶标仪定量测定eGFP的表达强度,比较不同启动子的转录活性。结果表明,在乳酸乳球菌中启动子P 11转录的活力十分微弱,启动子P 23、P 32、P 44的转录活性分别比P 11高约23.9、7.8、4.1倍。该文利用基于eGFP的报告系统,筛选出适用于乳酸乳球菌中不同转录活性的启动子,为外源基因在乳酸乳球菌中的表达奠定了基础。 展开更多

关键词 乳酸菌 乳酸乳球菌 增强型绿色荧光蛋白 报告系统 启动子

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利用柞蚕核型多角体病毒表达载体系统在柞蚕蛹中表达增强型绿色荧光蛋白 被引量：7

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作者 王林美 张波 +5 位作者 叶博 赵振军 李树英 李文利 岳冬梅 范琦 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期792-799,共8页

为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培... 为了探讨外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)表达系统的表达水平和稳定性,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆到柞蚕核型多角体病毒转移表达载体pApM748BE中,获得重组质粒DNA,与ApNPV DNA共转染樗蚕(Phi-losamia cynthiam)培养细胞Pc-01后,用末端稀释法筛选获得重组病毒ApNPV-Δph/egfp+。将该重组病毒感染柞蚕蛹,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测EGFP在柞蚕蛹中的表达,结果显示:在柞蚕蛹感染重组病毒ApNPV-Δph/egfp+后6 d,EG-FP就有明显的表达;感染后12～18 d,蛹体液中的EGFP含量保持较高水平,以EGFP标准样品定量分析EGFP在柞蚕蛹体液中的表达水平高于1 mg/mL;感染后30～39 d仍可以检测到蛹体液中EGFP的表达,而且蛋白稳定。研究结果表明,利用柞蚕核型多角体病毒作表达载体,可在柞蚕蛹中高效稳定地表达EGFP,并且EGFP在雌雄蛹间的表达水平无明显差异。 展开更多

关键词 柞蚕蛹 核型多角体病毒表达载体系统 增强型绿色荧光蛋白基因 樗蚕培养细胞

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基于COL1A1启动子和增强型绿色荧光蛋白基因建立人肝星状细胞活化的细胞模型

4

作者 王磊 金香淑 +5 位作者 董慧君 欧国敏 赖鑫源 庄辉 李彤 向宽辉 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期876-885,共10页

目的:建立评价人肝星状细胞中Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1肽链(collagen Iα1 chain,COL1A1)基因启动子活性的可视化报告系统,判断细胞的活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供细胞模型。方法:以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,扩增COL1A1启动... 目的:建立评价人肝星状细胞中Ⅰ型胶原蛋白Ⅰα1肽链(collagen Iα1 chain,COL1A1)基因启动子活性的可视化报告系统,判断细胞的活化状态,为抗肝纤维化药物的研究提供细胞模型。方法:以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,扩增COL1A1启动子序列。在pLVX-AcGFP1-N1质粒基础上构建以COL1A1启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因表达的重组质粒pLVX-COL1A1-EGFP。使用慢病毒包装系统将pLVX-COL1A1-EGFP稳定转染至永生化的人肝星状细胞LX-2中,并筛选单克隆细胞株。对该细胞株使用转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)激活及2种具有潜在抗肝纤维化作用的药物处理。使用荧光显微镜及ImageJ 1.49软件对细胞中EGFP荧光强度进行半定量分析,再分别使用逆转录实时定量PCR(reverse transcription real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和免疫印迹试验检测胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平。结果:构建了由COL1A1启动子调控EGFP表达的重组慢病毒质粒pLVX-COL1A1-EGFP,并加入了Kozak序列以增强EGFP的表达,获得了稳定转染pLVX-COL1A1-EGFP的LX-2单克隆细胞株LX-2-CE。LX-2-CE经过TGF-β1和具有潜在抗肝纤维化作用的5μmol/L二氢丹参酮Ⅰ共处理24 h后,其总荧光强度和平均荧光强度均低于TGF-β1单处理组(P<0.05);胞内COL1A1和EGFP的mRNA水平与蛋白质水平同样均低于TGF-β1单处理组(P<0.05)。结论:成功构建了基于COL1A1启动子调控EGFP表达的肝星状细胞活化的报告系统,可在体外直观报告肝星状细胞活化相关标志物COL1A1表达,为抗肝纤维化药物的筛选和研究提供了新的细胞模型。 展开更多

关键词 肝纤维化 LX-2细胞 Ⅰ型胶原蛋白α1肽链 增强型绿色荧光蛋白 报告系统

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乙型肝炎病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建与表达

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作者 谢娜 王晓燕 张琼 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期353-353,共1页

为研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达。用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子，载入T载体，测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1。构建出HB... 为研究乙型肝炎病毒（HBV）启动子（含增强子）调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因在肝癌细胞中的表达。用聚合酶链反应（PCR）技术分别扩增出HBV的4个启动子，载入T载体，测序后插入到含EGFP报告基因的质粒pEGFP-1。构建出HBV不同启动子调控的EGFP基因表达载体，经酶切、测序鉴定各重组体。采用脂质体介导法将4种构建好的载体转染肝癌细胞株HepG2，用倒置荧光显微镜观察各重组体转染细胞中EGFP的表达。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒(HBV) 增强型绿色荧光蛋白 真核表达载体 启动子 肝癌细胞株HEPG2 调控 聚合酶链反应(PCR) GFP报告基因 基因表达载体 脂质体介导法

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表达绿色荧光蛋白重组猪塞内卡病毒的构建及初步应用 被引量：5

6

作者 张晓战 杨磊 +8 位作者 邓同炜 赵攀登 彭志锋 陈露露 郭懿文 夏艳勋 乔宏兴 边传周 王增 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第10期2978-2985,共8页

塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在... 塞内卡病毒A(SVA)是新近发现的一种能够引起猪特发性水疱病及新生仔猪死亡为主要临床特征的病原微生物。该病呈世界性分布,给多个国家的养猪业造成了一定的经济损失。鉴于目前国内外尚无可用SVA商品化疫苗和抗病毒药物上市,本研究拟在实验室前期对SVA研究的基础上建立稳定表达绿色荧光蛋白报告基因的重组病毒,为体外高通量筛选具有抗SVA活性药物提供一种简单快速有效的工具。本研究在pEGFP-C1载体EGFP基因末端引入猪捷申病毒1型的2A基因,构建EGFP-P2A融合基因过度质粒,随后分别设计带有同源臂的克隆引物,通过同源重组技术将EGFP-P2A基因插入SVA毒株CH/HeN-2018基因组2A和2B基因间,并经测序鉴定,成功构建重组载体pSVA-EGFP。将pSVA-EGFP转染PK-15细胞,盲传至P2代,获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的重组SVA荧光毒rCH/HeN-2018-EGFP。通过绿色荧光观察、RT-PCR和生长曲线测定,评估了重组毒株rCH/HeN-2018-EGFP和亲本毒株生长特性。并进一步通过药物细胞毒性试验和病毒感染试验对rCH/HeN-2018-EGFP作为潜在抗SVA药物筛选工具进行评价。结果表明,rCH/HeN-2018-EGFP与亲本毒株wtCH/HeN-2018和rCH/HeN-2018在PK-15细胞中具有相似的生长特性,且遗传稳定,在P10代能够稳定表达绿色荧光,插入的EGFP-P2A基因没有出现突变现象。抗SVA病毒感染试验结果表明,用终浓度20μmol·L^(-1)的姜黄素和110μmol·L^(-1)黄芩苷预处理PK-15细胞2 h,通过观察荧光细胞的数量直观判断两种药物均能够抑制rCH/HeN-2018-EGFP在细胞中的复制,其中黄芩苷抑制效果极显著。随后在亲本毒株wtCH/HeN-2018感染试验进一步证实了黄芩苷对SVA病毒复制抑制的效果。本研究所构建的携带EGFP基因的重组SVA毒株能够高效稳定地表达绿色荧光蛋白,可以作为一种工具报告病毒应用于抗SVA药物和蛋白的筛选过程。 展开更多

关键词 塞内卡病毒 反向遗传操作系统 报告病毒 绿色荧光蛋白 抗病毒药物筛选

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利用双萤光素酶报告基因系统筛选有效的siRNA 被引量：1

7

作者 单志新 林秋雄 +4 位作者 谭虹虹 邓春玉 刘晓颖 肖定璋 余细勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1577-1581,1584,共6页

目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照p... 目的建立一种利用双萤光素酶报告基因系统筛选能有效抑制目的基因表达的小干扰RNA(siRNA)的方法。方法以绿色荧光蛋白(GFP)基因为研究对象,构建3个候选的靶向GFP的siRNA表达质粒pSi-GFPsiRNA1、pSi-GFPsiRNA2、pSi-GFPsiRNA3和阴性对照pSi-Negative。构建拥有同一Kozak共有翻译启始序列、翻译启始密码子ATG的GFP与萤光素酶基因(LUC)的融合表达载体pGL3-GFPf。将包含3个GFPsiRNA靶序列的GFP片段插入到改建过的pGL3-promoter载体上LUC的3'非翻译区(UTR),构建pGL3-GFPp。将GFPsiRNA表达质粒联同内参照质粒pRL-TK分别与pGL3-GFPf、pGL3-GFPp共转化HEK293细胞。利用双萤光素酶检测试剂盒测定各组细胞中萤光素酶的活力水平,用荧光定量PCR检测各组细胞中GFPmRNA的表达水平。结果同对照组相比,与pGL3-GFPf共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中萤火虫萤光素酶/海肾萤光素酶比值明显降低,其中GFPsiRNA1表达组中降低最显著(P<0.01);定量PCR检测也显示,GFPsiRNA1表达组中GFPmRNA的表达水平降低最明显(P<0.01)。双萤光素酶活性检测和定量PCR结果还显示,与pGL3-GFPp共转化GFPsiRNA表达质粒的各组细胞中,GFPsiRNA1抑制GFP的表达最显著(P<0.01)。结论本文建立了通过双萤光素酶活性检测来筛选有效的siRNA的方法,并为进行多个基因的有效siRNA的筛选提供解决方案。 展开更多

关键词 双萤光素酶报告基因系统 RNA干扰 荧光定量PCR 绿色荧光蛋白

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以果蝇表达载体系统构建可稳定表达抗菌性多肽Trappin-2的S2细胞株

8

作者 赵秀玲 何金生 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2013年第5期576-576,共1页

目的采用果蝇S2表达系统,构建可与S2细胞基因组整合的分别含有Trappin-2和EGFP的重组质粒,筛选出两种抗性稳定可表达Trappin-2和EGFP的多克隆S2细胞株,为后期研究Trappin-2黏膜佐剂等生物学活性奠定基础。方法首先对pMT/Bip/V5-His A果... 目的采用果蝇S2表达系统,构建可与S2细胞基因组整合的分别含有Trappin-2和EGFP的重组质粒,筛选出两种抗性稳定可表达Trappin-2和EGFP的多克隆S2细胞株,为后期研究Trappin-2黏膜佐剂等生物学活性奠定基础。方法首先对pMT/Bip/V5-His A果蝇表达载体进行改造,去掉pMT/Bip/V5-His A的Bip信号肽,改造成为pMT/V5-His A,采用RT-PCR方法从A549细胞中得到含信号肽的、完整的Trappin-2基因,在引物的5'端引入NotⅠ酶切位点及Kozak序列;引物的3'端引入XhoⅠ酶切位点和双终止密码子。利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pMT/V5-His A中,得到重组表达质粒pMT-Trappin-2(简称pMT-T2)真核表达载体。为了观察、比较转染效率和表达水平,同时构建了带有增强型绿色荧光蛋白(EG-FP)的载体pMT/V5-His A-EGFP(简称pMT/EG-FP)。采用脂质体介导的转染技术将鉴定正确的两种质粒pMT-T2和pMT-EGFP分别与抗性筛选质粒pCoHygro(简称pro)共转入果蝇S2细胞中,用含有300 mg/ml潮霉素B的完全培养基进行筛选,经过3～4周,筛选出两种抗性稳定多克隆S2细胞株,用终浓度为500μmol/L的CuSO4诱导表达48 h后,分别通过荧光显微镜、RT-PCR和Western blot分析目的蛋白在S2细胞中的表达水平。结果采用RT-PCR方法从A549细胞中得到Trappin-2基因,通过NotⅠ和XhoⅠ双酶切位点将Trappin-2克隆入改造好的pMT/V5-His A载体上,构建了pMT-T2和pMT-EGFP质粒,应用脂质体转染技术将真核表达载体和抗性筛选质粒pro共转染果蝇S2细胞,通过潮霉素B反复筛选,3～4周后,成功筛选到两种稳定的抗性多克隆细胞株,分别命名为S2-Trappin-2和S2-EGFP,用CuSO4分别诱导两个细胞株,在荧光显微镜下可观察到S2-EGFP主要表现为胞浆绿色荧光,RT-PCR结果证实Trappin-2在S2细胞中可稳定表达,Western blot分析S2-Trappin-2细胞培养上清可见分子量约10 ku的特异性条带,成功建立可稳定高表达Trappin-2和EGFP蛋白的果蝇S2细胞系。结论成功克隆了Trappin-2基因,并利用果蝇表达系统筛选到可分别稳定表达Trappin-2和EGFP的S2细胞株。S2-Trappin-2稳定表达细胞株的建立为进一步研究Trappin-2生物学特性、黏膜佐剂作用及在肺部感染等疾病中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 真核表达载体 果蝇表达系统 Trappin-2 蛋白 增强型绿色荧光蛋白 S2细胞

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以UPS构建的重组酿酒酵母表达载体及其稳定性研究 被引量：1

9

作者 王弘 郑文岭 +1 位作者 杨太成 冼江 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2005年第8期4-7,共4页

采用通用载体质粒融合系统UPS构建了一种以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的酿酒酵母表达载体pYES-GFP,并研究了其在重组酿酒酵母中的稳定性。实验表明,所构建的附加型质粒pYES-GFP在经近100代传代后,仍未发生丢失,具有良好的稳定性。同时,... 采用通用载体质粒融合系统UPS构建了一种以绿色荧光蛋白GFP为报告基因的酿酒酵母表达载体pYES-GFP,并研究了其在重组酿酒酵母中的稳定性。实验表明,所构建的附加型质粒pYES-GFP在经近100代传代后,仍未发生丢失,具有良好的稳定性。同时,通过实验验证了,UPS在进行表达载体构建时快速、简便、高效。 展开更多

关键词 酿酒酵母 表达载体 GFP基因 UPS 重组酿酒酵母 表达载体构建 酵母表达载体 稳定性研究 通用载体质粒融合系统 绿色荧光蛋白

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pEGFP-rhPLD_2融合基因在CHO细胞株中的稳定表达

10

作者 陈秋雁 左娟 +1 位作者 何小丽 朱玲 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期775-778,共4页

目的建立可以稳定表达增强型绿色荧光蛋白-重组人磷脂酶D2(pEGFP-rhPLD2)的CHO细胞株,从而制备大量的重组PLD2(rhPLD2)蛋白,为rhPLD2的功能研究奠定基础。方法用脂质体介导pEGFP-rhPLD2重组质粒转染CHO细胞株,经G418加压筛选出阳性克隆,... 目的建立可以稳定表达增强型绿色荧光蛋白-重组人磷脂酶D2(pEGFP-rhPLD2)的CHO细胞株,从而制备大量的重组PLD2(rhPLD2)蛋白,为rhPLD2的功能研究奠定基础。方法用脂质体介导pEGFP-rhPLD2重组质粒转染CHO细胞株,经G418加压筛选出阳性克隆,用RT-PCR、Western blot检测pEGFP-rhPLD2融合蛋白的表达,用倒置荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达。结果pEGFP-rhPLD2融合基因整合入细胞基因组DNA中,成功建立了pEGFP-rhPLD2在CHO细胞中的稳定表达体系。结论获得了稳定表达pEGFP-rhPLD2的CHO细胞株,为进一步研究rhPLD2的生物学功能及其在疾病预防治疗方面的作用奠定了实验基础。 展开更多

关键词 重组人磷脂酶D2 增强型绿色荧光蛋白 融合蛋白 CHO细胞 稳定转染 脂质体

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ERV1-2B_SSc-LTR-EGFP报告系统的建立及猪克隆胚胎ERVs转录活性的监测

11

作者 付博 马红 +3 位作者 汪亮 郭镇华 王芳 刘娣 《黑龙江动物繁殖》 2025年第4期23-28,共6页

体细胞核移植(SCNT)技术是生产转基因猪模型的核心技术,但猪克隆胚胎的发育能力仍然较低,其早期胚胎的内源性逆转录病毒(ERVs)的表达规律尚待深入研究。研究拟构建以猪基因组内源性逆转录病毒调控元件ERV1-2B_SSc-LTR驱动增强型绿色荧... 体细胞核移植(SCNT)技术是生产转基因猪模型的核心技术,但猪克隆胚胎的发育能力仍然较低,其早期胚胎的内源性逆转录病毒(ERVs)的表达规律尚待深入研究。研究拟构建以猪基因组内源性逆转录病毒调控元件ERV1-2B_SSc-LTR驱动增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的报告系统。通过脂质体转染获得阳性成纤维细胞株,进行体细胞核移植构建克隆胚胎,并在荧光显微镜下实时监测EGFP表达。结果表明:ERV1-2B_SSc-LTR-EGFP报告系统成功构建;48%的克隆胚胎在4细胞期表达EGFP,表明该元件具有启动子活性。EGFP阳性胚胎的囊胚形成率和细胞数显著高于阴性胚胎[(19.5±1.7)%vs.(14.8±0.5)%,(40.0±2.1)枚vs.(30.0±1.9)枚,P<0.05],提示该报告系统可用于实时监测ERVs活性并辅助评估克隆胚胎质量。 展开更多

关键词 体细胞核移植 长末端重复序列 绿色荧光蛋白报告系统 克隆 胚胎

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新型EGFP标记的杆状病毒转移载体的构建及EGFP的制备 被引量：2

12

作者 杨军 王一理 司履生 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期433-436,459,共5页

目的构建可表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体,利用Sf-9细胞表达、制备EGFP。方法用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因,NcoⅠ/SalⅠ双酶切,克隆入杆状病毒转移载体NcoⅠ/SalⅠ酶切位点之间,获得pFB-EGFP质粒;转... 目的构建可表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合蛋白的昆虫杆状病毒转移载体,利用Sf-9细胞表达、制备EGFP。方法用PCR法从pEGFP质粒中扩增EGFP基因,NcoⅠ/SalⅠ双酶切,克隆入杆状病毒转移载体NcoⅠ/SalⅠ酶切位点之间,获得pFB-EGFP质粒;转化E.coliDH10Bac,通过转座子Tn7的介导,获得重组杆状病毒Ac-EGFP;感染Sf-9昆虫细胞;利用激光共聚焦显微镜和SDS-PAGE观察并检测EGFP的表达。非变性法纯化EGFP。结果荧光显微镜和激光共聚焦显微镜证实感染的Sf-9细胞可表达EGFP;通过SDS-PAGE获得的EGFP,大小为27ku。结论重组pFB-EGFP载体具备表达EGFP的能力,为分子生物学研究提供了一种新型可表达EGFP融合蛋白的昆虫杆状病毒表达载体。 展开更多

关键词 昆虫杆状病毒表达系统 增强型绿色荧光蛋白

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多西环素调控的重组杆状病毒载体Ac-EGFP及Ac-HGF的构建

13

作者 潘志敏 罗叶婷 +4 位作者 郭菲 郑超 马勇 李广生 程细高 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期904-908,共5页

目的将Tet-On系统与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或肝细胞生长因子(HGF)共同构建于一新型重组杆状病毒载体,并以不同浓度的多西环素(DOX)调控EGFP及HGF表达。方法酶切重组质粒pFast-Tet、pTRE-EGFP和pTRE-HGF,回收目的片段后连接pFast-Tet... 目的将Tet-On系统与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)或肝细胞生长因子(HGF)共同构建于一新型重组杆状病毒载体,并以不同浓度的多西环素(DOX)调控EGFP及HGF表达。方法酶切重组质粒pFast-Tet、pTRE-EGFP和pTRE-HGF,回收目的片段后连接pFast-Tet,分别转化含有AcMNPV Bacmid和helper质粒的DH10Bac感受态细胞,筛选后提取Bacmid DNA并鉴定(命名为Ac-EGFP和Ac-HGF)。将Ac-EGFP和Ac-HGF转染骨髓间充质干细胞,加入不同浓度的DOX调控EGFP(DOX浓度为0、200、500、1000ng/mL)和HGF(DOX浓度为0、10、100、500、1000、1200ng/mL)的表达。在荧光显微镜下观察EGFP的表达,用ELISA法检测HGF的表达量。结果经鉴定EGFP、HGF与Tet-On系统成功构建在同一杆状病毒载体,且在骨髓间充质干细胞中具有较高的转染率。在较高浓度DOX调控下改造后的重组杆状病毒可高表达EGFP和HGF,低浓度或无DOX时表达量逐渐减低。结论本研究证实可将Tet-On系统与EGFP或HGF共同构建于一新型重组杆状病毒载体,改造后的重组杆状病毒能稳定、高效转染骨髓间充质干细胞,不同浓度的DOX可调控EGFP及HGF的表达,无DOX时呈低本底。 展开更多

关键词 增强型绿色荧光蛋白 肝细胞生长因子 Tet—on系统 骨髓 间质干细胞 杆状病毒

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弱化抗性标记筛选高表达CHO细胞株的方法建立 被引量：3

14

作者 刘苏 田浤 +1 位作者 王驰 姚文兵 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期617-622,共6页

为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转... 为了优化中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达体系,建立高表达CHO细胞株筛选方法,将外源基因表达载体上抗性筛选基因表达的新霉素磷酸转移酶(NPT)的261位氨基酸天冬氨酸突变成甘氨酸。经G418筛选,转染含突变型NPT表达载体的细胞存活率显著低于转染含野生型NPT表达载体的细胞存活率。以绿色荧光蛋白-抗体Ig G1 Fc结构域融合蛋白为报告基因,验证了突变后新霉素磷酸转移酶对抗生素G418抗性减弱。经G418持续加压培养3周后,转染含突变型NPT表达载体的细胞中EGFP的表达量显著高于转染含野生型NPT表达载体的细胞,表明其具有筛选出高表达单克隆细胞株的潜力。 展开更多

关键词 中国仓鼠卵巢细胞 新霉素磷酸转移酶 增强型绿色荧光蛋白 高表达系统

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