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山地乌骨鸡IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ真核表达载体构建及其对IBV DNA疫苗免疫增强作用研究 被引量：1
1
作者 胡慧琼 王红宁 +4 位作者 周生 李晓英 黄勇 柳萍 徐永莉 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期1056-1062,共7页
利用RT-PCR法从刺激的山地乌骨鸡的外周淋巴细胞及脾脏组织总RNA中扩增出与鸡IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ基因预期大小的DNA片段,并与pcDNA3.1连接构建了真核表达质粒pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18及pDNAIFN-γ.研制了4种分子免疫佐剂,... 利用RT-PCR法从刺激的山地乌骨鸡的外周淋巴细胞及脾脏组织总RNA中扩增出与鸡IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ基因预期大小的DNA片段,并与pcDNA3.1连接构建了真核表达质粒pDNAIL2、pDNAIL15、pDNAIL18及pDNAIFN-γ.研制了4种分子免疫佐剂,对通过检测血清总IgG值、CD4＋、CD8＋百分含量,研究了４种分子免疫佐剂对禽传染性支气管炎DNA疫苗的免疫增强作用.并对pDNAIL2在鸡胚成纤维细胞中的表达进行了研究.研究发现,所有分子佐剂和DNA疫苗联合接种试验组鸡血清总IgG值、CD4＋T及CD8＋T淋巴细胞含量从5天后就一直高于DNA疫苗单独注射组,并在15天和21天时出现差异显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）.结果表明,IL-2、IL-15、IL-18及IFN-γ对IBV DNA疫苗有免疫增强作用,且pDNAIL2在体外得到了表达. 展开更多
关键词 山地乌骨鸡 白细胞介素2 白细胞介素15 白细胞介素18 γ-干扰素 真核表达载体 dna疫苗
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T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因及蛋白表达 被引量：1
2
作者 张明智 李继昌 +2 位作者 姜祖光 陈长英 乐晓萍 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2002年第3期280-283,共4页
目的:检测T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗的基因表达。方法:大剂量提取质粒,将BALB/c鼠随机分为 pcDNA3．l组、pcDNA3．1/TCR Vβ8组、pcDNA3．1/TCR Vβ8＋IL－2组、pcDNA3．l/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧... 目的:检测T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗的基因表达。方法:大剂量提取质粒,将BALB/c鼠随机分为 pcDNA3．l组、pcDNA3．1/TCR Vβ8组、pcDNA3．1/TCR Vβ8＋IL－2组、pcDNA3．l/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧股四头肌内注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次。接种疫苗后 5 d,用 RT-PCR法检测重组质粒mRNA表达。接种疫苗后 7 d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达。结果:pcDNA3．1/TCR Vβ8组、pcDNA3．l/TCR Vβ8＋IL－2组、pcDNA3．l/TCR Vβ8+CpG＋脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达,而pcDNA3．1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达。结论:T淋巴瘤TCRβ链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物。 展开更多
关键词 T淋巴瘤 TCR 独特型 重组质粒 dna疫苗 基因表达 动物实验
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用于构建双价禽流感DNA疫苗的双目的基因表达质粒的构建及鉴定 被引量：3
3
作者 黄冬 陈普成 +4 位作者 刘兵 唐猛 柳金雄 姜永萍 陈化兰 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期257-261,共5页
为探索构建禽流感双价或多价DNA疫苗的可行性,本研究以本实验室前期研制的禽流感DNA疫苗p CAGGopti HA5为基础[其中含有禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang Dong/1/96(H5N1)的HA基因],将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因作为第二个目的基因... 为探索构建禽流感双价或多价DNA疫苗的可行性,本研究以本实验室前期研制的禽流感DNA疫苗p CAGGopti HA5为基础[其中含有禽流感病毒(AIV)A/Goose/Guang Dong/1/96(H5N1)的HA基因],将增强型绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因作为第二个目的基因,利用双启动子启动、内部核糖体进入位点(IRES)介导以及通过蛋白Linker编码序列连接融合表达两个目的基因的形式,构建了双启动子重组表达质粒pH5-eGFP、IRES介导的重组表达质粒pHIE以及融合表达重组质粒pH6E。并采用脂质体介导将这3种重组质粒分别转染293T细胞,通过间接免疫荧光试验和western blot方法检测HA和eGFP这两种目的蛋白的瞬时表达情况。结果显示,这3种重组质粒均能够正确表达AIV的HA蛋白和eGFP。其中pH5-eGFP表达出两个独立的目的蛋白,而且互相不影响各自的表达和细胞定位;pH6E则以融合形式表达两种目的蛋白,由于HA蛋白具有膜定位信号,所以融合蛋白主要定位于细胞膜上。本研究结果表明,双启动子表达质粒和双目的蛋白融合表达质粒适合用于构建AIV以及其他相关病原的双价DNA疫苗。 展开更多
关键词 dna疫苗 双价表达质粒 EGFP
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鸡球虫病7价多表位嵌合重组抗原ET seven真核质粒的构建、表达及其初步功能分析
4
作者 倪君丽 刘欣超 +7 位作者 孙栋 方肆云 王定爱 申翰钦 严专强 戚南山 孙铭飞 顾有方 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5159-5172,共14页
为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其... 为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其免疫功能。本研究利用生信分析获得7个抗原表位,分别提取柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体总RNA,通过RT-PCR扩增获得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7个抗原的表位区域编码基因,构建基因图谱由公司合成以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven;将鉴定阳性、测序正确的质粒pcDNA3.1-ET seven转染至DF-1细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测ET seven重组基因片段在DF-1细胞中的表达;以磷酸钙纳米颗粒作为辅助质粒递送佐剂检测pcDNA3.1-ET seven在鸡体内引起的细胞因子水平变化,间接ELISA检测特异性IgG抗体水平。结果显示:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven,RT-PCR和Western blot检测到ET seven的特异性表达,质粒通过磷酸钙纳米佐剂免疫鸡体后,检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表达,其中CD-40与IL-6的表达水平最高。pcDNA3.1-ET seven重组质粒结合磷酸钙佐剂肌肉注射二次免疫后7 d间接ELISA检测特异性IgG抗体呈阳性。结果表明,pcDNA3.1-ET seven重组质粒构建成功,在鸡体内有良好的免疫原性,为鸡球虫病的疫苗防控提供新的思路和技术支撑。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 多表位重组质粒 真核表达 dna疫苗
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禽流感病毒H5HA、H7HA基因共表达核酸疫苗质粒的构建及其在体外的表达 被引量：5
5
作者 张芳芳 刘光亮 +2 位作者 姜永萍 陈化兰 陈怀涛 《动物医学进展》 CSCD 2004年第4期107-110,共4页
为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入... 为了获得既能对 H5亚型又能对 H7亚型 AIV攻击产生保护的核酸疫苗 ,设计构建了含有双顺反子的真核表达载体 ,用限制性内切酶从 PCIH7HA载体上切得 AIV H7HA基因的c DNA,此 c DNA含有 CMV启动子和 Poly(A)终止序列 ,使用 DNA 连接酶引入载体PCIH5HA中 ,最后获得双顺反子真核表达载体PCI-H5HA-H7HA,其中 H5HA和 H7HA基因都带有自己的 CMV启动子和 Poly(A)终止序列。选用 2 93 -T真核表达细胞系 ,用脂质体转染法导入细胞进行瞬时表达 ,转染后 48h用荧光标记的兔抗鸡 Ig G进行间接免疫荧光试验。结果表明双顺反子真核表达载体构建正确 ,且在真核表达细胞系中 H5HA和 H7HA基因都能获得表达 ,且 H5HA 基因的表达效果优于H7HA。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H5HA基因 H7HA基因 基因表达 核酸疫苗 质粒 间接免疫荧光
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癌胚抗原与IL-2真核双表达质粒的构建及体外表达 被引量：4
6
作者 王中川 傅传刚 +2 位作者 王庆敏 车文良 戴建新 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 2002年第3期193-196,共4页
目的 :构建癌胚抗原 (CEA)与白细胞介素 2 (IL 2 )的真核双表达质粒 ,并检测其在体外的表达。方法 :利用分子生物学技术 ,将CEA基因片段和IL 2基因片段连接于真核双表达质粒 pIRES中 ,测定序列后 ,用脂质体包裹转染细胞 ,采用ELISA双抗... 目的 :构建癌胚抗原 (CEA)与白细胞介素 2 (IL 2 )的真核双表达质粒 ,并检测其在体外的表达。方法 :利用分子生物学技术 ,将CEA基因片段和IL 2基因片段连接于真核双表达质粒 pIRES中 ,测定序列后 ,用脂质体包裹转染细胞 ,采用ELISA双抗体夹心法检测CEA和IL 2的表达。结果 :核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确 ,质粒上所接入的CEA和IL 2的碱基序列与标准序列的同源性分别为 99.8%和 99.9%。该双表达质粒在体外转染细胞内后可表达CEA和IL 2分子。结论 :实验所构建的 pIRES CEA IL 2双表达质粒能在体外同时表达CEA和IL 2分子 ,说明本质粒具有在细胞水平同时表达两种生物大分子的活性 。 展开更多
关键词 dna疫苗 癌胚抗原 共表达质粒 白细胞介素2 CEA IL-2
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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达基因疫苗的免疫对断奶仔猪某些代谢物浓度的影响 被引量：4
7
作者 舒邓群 陈荣达 +2 位作者 茆达干 吴志敏 杨利国 《江西农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期693-696,共4页
选择40头断奶的长×大二元杂交仔猪，随机分为4组，每组10头，公母各半。其中1组为对照组。2～4组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的基因疫苗pcS／2SS、pGM—CSF／SS和pCM—CSF＋pcS／2SS。研究这些基因疫苗对断奶仔猪血浆代谢物浓度... 选择40头断奶的长×大二元杂交仔猪，随机分为4组，每组10头，公母各半。其中1组为对照组。2～4组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的基因疫苗pcS／2SS、pGM—CSF／SS和pCM—CSF＋pcS／2SS。研究这些基因疫苗对断奶仔猪血浆代谢物浓度的影响。结果显示。对照组和pcS／2SS基因疫苗免疫组仔猪血浆葡萄糖浓度没有明显变化，pGM—CSF＋pcS／2SS免疫组呈现下降的趋势。融合表达质粒pGM—CSF／SS的免疫则可提高血浆葡萄糖的浓度；血浆游离脂肪酸的分泌水平各免疫组间无明显差异；血浆尿素氮的浓度pGM—CSF／SS免疫组有上升的趋势。在第2周、4周和6周血浆尿素氮的浓度高于其它3个组（P〉0．05）。pcS／2SS免疫组则随免疫时间的延长而逐渐下降。对照组和pGM—CSF＋pcS／2SS免疫组一直保持比较平稳的态势。结果表明。GM—CSF提高了SS基因疫苗的免疫效果。pGM—CSF／SS要优于pGM—CSF＋pcS／2SS共同免疫。 展开更多
关键词 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 生长抑素 融合表达质粒dna疫苗 代谢物
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猪IL-2真核表达质粒对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗诱导小鼠细胞免疫增强作用的研究 被引量：7
8
作者 陈希文 程安春 +6 位作者 汪铭书 希尼尼根 豆文波 张平英 李雪梅 王刚 刘伍梅 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期60-63,共4页
目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小... 目的 :研究猪白细胞介素 2真核表达质粒 (pcDNA IL 2 )对猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )诱导BALB/c小鼠产生细胞免疫应答的影响。方法 :用pcDNA IL 2与PRRSVORF5基因疫苗 (pcDNA PRRSV ORF5 )共同免疫BALB/c小鼠 ,以空载质粒pcDNA为阴性对照 ,PBS为空白对照 ;采用流式细胞仪 (FACS)、淋巴细胞增殖试验(MTT法 )分别对小鼠外周血中CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数和淋巴细胞的转化功能进行了检测。结果 :pcDNA IL 2与pcDNA PRRSV ORF5共同免疫小鼠后外周血对ConA有明显的反应性 ,CD4 + 、CD8+ T淋巴细胞数在免疫后 7天显著超过对照组 ,共同组与单独pcDNA PRRSV ORF5组有显著差异 (P <0 0 1)。结论 :pcDNA PRRSV ORF5免疫小鼠能够诱导其机体产生良好的细胞免疫应答 ,猪pcDNA IL 2能够显著增强pcDNA PRRSV ORF5诱导小鼠细胞免疫的能力。 展开更多
关键词 猪白细胞介素2真核表达质粒 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因疫苗 细胞免疫 小鼠
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丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及表达 被引量：6
9
作者 王全楚 冯志华 +1 位作者 周永兴 聂青和 《医学研究生学报》 CAS 2003年第3期161-163,F003,共4页
目的 :构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgGFc段的融合基因真核表达载体 pcDNA3HCVC Fc ,为下一步修饰和转染树突状细胞 ,制备能高效表达HCVC和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。　方法 :用分别含有XholⅠ和XbaⅠ双酶切位点的人免疫球... 目的 :构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgGFc段的融合基因真核表达载体 pcDNA3HCVC Fc ,为下一步修饰和转染树突状细胞 ,制备能高效表达HCVC和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。　方法 :用分别含有XholⅠ和XbaⅠ双酶切位点的人免疫球蛋白 (IgG)Fc区基因上、下游引物 ,以含有人IgG基因序列的质粒pCMVsFc为模板 ,通过PCR扩增获得Fc区基因片段 ,基因片段回收后 ,以XholⅠ和XbaⅠ双酶切 ,定向插入到含HCVC基因的质粒PcDNA3HCVC下游双粘端位点之间 ,获得重组表达质粒pcDNA3HCVFc。通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。以抗HCVC和抗Fc单克隆抗体为一抗 ,利用间接免疫荧光法检测 pcDNA3HCV Fc在人肝癌细胞 772 1中的瞬时表达。　结果 :酶切、PCR及测定鉴定证实 ,pcDNA3HCV Fc插入片段为Fc区基因片段 ,免疫荧光法检测表明其可以在 772 1细胞中瞬时表达。　结论 :构建的质粒 pcDNA3HCV Fc可以在772 1细胞中瞬时表达Fc基因 ,为研究HCVC Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础。 展开更多
关键词 丙型肝炎病毒 免疫球蛋白/Fc区 融合基因疫苗 真核表达
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鹅源副黏病毒HN基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究
10
作者 刘艳霞 卫广森 《现代畜牧兽医》 2005年第5期7-9,共3页
本试验通过PCR技术从pGEM-HN质粒中扩增出了HN基因,构建了真核表达质粒pcDNA3-HN。真核表达质粒pcDNA3-HN肌肉注射免疫鸡后,HI血清抗体效价较空白对照组高,攻毒后鸡发病、死亡均少于空白对照组,有27%￣36%的鸡耐过。但血清抗体效价较灭... 本试验通过PCR技术从pGEM-HN质粒中扩增出了HN基因,构建了真核表达质粒pcDNA3-HN。真核表达质粒pcDNA3-HN肌肉注射免疫鸡后,HI血清抗体效价较空白对照组高,攻毒后鸡发病、死亡均少于空白对照组,有27%￣36%的鸡耐过。但血清抗体效价较灭活苗组低,发病率和死亡率较灭活苗组高。试验结果表明HN基因在鸡体内得到了表达,并使鸡获得了一定的免疫力,但保护作用不及鹅副黏病毒油乳剂灭活苗。 展开更多
关键词 真核表达质粒 HN基因 基因疫苗 构建 血清抗体效价 油乳剂灭活苗 鹅副黏病毒 肌肉注射 试验结果 保护作用 R基因 免疫鸡 死亡率 发病率 免疫力 对照 空白 HI 攻毒
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