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人GST-AWP1融合蛋白的原核表达及其抗体制备 被引量：4
1
作者 莫永炎 刘亚伟 +4 位作者 王静珍 邓鹏 秦清和 杨志刚 姜勇 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期168-172,共5页
为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1c... 为进一步研究人的一新蛋白———蛋白激酶C相关激酶 1相关蛋白 (AWP1)的结构、功能及与其相互作用的蛋白而进行GST AWP融合蛋白表达载体的构建、原核表达、纯化及其抗体的制备 .采用逆转录PCR(RT PCR)法从人ECV30 4内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区 ,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶 (GST)融合蛋白表达质粒pGEX KG中 .经酶切、序列鉴定分析后 ,用该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1,并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导产生GST AWP1融合蛋白 ,继而纯化获得了分子量约 5 6kD的融合蛋白 .将此融合蛋白免疫新西兰兔 ,经ELISA和Western印迹检测获得了效价高、免疫活性强的兔抗人多克隆抗体 .结果表明成功构建了GST AWP1融合蛋白表达载体 ,在大肠杆菌高效表达了GST AWP1融合蛋白 ,并获得高效多抗 。 展开更多
关键词 信号传导分子 蛋白激酶C相关激酶1相关蛋白 原核表达 制备 gst-AWP1融合蛋白 多克隆抗体
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人S100A2-GST融合蛋白原核表达和纯化 被引量：3
2
作者 卫佳 王胜 +6 位作者 苗静琨 陈英华 李星星 吴丽美 左国伟 何通川 周兰 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2008年第12期1427-1430,共4页
目的:制备人S100A2-GST融合蛋白(Human S100A2-GST fusion protein,hS100A2-GST),为进一步研究人hS100A2蛋白的功能及其与其它因子或系统的相互作用奠定基础。方法:从pHAHA-hS100A2中双酶切获取hS100A2基因,亚克隆至原核表达载体pGST-mo... 目的:制备人S100A2-GST融合蛋白(Human S100A2-GST fusion protein,hS100A2-GST),为进一步研究人hS100A2蛋白的功能及其与其它因子或系统的相互作用奠定基础。方法:从pHAHA-hS100A2中双酶切获取hS100A2基因,亚克隆至原核表达载体pGST-moluc,构建pGST-moluc-hS100A2,转化BL21后酶切鉴定,IPTG诱导重组菌表达融合蛋白hS100A2-GST,再经过Glutathion-Sepharose4B球珠分离纯化、SDS-PAGE及Western Blot鉴定,Bradford法蛋白定量。结果:XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切该重组质粒后获得2个片段,分别约300bp和5kb,提示pGST-moluc-hS100A2构建正确;重组菌株经过IPTG诱导后,表达分子量约为36kD的蛋白,产率达5mg/L菌液;Glutathion-Sepharose4B球珠纯化后,该融和蛋白纯度达92%;Western Blot显示该蛋白可以被S100A2的抗体特异识别,证实其为hS100A2-GST融合蛋白。结论:成功构建了hS100A2-GST原核表达质粒pGST-moluc-hS100A2;该质粒可在大肠杆菌中诱导表达hS100A2-GST融合蛋白,产率高;应用Glutathion-Sepharose4B球珠可获得纯度达92%的该蛋白。为后续有关hS100A2的研究打下了基础。 展开更多
关键词 人S100A2-gst融合蛋白 诱导表达 蛋白纯化 蛋白鉴定
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牛FcγRⅠ(CD64)GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达 被引量：2
3
作者 张改平 乔松林 +5 位作者 李青梅 王丽 张红 郭军庆 王选年 夏春 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2005年第6期79-82,共4页
采用PCR技术从牛巨噬细胞cDNA文库中扩增了牛的高亲和力IgGFc受体FcγRⅠ,测序结果显示与已报道的牛FcγRⅠ序列一致。在牛FcγRⅠ成熟蛋白胞外环区两端分别合成带有BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到GST融合蛋白表... 采用PCR技术从牛巨噬细胞cDNA文库中扩增了牛的高亲和力IgGFc受体FcγRⅠ,测序结果显示与已报道的牛FcγRⅠ序列一致。在牛FcγRⅠ成熟蛋白胞外环区两端分别合成带有BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX - 6P- 1,转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导,SDS -PAGE分析表达了N端带有GST的融合蛋白,Western -blotting试验表明融合蛋白在变性条件下能和牛IgG结合。GST -FcγRⅠ融合蛋白的成功表达为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。 展开更多
关键词 牛FcγRⅠ(CD64) gst融合蛋白 表达
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以GST融合蛋白为靶从噬菌体肽库中筛选结合肽 被引量：2
4
作者 薛沿宁 段凌浔 R.J.POMERANTZ 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第4期381-384,共4页
以重组的谷胱甘肽 Ｓ转移酶 （ Ｇ Ｓ Ｔ） 和目标蛋白的融合蛋白为靶， 通过将其固定于谷胱甘肽琼脂糖凝胶上， 可以方便地从噬菌体肽库中筛选目标蛋白的结合肽． 用此方法筛选到含 Ｗ Ｗ Ｘ Ｆ 结构的 Ｈ Ｉ Ｖ１ 病毒蛋白 ... 以重组的谷胱甘肽 Ｓ转移酶 （ Ｇ Ｓ Ｔ） 和目标蛋白的融合蛋白为靶， 通过将其固定于谷胱甘肽琼脂糖凝胶上， 可以方便地从噬菌体肽库中筛选目标蛋白的结合肽． 用此方法筛选到含 Ｗ Ｗ Ｘ Ｆ 结构的 Ｈ Ｉ Ｖ１ 病毒蛋白 Ｒ（ Ｖｐｒ） 的结合肽， 与经典的将 Ｖｐｒ 包被于培养板上的筛选方法相比， 此方法具有简便。 展开更多
关键词 噬菌体展示 gst融合蛋白 多肽库 结合肽
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重组蛋白GST-OsCAT_B的表达特性研究(英文) 被引量：1
5
作者 刘大丽 鲁振强 +2 位作者 张革艳 于婷婷 王旭 《植物研究》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期692-695,共4页
为了阐明水稻Catalase(CAT)的酶学功能,首先需要获得出足量的、活性的该酶蛋白。本研究克隆了水稻OsCATB基因(GenBank accession No.D26484),构建到原核表达载体pGEX-6p-3中形成重组蛋白,继而转入E.coli菌株BL21中进行表达特性研究。结... 为了阐明水稻Catalase(CAT)的酶学功能,首先需要获得出足量的、活性的该酶蛋白。本研究克隆了水稻OsCATB基因(GenBank accession No.D26484),构建到原核表达载体pGEX-6p-3中形成重组蛋白,继而转入E.coli菌株BL21中进行表达特性研究。结果表明,GST-OsCATB融合蛋白在E.coli中进行了过量表达,表达受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度和诱导体系等多因素影响;通过谷胱甘肽Sepharose-4B亲合层析,纯化出足量、活性的融合蛋白GST-OsCATB,每克表达细胞(干重)中得率为51 mg GST-OsCATB。 展开更多
关键词 过氧化氢酶(CAT) 水稻 谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白(gst) 蛋白纯化 E.COLI
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GST-HDAC4融合蛋白载体的构建及其蛋白表达 被引量：1
6
作者 邵阳光 刘姣 李丰 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期149-151,共3页
目的构建人HDAC4蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达和纯化。方法用EcoRI单酶切pcDNA3.1-HDAC4质粒,得到hHDAC4全长编码序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-5X-1构建成新载体GST-HDAC4,经鉴定完全正确后转... 目的构建人HDAC4蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达和纯化。方法用EcoRI单酶切pcDNA3.1-HDAC4质粒,得到hHDAC4全长编码序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-5X-1构建成新载体GST-HDAC4,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌BL21,通过异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并纯化获得目的蛋白。Western blot检测重组质粒的表达。结果酶切鉴定和测序结果显示,GST-HDAC4融合蛋白原核表达载体构建成功。考马斯亮蓝染色和Western blot结果显示,成功获得有生物活性的GST-HDAC4融合蛋白。结论成功构建了HDAC4原核表达载体,获得有生物活性的GST-HDAC4蛋白。 展开更多
关键词 gst—HDAC4 原核表达 融合蛋白
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VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定
7
作者 魏玉英 宋朝君 +4 位作者 孙元杰 龚玖瑜 金伯泉 杨安钢 杨琨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期870-872,874,共4页
目的:构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:由公司合成VEG-FR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白... 目的:构建人血管内皮细胞生长因子II型受体(VEGFR2)胞膜外区第三及第四个免疫球蛋白样结构域与GST融合蛋白VEGFR2 D3.4/GST基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:由公司合成VEG-FR2胞膜外区第三、第四免疫球蛋白样结构域氨基酸的编码序列,克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX4T-VEGFR2 D3.4,将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果:SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为46 000,与理论值相符,主要以包含体形式存在;灰度扫描分析融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38.6%,纯化产物纯度最高为87.1%,Western blot证实该蛋白为VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。结论:利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包含体形式VEGFR2 D3.4/GST融合蛋白。 展开更多
关键词 VEGFR2 gst 融合蛋白 原核表达 纯化
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人p21活化激酶6基因截短区域的GST标签原核表达质粒的构建及其重组蛋白的表达
8
作者 刘彤 李洋 +2 位作者 李丹妮 耿楠希 李丰 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期437-440,共4页
目的:构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6为模板,PCR扩增出PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经... 目的:构建人p21活化激酶6(PAK6)的各个截短区域原核表达质粒,并诱导和鉴定其融合蛋白的表达,为探讨PAK6基因的生物学功能提供依据。方法:以真核表达质粒pcDNA3.1-GFP-PAK6为模板,PCR扩增出PAK6基因的各个截短片段。所获得的各截短片段经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆至GST标签的原核表达载体pGEX-5X-1中。将构建的PAK6各截短质粒转化入E.coli BL21中,采用IPTG诱导PAK6基因截短融合蛋白表达,采用Western blotting法鉴定PAK6基因截短融合蛋白的表达。结果:EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切后得到与预期大小相符的载体片段(5 000bp)和PAK6 1-55(165bp)、PAK6 56-210(465bp)、PAK6 211-410(600bp)及PAK6 385-681(891bp)4个片段。Western blotting检测,PAK6各截短区域质粒GST-PAK6截短融合蛋白相对分子质量分别为32 000、43 000、48 000和60 000。结论:成功构建PAK6基因各个截短区域GST标签原核表达质粒并表达其重组蛋白。 展开更多
关键词 P21活化激酶 截短区域 原核表达质粒 gst融合蛋白
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GST-Jab1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化
9
作者 黄瑾 郑玉建 +1 位作者 鲁重元 万梅 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 2007年第5期585-588,共4页
目的获取GST-Jab1蛋白,进一步研究Jab1的功能。方法以pMSCVneo-Jab1为模板,PCR扩增Jab1 DNA片断,EcoRI和XhoI双酶切后克隆至pGEX-5X-1表达载体,测序验证。将正确重组的pGEX-5X-1-Jab1表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导后,超声破碎细胞,... 目的获取GST-Jab1蛋白,进一步研究Jab1的功能。方法以pMSCVneo-Jab1为模板,PCR扩增Jab1 DNA片断,EcoRI和XhoI双酶切后克隆至pGEX-5X-1表达载体,测序验证。将正确重组的pGEX-5X-1-Jab1表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导后,超声破碎细胞,用GST琼脂糖珠对上述表达产物进行纯化,SDS-PAGE、Western Blot分析和鉴定诱导表达和纯化的GST-Jab1蛋白质。结果成功构建了pGEX-5X-1-Jab1重组表达载体,SDS-PAGE分析结果显示表达和纯化的蛋白质与融合蛋白GST-Jab1预期分子量一致,Western Blot鉴定结果证实纯化的蛋白质为GST-Jab1。结论成功地表达、纯化了GST-Jab1融合蛋白。 展开更多
关键词 JAB1 gst融合蛋白原核表达 蛋白质纯化
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GST-talin1融合蛋白的原核表达及纯化
10
作者 吴爽 耿建国 《生物学杂志》 CAS CSCD 2008年第3期33-35,共3页
应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST-talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将... 应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST-talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用G lutath ione Sepharose 4B柱纯化,western b lot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121.6kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST-talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST-talin1融合蛋白。 展开更多
关键词 TALIN P-选凝素 gst-融合蛋白 亲和层析
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GST-HRB融合蛋白的表达与纯化 被引量：1
11
作者 刘丽杰 高学娟 +3 位作者 刘小会 陈妙娟 朱森 刘朗夏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期172-176,共5页
构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒。然... 构建GST-HRB重组质粒,进行融合蛋白的表达、纯化及鉴定。利用PCR扩增及基因重组技术,以pcDNA-3.1-HRB为模板扩增出HRB全基因序列,并将其插入带有GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签的原核表达载体pGEX-6P-1中,构建GST-HRB融合蛋白表达质粒。然后,将重组质粒GST-HRB转化至大肠杆菌Rosseta进行融合蛋白的表达。利用GST琼脂糖珠进行融合蛋白的纯化,最后应用SDS-PAGE电泳和Western blotting鉴定纯化的融合蛋白。结果表明,成功构建pGEX-6P-1-HRB原核表达载体,表达及纯化了GST-HRB融合蛋白。 展开更多
关键词 gst-HRB 构建 融合蛋白 表达 纯化
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NY-ESO-1/GST融合蛋白在大肠杆菌的表达、纯化及鉴定 被引量：1
12
作者 汤蕾 宋朝君 +4 位作者 孙元杰 李娜 魏玉英 孙奕 杨琨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期1094-1097,共4页
目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白NY-ESO-1/GST进行纯化和初步鉴定。方法:设计针对NY-ESO-1的特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段,经... 目的:构建肿瘤-睾丸抗原NY-ESO-1与GST融合基因的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并对融合蛋白NY-ESO-1/GST进行纯化和初步鉴定。方法:设计针对NY-ESO-1的特异性引物,采用聚合酶链反应(PCR)从睾丸组织的cDNA文库扩增NY-ESO-1基因片段,经上下游引物所引入的EcoR I和Xho I双酶切后克隆入原核表达载体pGEX-4T1中GST标签的下游,构建重组表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST融合蛋白,经不同浓度尿素洗脱纯化后,表达产物通过SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定。结果:重组质粒经限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切鉴定和IPTG诱导表达NY-ESO-1/GST的SDS-PAGE分析表明,表达产物的相对分子质量(Mr)为44 000,与理论值相符,并主要以包涵体形式存在,灰度扫描分析显示融合蛋白表达量占菌体蛋白总量的90%,Western blot结果证实该NY-ESO-1/GST可与抗GST单克隆抗体(mAb)发生特异性结合反应,提示为融合蛋白。结论:成功构建了NY-ESO-1基因原核表达载体pGEX-4T1-NY-ESO-1,利用大肠杆菌表达系统,获得了较高纯度的包涵体形式NY-ESO-1/GST融合蛋白。 展开更多
关键词 NY.ESO-1 gst 融合蛋白 原核表达 纯化
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GST-CML28融合蛋白的表达和纯化及多克隆抗体制备
13
作者 毛霞 张冰 +2 位作者 白雪玲 刘龙龙 张东华 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期1302-1306,共5页
本研究探讨GST-CML28融合蛋白的表达及抗体制备。CML28-pGEX-3X重组质粒转化BL21大肠杆菌,提取细菌蛋白后用GSTrap FF纯化柱进行纯化。将纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备CML28抗血清;免疫血清用CNBr-activated Sepharose 4B层析柱进行纯... 本研究探讨GST-CML28融合蛋白的表达及抗体制备。CML28-pGEX-3X重组质粒转化BL21大肠杆菌,提取细菌蛋白后用GSTrap FF纯化柱进行纯化。将纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备CML28抗血清;免疫血清用CNBr-activated Sepharose 4B层析柱进行纯化,获得多克隆抗体。结果表明,获得的抗体能够满足针对CML28的ELISA、Western blot、免疫组织化学和量子点荧光检测的实验要求。结论:成功制备了高特异性,高效价的抗人CML28多克隆抗体,为今后深入研究其生物学功能提供了有用的实验工具。 展开更多
关键词 CML28 gst-CML28融合蛋白 多克隆抗体
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肿瘤相关抗原RCAS1重组质粒的构建与GST-RCAS1融合蛋白的表达和纯化及鉴定
14
作者 洪学军 沈芬平 王青青 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2006年第4期377-383,共7页
目的:构建RCA S1的重组质粒、表达GST-RCA S1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定。方法:从M CF-7细胞提取总RNA,通过RT-PCR得到RCA S1的扩增产物,纯化后用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体,用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上... 目的:构建RCA S1的重组质粒、表达GST-RCA S1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定。方法:从M CF-7细胞提取总RNA,通过RT-PCR得到RCA S1的扩增产物,纯化后用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体,用E coRⅠ和BamHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接,转化感受态JM 109大肠杆菌,挑单个菌落提取质粒进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒重新转化BL 21大肠杆菌,用终浓度0.1 mm o l/L的IPTG诱导表达GST-RCA S1蛋白,用GST亲和层析纯化并通过SDS-PAGE电泳和W estern印迹试验证实。利用特异性抗RCA S1多抗(N-18和C-20)鉴定所表达的融合蛋白,通过流式细胞仪检测GST-RCA S1融合蛋白诱导活化T细胞凋亡的作用。结果:通过RT-PCR得到大小为642bp的产物,重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确。通过IPTG诱导在BL 21大肠杆菌中表达并纯化得到GST-RCA S1蛋白,通过SDS-PAGE电泳鉴定分子量为52 kM r,与预测一致,并由W estern印迹试验证明为GST融合蛋白。该融合蛋白能被特异性抗RCA S1(N-18和C-20)多抗识别。GST-RCA S1对诱导活化的T细胞凋亡有一定的作用。结论:成功构建RCA S1的重组质粒,并表达GST-RCA S1融合蛋白,对其生物学活性作了初步研究。 展开更多
关键词 抗原 肿瘤 RCAS1 重组质粒 gst—RCAS1融合蛋白 细胞凋亡
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类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达
15
作者 杨南扬 缪璇 +3 位作者 伍贤军 刘金美 辻一郎 李晓萌 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1010-1014,共5页
目的:构建pGEX-4T-1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白。方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白... 目的:构建pGEX-4T-1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白。方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒转化E.coli BL21,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-SUMO3的融合蛋白,并纯化获得相对分子质量为38 000的融合蛋白。结果:通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,确定了重组质粒pGEX-4T-1/SUMO3中包含有312bp的小片段,并测序鉴定该插入片段序列与SUMO3序列一致;在终浓度为0.1mmol·L-1的IPTG诱导时,GST-SUMO3的融合蛋白也被成功地表达和纯化。结论:成功地制备和纯化了类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白,为SUMO3多克隆抗体的制备提供了抗原基础,同时也为SUMO3及SUMO第二类家族功能的深入研究提供了保证。 展开更多
关键词 类泛素化蛋白3 gst融合蛋白 蛋白纯化
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人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定 被引量：24
16
作者 陈小文 刘新光 +1 位作者 梁景耀 梁念慈 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期176-182,共7页
通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符... 通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 . 展开更多
关键词 人蛋白激酶CK2α'亚基 大肠杆菌 克隆 表达 纯化 重组蛋白 鉴定
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枯草杆菌DC-2纳豆激酶基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达 被引量：21
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作者 彭勇 黄庆 张义正 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期559-563,共5页
纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ... 纳豆激酶是一种纤维蛋白溶解酶 ,有望开发成为新型的溶栓药物 .从中国豆豉中分离的具有较强纤溶活性的枯草杆菌DC 2中提取总DNA ,根据纳豆激酶 (NK)基因序列设计引物 ,用PCR法扩增NK基因 .序列分析表明 ,NK基因成熟肽编码区含有 82 5bp ,编码 2 75个氨基酸残基 ,与文献报道的序列分别有 93 4 %和 94 5 %同源性 .将NK基因插入载体pGEX 4T1构建表达质粒pGEX NK ,转化大肠杆菌JM10 9后 ,经 1mmol LIPTG诱导 4h ,发现大量NK融合蛋白表达 ,并形成包涵体 .SDS PAGE分析表明 ,NK融合蛋白作为包涵体的分子量为 5 3kD .凝胶自动扫描结果显示 ,NK融合蛋白约占菌体可溶性蛋白的 2 6 % . 展开更多
关键词 枯草杆菌DC-2 纳豆激酶基因 融合蛋白 基因克隆 基因表达 大肠杆菌
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旋毛虫p49抗原相关抗体的快速检测 被引量：11
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作者 宋思扬 蔡海松 +4 位作者 张伟光 林新坚 郑忠辉 黄耀坚 苏文金 《中国人兽共患病杂志》 CSCD 北大核心 2000年第1期26-28,共3页
目的　建立旋毛虫病的快速检测技术。方法　基因工程抗原包被有色乳胶颗粒，抗抗体包被磁性颗粒，在抗体存在下形成抗原－ 乳胶－ 抗体－ 抗抗体－ 磁性颗粒的复合场，在磁场作用下沉淀下来，从而达到快速检测旋毛虫相关抗体的目的。结... 目的　建立旋毛虫病的快速检测技术。方法　基因工程抗原包被有色乳胶颗粒，抗抗体包被磁性颗粒，在抗体存在下形成抗原－ 乳胶－ 抗体－ 抗抗体－ 磁性颗粒的复合场，在磁场作用下沉淀下来，从而达到快速检测旋毛虫相关抗体的目的。结果　１９ 份人工感染鼠血清、５ 份人工感染猪血清、３ 份旋毛虫病猪血清、４ 份病人血清均呈阳性反应，而对照血清均为阴性反应；该方法在鼠感染旋毛虫后第五天可测出ＩｇＭ 抗体，第九天可测出ＩｇＧ抗体。结论　本检测技术简便易行，不需专用设备，可望成为一种快速诊断旋毛虫病的有效方法。 展开更多
关键词 旋毛虫 融合蛋白 乳胶-磁性 p49抗原
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LRRC4融合蛋白的构建与表达研究 被引量：2
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作者 王洁如 董利 +7 位作者 蒋明 谭琛 李小玲 向娟娟 范松青 彭聪 唐珂 李桂源 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第5期696-701,共6页
在前期工作中 ,采用EST介导的定位候选克隆策略 ,克隆了一个在脑瘤中表达下调的脑特异表达新基因LRRC4 ,为进一步研究其结构与功能的关系 ,构建了含LRRC4基因全长编码区的 pGEM TEasy质粒 ,在此基础上通过亚克隆构建了LRRC4融合蛋白的... 在前期工作中 ,采用EST介导的定位候选克隆策略 ,克隆了一个在脑瘤中表达下调的脑特异表达新基因LRRC4 ,为进一步研究其结构与功能的关系 ,构建了含LRRC4基因全长编码区的 pGEM TEasy质粒 ,在此基础上通过亚克隆构建了LRRC4融合蛋白的绿色荧光蛋白 (pEGFP C1)表达质粒 ,瞬时转染哺乳动物细胞 ,结果发现表达的LRRC4融合蛋白定位于活细胞的细胞膜上 .同时 ,构建了LRRC4全长和截短型原核表达 pGEX 4T 2质粒 ,成功而高效地在大肠杆菌BL2 1中表达LRRC4融合蛋白 .上述工作为制备多抗 。 展开更多
关键词 LRRC4 融合蛋白 构建 表达 EGFP gst 生物信息学
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体外重组CaV1.2不同蛋白片段纯化及其与CaM相互作用的研究 被引量：4
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作者 何桂林 邵冬雪 +4 位作者 印丹丹 胡慧媛 郭凤 王红梅 郝丽英 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期773-776,共4页
目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋... 目的纯化CaV1.2不同蛋白片段并研究其与CaM的相互作用。方法质粒转化、筛选得到转化成功BL21菌株,利用IPTG诱导GST钙通道融合蛋白表达,Glutathione-Sepharose 4B beads纯化钙通道不同蛋白片段;采用GST pull-down assay实验研究钙通道蛋白不同片段与CaM以及突变体的相互作用。结果 SDS-PAGE结果显示成功纯化获得钙通道不同蛋白片段;GST pull-down assay结果显示CT1可与CaM及突变体结合,且GST-CT1与野生型CaM结合量显著多于与突变体CaM结合量。结论成功纯化CaV1.2钙通道蛋白片段并顺利完成GST pull-down assay实验,为深入研究蛋白相互作用或发现新的蛋白相互作用奠定了基础。 展开更多
关键词 gstpull-downassay CaV1.2 CAM 融合蛋白
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