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Cloning of Bile Salt Hydrolase Gene and Its Expression in Lactic Acid Bacteria 被引量:3
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作者 LI Bin JIANG Yujun 《Journal of Northeast Agricultural University(English Edition)》 CAS 2011年第2期48-53,共6页
According to the sequence of the bile salt hydrolase (BSH) gene of Bifidobacterium and the restriction enzyme cutting sites of expression vector pNZ8148, primers were designed and the bile salt hydrolase (BSH) gen... According to the sequence of the bile salt hydrolase (BSH) gene of Bifidobacterium and the restriction enzyme cutting sites of expression vector pNZ8148, primers were designed and the bile salt hydrolase (BSH) gene was gotten from Bacillus bifidus ATCC 29521 by PCR. BSH gene was inserted into lactic acid bacteria expression vector pNZ8148 to construct the recombinant pNZ8148-BSH. The recombinant pNZ8148-BSH was transferred into lactic acid bacteria NZ9000 with electrotransformation method. And the recombinant which could express BSH protein was obtained. It was identified by SDS-PAGE electrophoresis and activity verification. The result could provide a rationale reference for expressing BSH in lactic acid bacteria. 展开更多
关键词 bile salt hydrolase lactic acid bacteria gene cloning IDENTIFICATION recombinant expression
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大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定 被引量:11
2
作者 宋柬 马会勤 +2 位作者 郝佳 任发政 陈尚武 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第7期29-35,共7页
利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉... 利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。 展开更多
关键词 苯丙氨酸解氨酶(PAL) pET-31b(+) 基因克隆 重组表达 肉桂酸
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丹参C4H基因pET32a原核表达载体的构建 被引量:8
3
作者 张婷婷 王春丽 +3 位作者 韩蕊莲 刘岩 赵旺生 梁宗锁 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2011年第7期158-162,共5页
【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因(SmC4H)的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32... 【目的】克隆丹参中肉桂酸-4-羟化酶基因(SmC4H)的核心区,并构建SmC4H基因的原核表达载体。【方法】设计合成SmC4H基因全长引物,应用PCR克隆SmC4H基因的编码区并添加酶切位点,应用EcoRⅤ、NotⅠ双酶切SmC4H-pGM-T后与原核表达载体pET32a连接,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行双酶切鉴定,诱导表达重组蛋白并进行SDS-PAGE电泳以及Western Blot分析。【结果】克隆得到了1 200 bp大小的基因片段,经测序鉴定其为SmC4H基因片段;连接表达载体测序结果表明,SmC4H-pET32a构建成功,其诱导表达蛋白经SDS-PAGE检测及Western Blot分析发现,重组蛋白表达效果较好,且主要以包涵体形式存在。【结论】成功构建了SmC4H-pET32a原核表达载体,并成功诱导了SmC4H-pET32a重组蛋白的表达。 展开更多
关键词 丹参 肉桂酸-4-羟化酶 pET32a 原核表达载体
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烟草苯丙烷代谢途径关键酶肉桂酸-4-羟化酶、4-香豆酸-辅酶A基因的分离及表达特性分析 被引量:17
4
作者 于利 张彦 +4 位作者 陈爱国 梁洪波 Qamaruddin Jogi 徐文玲 许娜 《植物遗传资源学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期1067-1073,共7页
肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸-辅酶A(4CL)是烟草苯丙烷代谢途径的关键酶,其多酚类产物与烟草品质密切相关。本研究以酚类物质含量合成差异较大的2个烤烟品种红花大金元(HD)和K326为试验材料,利用同源克隆技术获得这2种烟草Ntc4h和Nt... 肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、4-香豆酸-辅酶A(4CL)是烟草苯丙烷代谢途径的关键酶,其多酚类产物与烟草品质密切相关。本研究以酚类物质含量合成差异较大的2个烤烟品种红花大金元(HD)和K326为试验材料,利用同源克隆技术获得这2种烟草Ntc4h和Nt4cl基因的cDNA序列并进行表达特性分析。结果表明,在2个品种中Ntc4h和Nt4cl各有2个同源基因,Ntc4h1、Ntc4h2、Nt4cl1和Nt4cl2的ORF长度分别为1518 bp、1518 bp、1644 bp和1629 bp。Nt4cl1、Ntc4h1和Ntc4h2在编码序列上存在品种间差异。实时荧光定量PCR分析结果表明,该2种酶的基因在烟草中具有明显的时空表达特异性,2种酶基因在根、茎、叶、花和萼片中都有表达,在茎的木质部和韧皮部中的表达量均显著高于其他组织;在圆顶期和适熟期表达水平较高,在适熟期达到最高;且两品种中的表达模式存在差异。 展开更多
关键词 烟草 肉桂酸-4-羟化酶(C4H) 4-香豆酸-辅酶A(4CL) 基因分离 表达分析
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白曲霉酸性蛋白酶在黑曲霉中表达 被引量:7
5
作者 李杰 吴婷 +4 位作者 马南 王欣 杨建乐 李健友 张会 《东北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期29-35,共7页
研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I(EC.3.4.23.18)。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I... 研究分析固态发酵酸性蛋白酶生产菌株及其产品,ITS序列鉴定结果表明,该菌株为曲霉属,质谱分析结果表明其产品为Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I(EC.3.4.23.18)。根据Aspergillus saitoi酸性蛋白酶Aspergillopepsin I基因序列pep1(GI:473517)设计引物,以固态发酵酸性蛋白酶生产菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得pep1基因。序列分析结果表明,扩增片段与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶基因组序列相似性为99%,其编码蛋白与白曲霉Aspergillus kawachii酸性蛋白酶(GAA90749.1)相似性为100%,将该基因命名为pep B。构建黑曲霉表达载体p SZHG-pep B,通过农杆菌介导法转化黑曲霉CICC2462,筛选得到在gla A位点发生同源重组纯合转化子。经摇瓶发酵后,对产物进行SDS-PAGE、酶活检测以及酸性蛋白酶酶学性质和酶稳定性研究。结果表明,纯合同源重组菌株经SDS-PAGE检测时在47 ku左右处有明显目的蛋白条带,其发酵产物酸性蛋白酶酶活达5 543 U·m L-1,为出发菌株152倍。对菌株所产酸性蛋白酶酶学性质研究发现,该酶最适反应温度为50℃,最适反应p H 3.0,在4℃和25℃条件下,酶在p H 3.0~4.0时较稳定。 展开更多
关键词 酸性蛋白酶 黑曲霉 同源重组 分泌表达
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改善苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌细胞通透性提高反式肉桂酸转化率 被引量:5
6
作者 崔建东 贾士儒 谭之磊 《高校化学工程学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2008年第6期1015-1019,共5页
研究了不同表面活性剂(曲通-X-100、Tween-80、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS))和有机试剂(丙酮、异丙醇、乙醇)对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌细胞通透性的影响。结果表明曲通-X-100、Tween-80、SDS、异丙醇和乙醇对... 研究了不同表面活性剂(曲通-X-100、Tween-80、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS))和有机试剂(丙酮、异丙醇、乙醇)对苯丙氨酸解氨酶重组大肠杆菌细胞通透性的影响。结果表明曲通-X-100、Tween-80、SDS、异丙醇和乙醇对提高细胞的通透性没有显著影响,但CTAB和丙酮可以显著的改善细胞通透性,提高反式肉桂酸转化率。原子力显微镜检测结果表明,用0.15g·L-1CTAB和60%丙酮处理细胞后可以明显的改变细胞形态,与对照(未处理细胞)相比,处理后的细胞表面粗糙,多皱折,表明细胞膜的通透性得到提高。流式细胞仪检测表明,0.15g·L-1CTAB处理细胞后,平均荧光道数(MnX)是对照(未处理细胞)的23倍,细胞通透性得到显著提高,反式肉桂酸转化率是对照的1.83倍,达到82%。60%丙酮处理细胞,MnX是对照的28倍,反式肉桂酸转化率是对照的1.90倍,达到84.9%。 展开更多
关键词 苯丙氨酸解氨酶 重组大肠杆菌 表面活性剂 细胞通透性 反式肉桂酸转化率
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阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达 被引量:3
7
作者 刘君 江连洲 +5 位作者 高博 邓晨旭 陈璐璐 张会 王多佳 李杰 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2014年第20期200-203,共4页
利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因(faeA)的编码区,构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA,并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。经筛选获得将faeA... 利用食品级黑曲霉表达系统同源表达阿魏酸酯酶是提高阿魏酸酯酶产量、降低生产成本的有效途径。利用PCR技术扩增黑曲霉阿魏酸酯酶A基因(faeA)的编码区,构建黑曲霉表达载体pSZHG-faeA,并通过农杆菌介导法转化黑曲霉。经筛选获得将faeA基因整合到糖化酶基因位点的同源重组转化子4株。在酶摇瓶发酵条件下,重组菌株培养液上清中的阿魏酸酯酶活性最高达18.6mU/mL。SDS-PAGE分析显示,4株重组菌株都有约36ku目的蛋白条带,表达量为188-262μg/mL。结果表明,实现了阿魏酸酯酶在黑曲霉中的同源表达,为食品级阿魏酸酯酶的大规模工业化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 阿魏酸酯酶 黑曲霉 同源重组 表达
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睾酮假单胞菌3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建及表达 被引量:5
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作者 张国华 徐国宾 +1 位作者 刘英民 夏铁安 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第6期966-969,共4页
从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析... 从土壤中分离睾酮假单胞菌 ,提取其基因组DNA ,PCR扩增 3α 羟类固醇脱氢酶 (3α hsd)基因 ,将扩增产物用NdeⅠ /BamHⅠ消化 ,切下目的基因片段克隆到质粒 pET 15b中构建重组pET 15b .将重组 pET 15b转化入E .coliDH5α中 ,经酶谱分析和测序 ,鉴定出正确的重组质粒 pET 15b .将重组pET 15b转化入宿主菌E .coliBL2 1(DE3) pLysS中 ,用硫代半乳糖苷 (IPTG)进行诱导表达 .提取细菌总蛋白质进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)分析并测定酶活性 .粗提物中酶活性高达 2 4 5× 10 5U/L .利用重组蛋白中的 6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析 ,经一步金属螯合亲和层析纯化后 ,重组蛋白在SDS PAGE上呈现出均一的单一条带 ,回收率达 6 8% .活性和纯度均较高的目的蛋白 3α HSD的获得 。 展开更多
关键词 睾酮假单胞菌 3α-羟类固醇脱氢酶基因 质粒载体 构建 表达 胆汁酸 血清
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紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与表达 被引量:3
9
作者 宋西红 郝磊 +3 位作者 吕晓玲 郭宇 魏曼 赵辰辰 《广东农业科学》 CAS 2015年第11期124-129,共6页
为阐述紫苏中迷迭香酸合成的分子调节机制,应用同源克隆和RACE技术首次从紫苏叶片中克隆得到肉桂酸-4-羟基化酶基因(Per C4H)的全长c DNA序列(Gen Bank登录号:KM434189)。Per C4H基因总长度为1 667 bp,基因的开放阅读框(ORF)为1 518 bp... 为阐述紫苏中迷迭香酸合成的分子调节机制,应用同源克隆和RACE技术首次从紫苏叶片中克隆得到肉桂酸-4-羟基化酶基因(Per C4H)的全长c DNA序列(Gen Bank登录号:KM434189)。Per C4H基因总长度为1 667 bp,基因的开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸残基,还含有长度为21 bp的5′非编码区(5′UTR)和95 bp的3′非编码区(3′UTR)。系统进化树分析得到Per C4H基因与唇形科植物丹参和黄芩的亲缘性最近。由实时荧光定量PCR分析可知,该基因在紫苏中具有组织表达特异性,根中的表达最高,茎中次之,而叶中最少。一定浓度的赤霉素与茉莉酸甲酯能提高Per C4H的表达量,而脱落酸和黑暗处理能降低Per C4H的表达量。 展开更多
关键词 紫苏 迷迭香酸 肉桂酸4-羟基化酶 基因克隆 表达分析
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含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白(SjFABPc)基因DNA重组质粒pCD-SjFABPc在哺乳动物细胞中的表达 被引量:6
10
作者 冯新港 余新炳 +1 位作者 吴忠道 周俊梅 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第5期39-42,共4页
目的 观察裸DNA重组质粒pCD -SjFABPc在体外转染HepG2细胞以及质粒DNA免疫鼠肌组织中的表达 ,为进一步应用该质粒进行DNA免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导DNA转染法将pCD -SjFABPc转染贴壁细胞HepG2 ,G418加压筛选获得阳性克隆细... 目的 观察裸DNA重组质粒pCD -SjFABPc在体外转染HepG2细胞以及质粒DNA免疫鼠肌组织中的表达 ,为进一步应用该质粒进行DNA免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导DNA转染法将pCD -SjFABPc转染贴壁细胞HepG2 ,G418加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养 ,SDS -PAGE及Western -blot鉴定目的基因在HepG2细胞中的表达 ;将pCD -SjFABPc质粒肌注免疫BALB/c小鼠 ,于 6 5d后取注射部位的肌组织约 0 3cm3 大小 ,经固定、包埋、切片 ,免疫酶组织化学染色 ,显微照相记录。结果 在被转染的HepG2细胞裂解样品中 ,呈现一分子量约 14kDa大小且能被感染兔血清特异识别的条带 ;免疫组化结果显示免疫组切片标本中有特异性阳性反应。结论 pCD 展开更多
关键词 日本血吸虫 脂肪酸结合蛋白 重组质粒 DNA
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植物乳杆菌肌球交叉反应抗原MCRA的克隆表达及功能鉴定 被引量:1
11
作者 杨波 陈海琴 +4 位作者 张白曦 宋元达 陈永泉 陈卫 张灏 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期115-119,共5页
根据NCBI中已报道亚油酸异构酶基因的序列特征从植物乳杆菌ZS2058克隆获得了产CLA的关键酶基因肌球交叉反应抗原MCRA,构建表达载体后,在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE和Western Blot检测结果为胞内可溶表达,其大小约为67ku,将MCRA蛋白... 根据NCBI中已报道亚油酸异构酶基因的序列特征从植物乳杆菌ZS2058克隆获得了产CLA的关键酶基因肌球交叉反应抗原MCRA,构建表达载体后,在大肠杆菌中实现了表达,SDS-PAGE和Western Blot检测结果为胞内可溶表达,其大小约为67ku,将MCRA蛋白进行亲和层析后进行功能鉴定,GC-MS结果显示此蛋白能将亚油酸转化为羟基化衍生物10羟基-顺12-十八碳烯酸,将油酸转化为10-羟基-十八碳酸。 展开更多
关键词 肌球蛋白交叉反应抗原 亚油酸 共轭亚油酸 重组表达
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竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的表达载体的构建及重组蛋白抗肿瘤的研究 被引量:1
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作者 何光志 田维毅 +4 位作者 王安宇 王平 曹峰 黄高 王文佳 《湖南师范大学自然科学学报》 CAS 北大核心 2012年第4期59-63,85,共6页
将经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pMD18-T-LAAO和Pet28a(+)质粒的纯化回收产物进行连接,将产物Pet28a(+)-LAAO表达载体转化BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经Western-blot分析表明,重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识... 将经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pMD18-T-LAAO和Pet28a(+)质粒的纯化回收产物进行连接,将产物Pet28a(+)-LAAO表达载体转化BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经Western-blot分析表明,重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别.将鼻咽癌CNE-2Z、人宫颈癌LYA01021和卵巢癌A2780MSC细胞悬液接种小鼠建立小鼠实体瘤模型,分别用不同浓度重组蛋白接种荷瘤小鼠,根据瘤重和小鼠存活时间计算抑瘤率和对荷瘤小鼠生命延长率.结果表明:重组蛋白对低、中和高剂量组荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率与阴性对照组均存在极显著差异(P<0.01).本研究为开发利用竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶提供依据,为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础. 展开更多
关键词 LAAO 表达载体 构建 重组蛋白 抗肿瘤
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植酸酶基因在毕赤酵母中表达及表达酶性质研究 被引量:2
13
作者 张苓花 安利佳 +2 位作者 袁晓东 高晓蓉 王运吉 《大连理工大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期294-300,共7页
PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母... PCR扩增无花果曲霉 As3 .3 2 4的植酸酶基因 phy A ,测序分析表明 ,phy A 全长1 5 1 5 bp,其中 1 1 1个核苷酸为内含子序列 ,共编码 467个氨基酸 ,N端的 1 9个氨基酸为信号肽 ,序列中存在 1 0个潜在的 N-糖基化位点 .构建 phy A 的酵母转化载体 p PIC9K/phy A ,电击法转化毕赤酵母 GS1 1 5 ,获得植酸酶基因重组酵母菌 GS1 1 5 /phy A .其发酵酶活性比 As3 .3 2 4提高了 3 3倍 .GS1 1 5 /phy A 植酸酶作用 p H有两个峰值 ,分别为 2 .5和4.5 ,最适作用温度为 60℃ .与 As3 .3 2 4相比 ,重组毕赤酵母 GS1 1 5 /phy A 植酸酶的热稳定性有显著提高 . 展开更多
关键词 植酸酶基因 毕赤酶母 表达 表达酶
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N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因的克隆与表达
14
作者 杨蕴刘 饶娆 +1 位作者 沈健 冯磊 《浙江大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期57-63,共7页
目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nan... 目的:为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法:以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因(nanA)的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌E.coliDH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果:DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框(open read ing frame,ORF)大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21(DE3),在得到的转化子E.coliBL21(DE3)/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明:本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论:所构建的诱导型产酶菌株E.coliBL21(DE3)/pRY1和组成型表达菌株E.coliDH5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。 展开更多
关键词 N-乙酰神经氨酸/遗传学 果糖-二磷酸醛缩酶 大肠杆菌/遗传学 聚合酶链反应 克隆 分子 重组 遗传 转染 遗传载体 基因表达 重组蛋白质类
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酸敏感离子通道基因重组质粒的构建、表达及其活性测定
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作者 苏敬敬 董强 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期595-601,共7页
为了构建含有小鼠酸敏感离子通道(ASIC1a、ASIC2a)基因全长cDNA的重组质粒,并表达有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白,本研究通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别获得小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA,并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中... 为了构建含有小鼠酸敏感离子通道(ASIC1a、ASIC2a)基因全长cDNA的重组质粒,并表达有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白,本研究通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别获得小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA,并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,构建含小鼠全长ASIC1a和ASIC2a基因的重组质粒pEGFP-ASIC1a和pEGFP-ASIC2a,经DNA测序鉴定序列正确。脂质体法分别将其转染至中国仓鼠卵巢细胞(CHO),荧光显微镜下观察小鼠ASIC1a和ASIC2a融合蛋白在细胞内的表达分布,Westernblot检测其蛋白表达。酸性处理转染重组质粒细胞,并比较其细胞存活率及乳酸脱氢酶(LDH)的释放来评价融合蛋白的生物学活性。结果显示:本研究成功地分别将小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA克隆入pEGFP-N3载体中,并将其转染至CHO细胞,荧光显微镜下观察到CHO细胞膜周围呈强绿色荧光条带,Westernblot显示小鼠ASIC1a和ASIC2a融合蛋白分别在90kD和88kD处有表达。经酸性处理的转染ASIC1a和ASIC2a重组质粒的CHO细胞,分别较其在pH7.4条件下的细胞存活率明显降低,LDH释放量明显增高,且通道阻断剂可抑制该效应。上述结果提示,我们已成功构建出含小鼠ASIC1a和ASIC2a全长cDNA的重组质粒pEGFP-ASIC1a和pEGFP-ASIC2a,并使有生物学活性的ASIC1a和ASIC2a融合蛋白在CHO细胞中表达。 展开更多
关键词 酸敏感离子通道 重组质粒 表达 生物学活性 小鼠
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乳酸脱氢酶突变体D-LDHY52L在大肠杆菌中的重组表达及其合成D-苯基乳酸的研究 被引量:7
16
作者 蒋卓越 季伟 +2 位作者 钱蓓蓓 朱益波 齐斌 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期1-6,共6页
Lactobacillus pentosus D-乳酸脱氢酶的三维构象表明氨基酸序列中第52位的酪氨酸非常接近底物酮酸盐C3位上的基团。该研究利用定点突变技术将第52位的亲水性的酪氨酸替换成疏水性的亮氨酸,有效提高了D-乳酸脱氢酶对底物苯丙酮酸的催化... Lactobacillus pentosus D-乳酸脱氢酶的三维构象表明氨基酸序列中第52位的酪氨酸非常接近底物酮酸盐C3位上的基团。该研究利用定点突变技术将第52位的亲水性的酪氨酸替换成疏水性的亮氨酸,有效提高了D-乳酸脱氢酶对底物苯丙酮酸的催化活力。在大肠杆菌中重组表达后,利用重组菌全细胞转化苯丙酮酸合成D-苯基乳酸。结果表明,D-苯基乳酸的产量比未突变菌株提高了46%,产量达18.47 g/L,转化率达65.96%。 展开更多
关键词 D-乳酸脱氢酶 定点突变 重组表达 苯丙酮酸 D-苯基乳酸
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植物乳杆菌P-8羟基脂肪酸脱氢酶的克隆表达及活性鉴定 被引量:3
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作者 赵彤彤 赵微 +4 位作者 王丹 赵国芬 刘扬 张和平 包秋华 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期36-40,共5页
以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板扩增出其羟基脂肪酸脱氢酶基因,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因共编码286个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为32 k Da,理论等电点为5. 15,不含跨膜区,是1个亲水性的细胞质蛋白。Ser、Thr、Tyr磷... 以植物乳杆菌P-8的基因组DNA为模板扩增出其羟基脂肪酸脱氢酶基因,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因共编码286个氨基酸,蛋白质理论分子质量约为32 k Da,理论等电点为5. 15,不含跨膜区,是1个亲水性的细胞质蛋白。Ser、Thr、Tyr磷酸化位点个数分别为3、3、7。蛋白质的二级结构主要构成方式为α螺旋、无规则卷曲和β折叠。将此基因连接到p ET-28a(+)质粒载体中构建重组质粒p ET28a-DH,并转化入大肠杆菌E. coli Transetta (DE3)中获得重组大肠杆菌。重组菌在16℃条件下,经0. 1 mmol/L IPTG诱导16 h有可溶性表达,经Western Blot验证确定为重组羟基脂肪酸脱氢酶。通过镍柱亲和层析,得到纯化的重组酶。重组酶经初步活性检测,结果显示重组酶可以转化10-羟基-顺-12-十八碳烯酸为10-氧代-顺-12-十八碳烯酸,本研究为进一步探明植物乳杆菌P-8转化共轭亚油酸的机制奠定了基础。 展开更多
关键词 植物乳杆菌P-8 羟基脂肪酸脱氢酶 生物信息学 共轭亚油酸 重组表达
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谷氨酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的表达及应用 被引量:1
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作者 邱玲 陈晟 +1 位作者 吴敬 黄燕 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期32-41,共10页
为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒pHY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B.subtil... 为了研究在枯草芽孢杆菌发酵过程中添加相对廉价的辅酶前体对谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活力和催化效率的影响,将来源于Escherichia coli的谷氨酸脱羧酶基因gadB,通过构建重组质粒pHY300PLK-gadB,在枯草芽孢杆菌中重组表达,得到重组菌B.subtilis/pHY300PLK-gadB。研究了分别在重组菌发酵过程中添加辅酶磷酸吡哆醛(PLP)、辅酶前体吡哆醛(PL)和吡哆醇(PN)对GAD酶活力的影响。当设置摇床转速200 r/min,发酵温度33℃,发酵培养基初始pH 7.0时,在发酵过程中分别添加PLP、PL、PN至终浓度0.5 mmol/L,诱导48 h后发酵液中总酶活分别达到25.40、28.14、15.55 U/mL,是对照总酶活的1.55、1.72、0.95倍。基于以上结果,进一步研究了发酵过程中PL的添加浓度对重组菌生长情况及GAD表达的影响。结果表明,发酵液中GAD总酶活随着PL浓度的增加而增加,当PL浓度为0.1 mmol/L时,总酶活最高达到28.28 U/mL。利用重组菌全细胞制备γ-氨基丁酸(GABA),结果表明,最适转化pH为5.0,最适转化温度为40℃,发酵过程中添加PL的重组菌(简称“GAD-PL”)和发酵过程中不添加任何辅酶及辅酶前体的重组菌(简称“GAD-0”)的最适加菌量(以酶活力单位计)分别是40 U/g(以谷氨酸计)和50 U/g(以谷氨酸计),当谷氨酸最终质量浓度达到400 g/L时,得到的GABA质量浓度分别为275.60 g/L和273.61 g/L。 展开更多
关键词 谷氨酸脱羧酶 枯草芽孢杆菌 重组表达 Γ-氨基丁酸
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大豆橙花叔醇合酶基因克隆及功能鉴定 被引量:2
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作者 梁瑾 王强 《中国油料作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期744-751,共8页
通过同源检索得到大豆橙花叔醇合酶(nerolidol synthase,Gm NES)基因Glyma13g32380,采用RT-PCR方法从经水杨酸(SA)处理的大豆材料中,克隆到c DNA片段,其包括完整的ORF(1 605bp)。共编码534个氨基酸,蛋白分子量约62.338 k D。该蛋白序列... 通过同源检索得到大豆橙花叔醇合酶(nerolidol synthase,Gm NES)基因Glyma13g32380,采用RT-PCR方法从经水杨酸(SA)处理的大豆材料中,克隆到c DNA片段,其包括完整的ORF(1 605bp)。共编码534个氨基酸,蛋白分子量约62.338 k D。该蛋白序列与番茄等植物的NES序列同源性较高,包含DDXXD保守结构域。将该ORF构建入p ET28a表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达为可溶性蛋白。通过与法尼基焦磷酸合酶基因在大肠杆菌中进行微生物代谢工程共表达,气质联用检测到橙花叔醇的生成。同时还检测到SA模拟生物胁迫处理诱导大豆叶片产生橙花叔醇,并且在1.0 mmol/L SA处理下,Gm NES基因表达量明显上调。本研究克隆了大豆橙花叔醇合酶基因,并鉴定了其生化功能及其在植物体内的生理相关性,为研究大豆萜类代谢及对病虫害的防御反应和抗性品种选育提供了理论依据。 展开更多
关键词 大豆 橙花叔醇 橙花叔醇合酶 水杨酸 原核表达 气质联用
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自毒胁迫对黄瓜砧穗种子萌发和抗氧化特性的影响
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作者 肖雪梅 马宁 +4 位作者 李菊 王瑞 胡琳莉 武玥 郁继华 《中国蔬菜》 北大核心 2022年第9期22-29,共8页
为探明黄瓜砧穗种子萌发对自毒胁迫的响应差异及其潜在的生理代谢和基因调控机制,以黄瓜和黑籽南瓜为试材,设置0.25 mmol·L^(-1)外源肉桂酸(CA)模拟自毒胁迫,以蒸馏水为对照,研究肉桂酸对黄瓜和黑籽南瓜种子萌发、胚根形态、活性... 为探明黄瓜砧穗种子萌发对自毒胁迫的响应差异及其潜在的生理代谢和基因调控机制,以黄瓜和黑籽南瓜为试材,设置0.25 mmol·L^(-1)外源肉桂酸(CA)模拟自毒胁迫,以蒸馏水为对照,研究肉桂酸对黄瓜和黑籽南瓜种子萌发、胚根形态、活性氧积累和抗氧化系统的影响。结果表明:CA处理显著抑制了黄瓜的种子萌发和胚根生长,其发芽率和胚根的总根长、根表面积、根体积、根尖数分别比对照降低了7.8百分点和28.1%、22.2%、14.9%、46.6%;而黑籽南瓜发芽率略有升高,仅根表面积下降了17.2%。CA处理显著促进了黄瓜过氧化氢(H_(2)O_(2))和超氧阴离子(O_(2)^(-).)在发芽各个时期的积累,MDA含量在发芽48 h时较对照显著增加了26.2%;而黑籽南瓜除发芽后期(48、72 h)显著积累H_(2)O_(2)外,其余指标均与对照无显著差异。CA处理引起黄瓜SOD、CAT、APX和GR活性先升高后降低,在发芽48 h时分别比对照降低了26.0%、33.3%、65.2%和26.7%;而黑籽南瓜的酶活性始终高于或接近于对照。CA处理的黄瓜抗氧化酶基因Cu-ZnSOD、Fe-MnSOD、CAT、APX和GR表达量分别下调95%、73%、70%、91%和89%,而黑籽南瓜的这5个基因分别上调148%、272%、148%、199%和272%。因此,黑籽南瓜种子萌发对肉桂酸胁迫的耐受性高于黄瓜,可能取决于其较发达的根系和较强的抗氧化能力。 展开更多
关键词 肉桂酸 黄瓜 黑籽南瓜 种子萌发 抗氧化酶 基因表达
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