用免疫亲和层析法纯化萝卜PHGPx天然蛋白(英文) 被引量：7

1

作者 杨晓东 刘进元 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第8期794-799,共6页

萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(RsPHGPx)是一个定位于线粒体的蛋白质.为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的RsPHGPx.用重组RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组RsPH ... 萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(RsPHGPx)是一个定位于线粒体的蛋白质.为了阐明该蛋白质线粒体定位信号的准确切割位点,采用了免疫亲和层析方法纯化天然的RsPHGPx.用重组RsPHGPx 蛋白免疫兔子获得了抗RsPHGPx 的多克隆抗血清,以重组RsPH G Px 蛋白为配体,采用亲和层析技术对抗血清进行了纯化,得到了单特异性的抗RsPHGPx 的抗体.将纯化好的抗体偶联到一个N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)预先激活的琼脂糖柱子上,装配成一个以单特异性的抗RsPHGPx 抗体为配体的免疫亲和层析柱.经过对纯化条件的摸索和优化,形成了一个简单、特异的一步法纯化方案.按照该方案,从萝卜幼苗线粒体总蛋白质提取物中纯化到一个分子质量与预期值相一致的特异蛋白质.免疫印迹分析表明,该蛋白质被抗RsPH G Px 的抗血清特异识别.酶活性分析表明,该蛋白质具有显著的PH G Px 活性.这些结果表明,纯化到的特异蛋白质是萝卜的RsPH G Px天然蛋白.这是首个关于定位于植物细胞器的PH G Px 蛋白纯化的报道.这一结果为准确测定RsPH G Px 信号肽的切割位点奠定了基础,并将有助于对植物PH G Px 的亚细胞定位机制及其生理功能的深入研究. 展开更多

关键词 免疫亲和层析 天然蛋白质 多克隆抗体 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 萝卜

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NtPHGPx基因过表达和敲除对烟草苗期耐盐性的影响 被引量：2

2

作者 郭鹏诚 杨晓宁 +5 位作者 毛辉 王学波 申展 刘旦 杨爱国 王元英 《中国烟草科学》 CSCD 北大核心 2021年第2期8-14,27,共8页

为研究NtPHGPx基因对烟草耐盐性的影响,通过转基因技术获得NtPHGPx基因过表达和CRISPR/Cas9敲除材料,利用150 mmol/L NaCl对转基因材料处理14 d,研究盐处理下转基因材料根长、GPx酶活性、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H_(2)O_(2))含量的变化... 为研究NtPHGPx基因对烟草耐盐性的影响,通过转基因技术获得NtPHGPx基因过表达和CRISPR/Cas9敲除材料,利用150 mmol/L NaCl对转基因材料处理14 d,研究盐处理下转基因材料根长、GPx酶活性、丙二醛(MDA)和过氧化氢(H_(2)O_(2))含量的变化。结果表明,NtPHGPx基因表达在盐胁迫3 h后即受到诱导;盐处理显著抑制了野生型烟草根部的生长,提高了丙二醛和过氧化氢的积累;盐胁迫下过表达株系的根长比野生型更长,MDA和H_(2)O_(2)含量较低,而基因敲除材料根的生长则进一步受到抑制,GPx酶活性明显降低,地上部MDA和H_(2)O_(2)的积累显著高于野生型。综上所述,过表达NtPHGPx基因提高了烟草的耐盐性,而敲除NtPHGPx基因则减弱了烟草的耐盐性,推测NtPHGPx基因可能通过影响烟草体内活性氧物质的清除活性参与植株对盐害的胁迫响应。 展开更多

关键词 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 耐盐性 基因功能 烟草

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苦瓜谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶cDNA的克隆及其特征分析 被引量：14

3

作者 李文君 刘进元 赵南明 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第6期908-911,共4页

根据谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶 (PHGPX)氨基酸序列中高度保守的区段设计引物 ,采用RACE PCR从苦瓜中克隆到一个全长 92 7bp的cDNA片段 .DNA序列的数据库分析比较表明 ,该cDNA编码 16 7个氨基酸 ,含有动植物PHGPX的特征结构 ,是一个新发... 根据谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶 (PHGPX)氨基酸序列中高度保守的区段设计引物 ,采用RACE PCR从苦瓜中克隆到一个全长 92 7bp的cDNA片段 .DNA序列的数据库分析比较表明 ,该cDNA编码 16 7个氨基酸 ,含有动植物PHGPX的特征结构 ,是一个新发现的苦瓜PHGPX基因 (mocPHGPX) .RNA印迹结果显示 ,该基因在苦瓜幼苗的根中表达相对较弱 ,茎的信号较强 ,叶中最强 . 展开更多

关键词 苦瓜 CDNA 克隆 序列特征 谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶 植物

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麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶高效可溶性表达及其部分酶学性质 被引量：2

4

作者 王晶晶 张新笑 +4 位作者 卞欢 耿志明 李鹏鹏 王道营 徐为民 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期1120-1126,共7页

[目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨... [目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础。[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→ Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质。[结果]克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 kD,理论等电点(pI)为8.9。构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DG-Px4。以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32 ℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu^2+和Ni^2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg^2+和Mn^2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca^2+和Zn^2+对DG-Px4活力则无明显的促进或抑制作用。[结论]从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用。 展开更多

关键词 麻鸭 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPx4) 原核表达 纯化 酶学性质

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萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因结构及其调控序列分析(英文) 被引量：6

5

作者 杨晓东 刘进元 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第7期649-656,共8页

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族的重要一员,是目前已知能直接保护生物膜免受过氧化损伤的唯一酶类.此前的研究表明,萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(RsPHGPx)编码一个有生理功能的过氧化物酶,并且RsPH... 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)家族的重要一员,是目前已知能直接保护生物膜免受过氧化损伤的唯一酶类.此前的研究表明,萝卜磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(RsPHGPx)编码一个有生理功能的过氧化物酶,并且RsPHGPx基因的表达可能受发育和环境胁迫信号的复杂调控.要深入了解该基因的表达调控机制首先必须阐明RsPHGPx基因的结构及其上游调控序列.DNA印迹表明萝卜RsPHGPx基因以单拷贝的形式存在于基因组中.以基因组DNA为模板,通过常规PCR与染色体步行相结合的方法克隆到了一段3.3kb长的RsPHGPx基因组序列.分析发现,该基因由7个外显子和6个内含子组成,所有内含子的剪切位点均符合真核生物GT-AG规则.另外还发现该基因的上游基因是生物素合成酶基因;位于RsPHGPx基因上游的调控序列只有不足300bp.这些结构特征与拟南芥AtGPX3基因极其相似.顺式作用元件的数据库搜索发现RsPHGPx基因的上游调控序列含有多个响应激素(如E-Box和W-Box)、胁迫(如转录因子MYB和MYC的结合位点)和光(如BoxⅡ和Ⅰ-Box)信号的元件.RNA印迹分析表明RsPHGPx基因的表达受到脱落酸(ABA)和连续光照(在黄化苗中)处理的负调控,受到冷胁迫(4℃)的正调控,这暗示了预测的顺式作用元件的调控作用.然而,除草剂paraquat对该基因表达的正调控作用,暗示了某些与氧化胁迫相关的未知元件的存在.这些结果进一步印证了RsPHGPx基因的表达受发育和环境胁迫信号复杂调控的推测.这是迄今为止首个关于植物PHGPx基因结构和上游调控序列的系统报道,为今后全面认识植物PHGPx基因的表达调控机制奠定了必要基础. 展开更多

关键词 萝卜 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 基因结构 上游调控序列 顺式作用元件

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磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶在精子发育中的作用研究进展 被引量：2

6

作者 蔡丝丝 刘金 +1 位作者 王林川 陈芳艳 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第16期116-119,146,共5页

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是广泛存在于哺乳动物细胞内唯一能够直接还原生物膜上脂类过氧化物的一类含硒酶。该酶在保护细胞膜完整、维持细胞的正常功能中发挥着重要作用;同时PHGPx还作为精子的结构物质,在精子的发育和成熟过程... 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)是广泛存在于哺乳动物细胞内唯一能够直接还原生物膜上脂类过氧化物的一类含硒酶。该酶在保护细胞膜完整、维持细胞的正常功能中发挥着重要作用;同时PHGPx还作为精子的结构物质,在精子的发育和成熟过程中发挥着重要作用;精液中PHGPx活性是评价精液品质的重要参数之一。对PHGPx的基因结构、体内分布以及与精子发育与成熟相关的生物学特性和功能等研究进展进行了总结。 展开更多

关键词 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phgpx) 生物学功能 精子发育与成熟

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山参磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶cDNA克隆及序列分析 被引量：1

7

作者 冯凯 李胜 +3 位作者 麻锐 姜锐 孙立伟 陈伟 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2016年第11期152-155,共4页

磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有明显的抗氧化活性,避免细胞膜受到过氧化损伤。本研究利用RACE技术,克隆出山参phgpx基因全长c DNA。序列分析表明:该克隆片段全长490 bp,编码162个氨基酸,有3个真核生物PHGPx特有的保守亚结构域。... 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有明显的抗氧化活性,避免细胞膜受到过氧化损伤。本研究利用RACE技术,克隆出山参phgpx基因全长c DNA。序列分析表明:该克隆片段全长490 bp,编码162个氨基酸,有3个真核生物PHGPx特有的保守亚结构域。该片段编码的蛋白为跨膜亲水性稳定蛋白质,与柑橘、蓖麻等PHGPx氨基酸序列同源性分别为76%和75%。同时建立了9种植物的系统进化树。 展开更多

关键词 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 基因克隆 山参

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N末端缺失萝卜谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的表达、纯化及结构预测 被引量：2

8

作者 王丰 刘进元 《吉林大学学报（理学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期148-153,共6页

将N末端定位信号缺失萝卜PHGPx(RsPHGPx)的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化至大肠杆菌内进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了用于晶体学研究的RsPHGPx.其浓度约为10 g/L,纯度超过95%,具有PHGPx活性... 将N末端定位信号缺失萝卜PHGPx(RsPHGPx)的cDNA片段克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化至大肠杆菌内进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了用于晶体学研究的RsPHGPx.其浓度约为10 g/L,纯度超过95%,具有PHGPx活性.三维结构同源建模显示RsPHGPx的结构为典型的硫氧还蛋白折叠形式. 展开更多

关键词 萝卜 谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶 表达 纯化

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水稻谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶的表达、纯化及晶体生长条件初筛 被引量：1

9

作者 王丰 刘进元 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2007年第9期1701-1706,共6页

将水稻PHGPx(OsPHGPx)的编码序列克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化为大肠杆菌进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了可用于晶体学研究的OsPHGPx,其纯度超过95%,具备明显的PHGPx活性.质谱显示OsPHGPx的精确分子... 将水稻PHGPx(OsPHGPx)的编码序列克隆到表达载体pGEX-6P-1上,并转化为大肠杆菌进行表达.通过GST亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析,制备了可用于晶体学研究的OsPHGPx,其纯度超过95%,具备明显的PHGPx活性.质谱显示OsPHGPx的精确分子量为19642.5553,与理论分子量基本一致.OsPHGPx在多个晶体生长条件下出现微晶.三维结构同源建模显示OsPHGPx的结构为硫氧还蛋白折叠形式. 展开更多

关键词 水稻 谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶 表达 纯化 晶体生长 三维结构建模

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烟粉虱MEAM1隐种磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆与表达分析

10

作者 纠敏 汪伦记 +4 位作者 任利娜 代威 李晶晶 赵君峰 张敏 《昆虫学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期141-149,共9页

【目的】本研究旨在从烟粉虱Bemisia tabaci中东-小亚细亚1隐种(Middle East-Asia Minor 1, MEAM1)中克隆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, PHGPX)基因,鉴定其在烟粉虱不同发育阶段及吡虫... 【目的】本研究旨在从烟粉虱Bemisia tabaci中东-小亚细亚1隐种(Middle East-Asia Minor 1, MEAM1)中克隆磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase, PHGPX)基因,鉴定其在烟粉虱不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达情况,明确其在烟粉虱应对外界环境压力中的功能。【方法】利用3′RACE克隆和测定烟粉虱MEAM1隐种内PHGPX基因的cDNA全长序列,并对其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;利用定量RT-PCR技术对该基因在烟粉虱MEAM1隐种不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的表达量进行分析。【结果】获得了烟粉虱MEAM1隐种两个磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,分别命名为BtB-PHGPX1(GenBank登录号:KY312116)和BtB-PHGPX2(GenBank登录号:KY312117)。序列分析表明,BtB-PHGPX1基因开放阅读框全长732 bp,编码243个氨基酸;BtB-PHGPX2基因开放阅读框全长567 bp,编码188个氨基酸。序列比对结果表明两基因的编码蛋白内均具有谷胱甘肽过氧化物酶保守的半胱氨酸、谷氨酰胺和色氨酸残基位点。BtB-PHGPX1在烟粉虱MEAM1隐种卵内表达量显著高于其在若虫、伪蛹、雌成虫和雄成虫内的表达量,BtB-PHGPX2在烟粉虱MEAM1隐种卵内的表达量显著低于其在若虫、伪蛹和雌成虫内的表达量(P<0.05)。BtB-PHGPX1和BtB-PHGPX2在雌成虫内的表达量均显著高于雄成虫内。吡虫啉处理雌成虫2 h时两基因的表达量均较对照显著提高(P<0.05),处理后5, 10和24 h时其表达量均较对照显著下降(P<0.01)。【结论】本研究克隆了烟粉虱MEAM1隐种两个PHGPX基因的序列全长,明确了其在不同发育阶段及吡虫啉处理不同时间后雌成虫体内的差异表达,推测PHGPX在烟粉虱抵御环境压力及杀虫剂胁迫时可能发挥着重要的防御作用。 展开更多

关键词 烟粉虱 MEAM1隐种 磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶 氧化应激 吡虫啉

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肾病综合征患儿血红细胞磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶活力的研究

11

作者 庞希宁 宋今丹 +2 位作者 王淑兰 陈铭 杨春宏 《中国医科大学学报》 CSCD 1996年第3期274-275,278,共3页

本文对１７例肾病综合征（ＮＳ）患儿和１５例健康对照组儿童血红细胞磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（ＰＨＧＰｘ）活力，脂溶性荧光色素（ＬＳＦＰ）含量进行了研究。结果表明，ＮＳ急性期ＰＨＧＰｘ活力明显降低．ＬＳＦＰ含量增加... 本文对１７例肾病综合征（ＮＳ）患儿和１５例健康对照组儿童血红细胞磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（ＰＨＧＰｘ）活力，脂溶性荧光色素（ＬＳＦＰ）含量进行了研究。结果表明，ＮＳ急性期ＰＨＧＰｘ活力明显降低．ＬＳＦＰ含量增加；恢复期ＰＨＧＰｘ活力较急性期明显提高，但仍低于正常对照组，ＬＳＦＰ虽较急性期下降，但仍高于正常对照组。说明ＮＳ存在ＰＨＧＰｘ和ＬＳＦＰ的改变，但可逐渐恢复。 展开更多

关键词 肾病综合征 磷脂 谷胱甘肽 过氧化物酶 儿童

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急性肾小球肾炎患儿血红细胞磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶活力的研究

12

作者 庞希宁 宋今丹 王淑兰 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第z1期1-2,5,共3页

目的:探讨急性肾小球肾炎（AGN）与磷脂过氧化的关系。方法:用生物化学的方法检测血红细胞磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）活力和脂溶性荧光色素（MFP）含量。结果:通过对17例AGN患儿和15例健康人研究表明:AGN急性期PHGPx活力... 目的:探讨急性肾小球肾炎（AGN）与磷脂过氧化的关系。方法:用生物化学的方法检测血红细胞磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶（PHGPx）活力和脂溶性荧光色素（MFP）含量。结果:通过对17例AGN患儿和15例健康人研究表明:AGN急性期PHGPx活力明显降低,LSFP含量增加,恢复期二者与正常对照组均无显著差异。结论:AGN存在磷脂过氧化改变,并且是可逆的。 展开更多

关键词 急性肾小球肾炎 磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶 脂溶性荧光色素

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