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CRISPR/Cas9技术:探索lncRNA的自身功能以及在癌症进程中的作用
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作者 李欣 胡莹 王玉明 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期364-375,共12页
CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物... CRISPR/Cas系统的出现极大推动了基因编辑领域的进步,特别是CRISPR/Cas9系统,已成为生物医学研究的核心工具。长非编码RNA(lncRNA)在基因调控、细胞分化和多种疾病的发展过程中发挥关键作用,尤其在癌症研究中,lncRNA作为癌症生物标志物和治疗靶点,具有重要的应用前景。然而,由于lncRNA普遍具有低丰度和保守性差等特点,限制了传统手段对其功能的研究。CRISPR/Cas9技术为lncRNA的研究提供了一个高效、灵活且精确的工具,显著加速了该领域的进展。本文首先回顾了CRISPR/Cas9系统的基本原理及其在基因编辑中的广泛应用,包括CRISPR敲除、敲入、干扰和激活等多种功能系统。这些技术不仅可以筛选特定生物过程中的关键lncRNA,还能够用于基因功能研究,探索其在疾病中的作用。本文重点分析了CRISPR/Cas9技术在研究lncRNA功能和调控机制,以及其在肿瘤研究中的关键应用。此外,文章还总结了通过CRISPR/Cas9进行全基因组筛选以识别功能性lncRNA的方法,并探讨了这些lncRNA在癌症细胞增殖、迁移、侵袭以及耐药性中的作用。CRISPR/Cas9敲除系统可以高效敲除lncRNA基因,揭示其在基因调控中的具体功能。同时,CRISPR激活和干扰技术为非编码基因的研究提供了新的思路,通过调控lncRNA的表达水平,进一步探索其在癌症等疾病中的临床应用。文章还探讨了CRISPR技术在未来lncRNA研究中的潜力,尤其是在解决基因组复杂性、靶向效率和脱靶效应等技术难题方面的进展。综上所述,CRISPR/Cas9技术不仅为研究lncRNA提供了强有力的工具,也为未来开发新的癌症诊断和治疗手段提供了新的思路和机会。 展开更多
关键词 成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9) 长非编码RNA 基因调控 癌症
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NOD-SIRPA基因原位敲入BALB/c转基因小鼠的构建及鉴定
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作者 陶明阳 李馨 +1 位作者 吕亚楠 胡正 《吉林大学学报(医学版)》 北大核心 2025年第3期557-566,共10页
目的:基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas) 9技术构建NOD-信号调节蛋白α (SIRPA)基因敲入的小鼠模型,为构建更先进的人源化小鼠模型提供参考。方法:基于CRISPR/Cas9技术,将NOD背景SIRPA基因敲入至BALB/c小... 目的:基于成簇的规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas) 9技术构建NOD-信号调节蛋白α (SIRPA)基因敲入的小鼠模型,为构建更先进的人源化小鼠模型提供参考。方法:基于CRISPR/Cas9技术,将NOD背景SIRPA基因敲入至BALB/c小鼠受精卵中,扩繁获得稳定基因型来源的纯合小鼠(SIRPA-KI鼠)进行实验,设计PCR引物,核酸电泳鉴定小鼠基因型。按照小鼠品系分为C57BL/6组、BALB/c组和SIRPA-KI组,各组随机取3只周龄相近小鼠进行实验。诱导成熟的骨髓巨噬细胞与人CD47-Fc融合蛋白共孵育,Streptavidin PE/Cy7染色,流式细胞术检测PE/Cy7平均荧光强度(MFI),比较各组小鼠SIRPA基因结合人CD47 Fc的能力。每只鼠尾静脉注射2×109羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的人红细胞,体内吞噬实验检测各组小鼠巨噬细胞体内吞噬人红细胞情况。随机取BALB/c和SIRPA-KI小鼠各1只诱导成熟骨髓巨噬细胞,体外吞噬实验检测各组小鼠巨噬细胞体内吞噬人红细胞情况。结果:成功获得BLAB/c SIRPANOD/NOD纯合小鼠。流式细胞术,与C57BL/6组比较,BALB/c组小鼠MFI明显升高(P<0.01);与C57BL/6组和BALB/c组比较,SIRPA-KI组小鼠MFI明显升高(P<0.01)。体内吞噬实验,C57BL/6组小鼠巨噬细胞整体清除人红细胞速率最快;巨噬细胞吞噬6 h时,与SIRPA-KI组比较,C57BL/6组人红细胞剩余百分率明显降低(P<0.01)且接近0%;与SIRPA-KI组比较,BALB/c组人红细胞剩余百分率明显降低(P<0.05)。体外吞噬实验,BALB/c组小鼠巨噬细胞明显吞噬人红细胞,且吞噬指数较高,为30.700%;与BALB/c组比较,SIRPA-KI组小鼠巨噬细胞吞噬指数明显降低(P<0.01)。结论:通过CRISPR/Cas9技术向BALB/c品系敲入NOD背景SIRPA基因,成功构建对人CD47亲和力增强和可明显抑制吞噬人红细胞且具有优越的人类细胞异种移植效率的小鼠模型。 展开更多
关键词 信号调节蛋白α BALB/c小鼠 C57BL/6小鼠 基于成簇的规则间隔短回文重复序列/基于成簇的规则间隔短回文重复序列相关蛋白9技术
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AKT三种亚型基因敲除对小鼠胚胎干细胞自我更新和分化的影响
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作者 杨淇 汤帅 +5 位作者 张林林 唐午阳 豆澳祥 张宇航 李丕顺 郑晓峰 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期426-436,共11页
AKT,又称为蛋白质激酶B(protein kinase B, PKB),在细胞增殖和代谢过程中发挥关键作用。AKT有3种亚型:AKT1、AKT2和AKT3,这3种亚型对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)多能性和分化的影响尚不明确。本研究旨在探讨AKT... AKT,又称为蛋白质激酶B(protein kinase B, PKB),在细胞增殖和代谢过程中发挥关键作用。AKT有3种亚型:AKT1、AKT2和AKT3,这3种亚型对小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)多能性和分化的影响尚不明确。本研究旨在探讨AKT亚型缺失对小鼠胚胎干细胞自我更新和分化的影响。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立AKT的3种亚型基因敲除的细胞系,通过蛋白质印迹(Western blot)、流式细胞术、qRT-PCR、CCK-8、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)染色和RNA-seq对其表型和分子变化进行分析。Akt的3种亚型基因敲除的细胞系构建成功,Akt1和Akt2的缺失会抑制小鼠胚胎干细胞的增殖,Akt任意一种亚型的缺失不会影响多能性基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达,但在拟胚体形成过程中,Akt的3种亚型的缺失均会影响3个胚层基因的mRNA水平表达。转录物组分析结果表明,与野生型mESCs相比,Akt1、Akt2和Akt3缺失后分别有995、547和429个差异表达基因(|log2FC|≧1,P<0.05),这3种亚型调控的差异表达基因存在部分重叠。综上,Akt的3种亚型的独立缺失不影响小鼠胚胎干细胞干性的维持,但是他们对于分化至关重要。Akt的3种亚型可以共同调控基因的表达,同时也保留了各自的调控特异性。本研究为理解Akt的3种亚型在干细胞生物学中的独特和重叠作用提供了基础,突显了它们在维持干细胞功能和分化中的重要性。 展开更多
关键词 小鼠胚胎干细胞 AKT亚型 多能性 CRISPR/Cas9 RNA测序
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基于CRISPR/Cas9技术创制高维生素C番茄材料
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作者 安煊森 王雁伟 +2 位作者 田文超 任亚娟 艾鹏飞 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第3期460-469,共10页
组成型光形态建成9信号复合体的5B亚基(subunit 5B of constitutively photomorphogenic 9 signalosome,CSN5B)是植物中L-半乳糖途径合成维生素C的抑制因子。为了获得高维生素C番茄突变体,本文构建双靶点载体pKSE402-SlCSN5B并对番茄育... 组成型光形态建成9信号复合体的5B亚基(subunit 5B of constitutively photomorphogenic 9 signalosome,CSN5B)是植物中L-半乳糖途径合成维生素C的抑制因子。为了获得高维生素C番茄突变体,本文构建双靶点载体pKSE402-SlCSN5B并对番茄育种亲本“1912”进行了遗传转化。通过分子生物学鉴定和DNA序列分析,17株转基因阳性植株中6株发生编辑,编辑效率为35.3%;其中csn5b-6和csn5b-8为纯合突变体,分别缺失了180 bp和3 bp。对这2种缺失纯合体T 1代中无外源T-DNA插入的株系分别进行生物学观测,在植株和果实的表型上无明显差异;在果实红熟期,对其进行生理指标测定,csn5b-6的T 1代株系在GMPase活力、维生素C和过氧化氢含量变化显著,分别比野生型提高43%、37.8%和降低25.9%,而可溶性固形物含量无明显差异;csn5b-8的T 1代株系与野生型一致。采用基因表达分析和蛋白质结构预测发现,csn5b-6-11中SlCSN5B基因表达量正常,但其编码的蛋白质由于较大的肽段丢失引起结构的改变,从而影响其功能,这可能是引起维生素C含量提高的原因。以上结果表明,利用CRISPR/Cas9技术编辑SlCSN5B基因可以提高番茄果实中维生素C的含量,为后续培育优质番茄新品种提供材料。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas9 番茄 SlCSN5B 维生素C
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定点整合β1,4半乳糖基转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶1和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ的CHO工程细胞株构建
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作者 李仙红 贾润清 +4 位作者 王友亮 漫未玲 朱天昊 阎新龙 林艳丽 《中国生物化学与分子生物学报》 北大核心 2025年第4期576-585,共10页
对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建... 对哺乳动物细胞CHO进行糖基化改造,用于生产蛋白质类药物。首先测定CHO细胞Rosa26位点的基因组序列,设计gRNA序列,利用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术,将着陆架整合到CHO细胞的Rosa26位点处。通过重叠PCR及无缝连接技术构建3个糖基转移酶共同表达的打靶载体,分别是β1,4半乳糖基转移酶(B4GALT1)、α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6GAL1)和N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ(GnTⅢ),并利用重组酶介导的盒式交换技术(recombinase-mediated cassette exchange,RMCE)将3个糖基转基因酶基因定点整合到CHO Rosa26位点中。PCR证实了3个糖基转移酶成功定点整合Rosa26位点,qRT-PCR证实3个糖基转移酶的mRNA表达水平均在50000倍以上,蛋白质免疫印迹法证实3个糖基转移酶的蛋白质表达水平均在4倍以上(P<0.001)。成功构建了Rosa26位点定点整合3个糖基转移酶的CHO工程细胞株。 展开更多
关键词 β-1 4半乳糖基转移酶 α-2 6-唾液酸转移酶1 N-乙酰氨基糖基转移酶Ⅲ 规律成簇的间隔短回文重复技术 重组酶介导的盒式交换技术 中国仓鼠卵巢细胞
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基于RAA-CRISPR/Cas12a技术的桃成分单管一体化快速检测方法
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作者 王琳 邢冉冉 +5 位作者 于耀鲜 易秋菊 卢思远 邓婷婷 王旭 陈颖 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第21期280-287,共8页
通过设计特异性的桃重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR RNA(crRNA)引物,建立RAA技术结合CRISPR/Cas12a系统的单管一体化桃成分快速检测方法,并分析该方法的特异性、灵敏度和检出限,同时对市售样品进... 通过设计特异性的桃重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided amplification,RAA)和CRISPR RNA(crRNA)引物,建立RAA技术结合CRISPR/Cas12a系统的单管一体化桃成分快速检测方法,并分析该方法的特异性、灵敏度和检出限,同时对市售样品进行检测。结果显示,该方法不依赖大型仪器设备,在30 min内即可完成桃成分的快速检测;与其他常见水果物种之间无交叉污染,表现出良好的特异性;该方法的灵敏度为1.0×10-1 ng/μL;检出限为1%;通过对20份市售样品检测,结果显示本方法与实时聚合酶链式反应法检测结果一致。因此,本研究建立的RAA-CRISPR/Cas12a单管一体化桃成分快速检测方法具有特异性好、灵敏度高的优点,为桃成分快速检测提供了一种新的技术。 展开更多
关键词 重组酶介导的等温扩增 CRISPR/Cas12a 单管一体化 桃成分 快速检测
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CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用 被引量:1
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作者 孔玉方 王慧煜 +2 位作者 袁向芬 许晓琳 吴绍强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期92-97,共6页
CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文... CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。 展开更多
关键词 簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a) 动物疫病 核酸检测 试纸条
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CRISPR/Cas系统中工程化gRNA技术的研究和应用 被引量:1
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作者 谈鎏 叶邦策 尹斌成 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期1078-1092,共15页
CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具。其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现... CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具。其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达。作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域。随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力。基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas系统 gRNA工程化 基因编辑 特异性
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基因编辑技术及其在糖生物学研究中的应用 被引量:1
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作者 章恩华 邱宏 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期433-452,共20页
基因功能的解析是现代生物学研究的基本问题,基因的精准、高效和靶向编辑是基因功能研究不可或缺的手段。在过去的30多年,基因编辑实现了从基于同源重组修复技术的基因打靶技术(gene targeting)到基于锌指核酸酶、转录激活样效应因子核... 基因功能的解析是现代生物学研究的基本问题,基因的精准、高效和靶向编辑是基因功能研究不可或缺的手段。在过去的30多年,基因编辑实现了从基于同源重组修复技术的基因打靶技术(gene targeting)到基于锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶和CRISPR相关核酸酶等可编程核酸酶的可控编辑技术的革命性转变。这些技术的发展极大地促进了基因功能的研究并促生了疾病治疗的颠覆性技术。本文综述了CRISPR-Cas的分类、组成及其在细菌中发挥免疫防御作用的工作原理,重点综述了基于CRISPR-Cas系统的最新基因编辑工具包括基因转录编辑器、表观遗传编辑器、碱基编辑器、先导编辑器以及靶向RNA的RCas编辑系统。随后综述了基因编辑器的细胞和器官靶向递送策略,主要讨论了腺相关病毒、脂质纳米颗粒和细胞外囊泡的优劣。最后,本文综述了基因编辑技术在糖生物学研究中的应用,包括糖类物质功能、生物合成与机制,糖蛋白质组学分析,细胞糖芯片的构建和应用以及蛋白质糖基化工程改造。精确基因编辑技术的发展促进了糖类物质的生物合成机制、结构与功能研究,也正在推进转化糖科学研究。 展开更多
关键词 基因编辑 糖生物学 细胞外囊泡 CRISPR-Cas系统
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The Applications of CRISPR Screening in Aging Research
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作者 XU Jia-Xin JING Yao-Bin +1 位作者 QU Jing LIU Guang-Hui 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期1186-1196,共11页
The advancement of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)gene editing technology has revolutionized the comprehension of human genome,propelling molecular and cellular biology research into ... The advancement of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats(CRISPR)gene editing technology has revolutionized the comprehension of human genome,propelling molecular and cellular biology research into unexplored realms and accelerating progress in life sciences and medicine.CRISPR-based gene screening,recognized for its efficiency and practicality,is widely utilized across diverse biological fields.Aging is a multifaceted process governed by a myriad of genetic and epigenetic factors.Unraveling the genes regulating aging holds promise for understanding this intricate phenomenon and devising strategies for its assessment and intervention.This review provides a comprehensive overview of the progress in CRISPR screening and its applications in aging research,while also offering insights into future directions.CRISPR-based genetic-manipulation tools are positioned as indispensable instruments for mitigating aging and managing age-related diseases. 展开更多
关键词 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR) genetic screening AGING
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反式切割CRISPR/Cas技术在食源致病微生物检测方面的原理及应用
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作者 戴永进 孙静 +3 位作者 张莫然 刘玉娟 陈洪周 陆颖健 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第22期351-360,共10页
食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁,传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来,随着成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术的逐步发展,具有反式切割活性的CRIS... 食源性致病微生物是食品安全的一大严重威胁,传统的生化检测手段面临着一系列挑战。近年来,随着成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)技术的逐步发展,具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系受到了越来越多的关注。本文综述了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的起源与分类,并详细介绍了具有反式切割活性的CRISPR/Cas体系的作用原理。同时,本文对反式切割CRISPR/Cas技术在食源性致病微生物领域的多方面应用进行了综述,并讨论了该技术的优劣和未来发展方向。 展开更多
关键词 CRISPR/Cas 反式切割 食源性致病菌 核酸检测
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嗜热链球菌中CRISPR序列的检测与同源性分析 被引量:9
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作者 邓凯波 霍贵成 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第3期153-157,共5页
为探明内蒙古的8株嗜热链球菌的CRISPR,用PCR方法扩增了其CRISPR序列,并采用生物信息学方法分析和预测了重复序列(direct repeat,DR)的同源性及二级结构。结果表明:除S4只含有一个CRISPR结构外,其余7株嗜热链球菌均检测出3条CRISPR序列... 为探明内蒙古的8株嗜热链球菌的CRISPR,用PCR方法扩增了其CRISPR序列,并采用生物信息学方法分析和预测了重复序列(direct repeat,DR)的同源性及二级结构。结果表明:除S4只含有一个CRISPR结构外,其余7株嗜热链球菌均检测出3条CRISPR序列,远高于CRISPR database公布细菌中具有该结构的比例(46.4%),且分别具特异性的重复序列(DR1~DR3);CRISPR最长达2853bp,最短仅101bp。对DR的二级结构预测发现,DR1~DR3均能形成回文结构,但茎环大小会有差异;在同源性比对中发现,除多数同属或同种外,供试DR还与个别远缘菌种具有高同源性,这种现象证明了供试菌株的CRISPR序列同样存在的水平基因转移,并可能存在其他的进化进程。 展开更多
关键词 嗜热链球菌 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)检测 同源性
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志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列的检测及同源性分析 被引量:4
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作者 王鹏飞 王颖芳 +5 位作者 段广才 王琳琳 郭向娇 薛泽润 郗园林 杨海燕 《吉林大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期261-268,I0003,共9页
目的:检测志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),并与GenBank全基因组中志贺菌重复序列和间隔序列对比,分析其结构特征及同源性。方法:利用PCR法扩增获得志贺菌CRISPR,采用生物信息学方法对重复序列及间隔序列进行同源性分析;运... 目的:检测志贺菌成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),并与GenBank全基因组中志贺菌重复序列和间隔序列对比,分析其结构特征及同源性。方法:利用PCR法扩增获得志贺菌CRISPR,采用生物信息学方法对重复序列及间隔序列进行同源性分析;运用多序列比对分析间隔序列特点及其与侧翼序列间的联系;BLAST分析间隔序列与质粒和噬菌体的同源性;weblogo分析重复序列碱基频率及RNAfold预测其RNA二级结构;重复序列的同源聚类分析并用BLAST分析重复序列与其他细菌的同源性。结果:被测3株临床志贺菌及9株全基因组志贺菌中均含有不同数量CRISPR;同一个CRISPR中,间隔序列有的相似、有的完全不同,某些CRISPR间隔序列的部分序列与CRISPR侧翼序列存在同源性,某些间隔序列可能是信息基因和操纵基因的拼接重组;重复序列保守性不一致,可能与细菌进化存在一定的联系,重复序列碱基的差异影响茎的长度,从而影响二级结构的稳定性及CRISPR的功能。重复序列与个别远缘菌种具有较高的同源性。结论:志贺菌存在多样的CRISPR结构,不同CRISPR的重复序列保守性不同。某些间隔序列部分与CRISPR侧翼序列同源,某些间隔序列是多基因拼接而成。 展开更多
关键词 志贺菌 成簇的规律间隔短回文重复序列 重复序列 间隔序列 同源性
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基于CRISPR对大肠埃希菌O157∶H7的检测 被引量:5
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作者 梁文娟 张荣光 +6 位作者 段广才 王颖芳 洪丽娟 张冰 王鹏飞 郗园林 杨海燕 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期748-753,共6页
目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRI... 目的基于成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR),建立对大肠埃希菌O157∶H7的新型检测方法。方法应用PCR扩增实验室保存的443株肠道细菌(310株非O157∶H7大肠埃希菌、35株大肠埃希菌O157∶H7、89株志贺菌和9株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2,并将PCR产物测序;提取CRISPR database数据库中(标准法)100株肠道细菌(47株非O157∶H7大肠埃希菌、5株大肠埃希菌O157∶H7、9株志贺菌和39株沙门菌)的CRISPR1和CRISPR2序列。使用CRISPR Finder在线软件分析PCR产物测序序列和CRISPR database数据库的CRISPR序列。Clustal X软件进行间隔序列比对。比较标准法和PCR扩增CRISPR两种方法检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性。结果共分析543株肠道细菌,其中75.6%的非O157∶H7大肠埃希菌、75.5%志贺菌、91.7%沙门菌和95%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR1,其间隔序列数目为3~26、2~9、2~32、3。57.1%的非O157∶H7大肠埃希菌、77.6%志贺菌、85.4%沙门菌和100%O157∶H7大肠埃希菌含有CRISPR2,其间隔序列数目为1~20、1~6、2~27、1或4个。95%的O157∶H7大肠埃希菌的CRISPR1和90%CRISPR2分别含有3条独特间隔序列(S1-1,S1-2,S1-3)和1条独特间隔序列(S2-1)。间隔序列比对结果显示,S1-1+S1-2+S1-3和S2-1检测O157∶H7大肠埃希菌的特异性分别是100%和99.6%。标准法检测和PCR扩增CRISPR1和CRISPR2检测大肠埃希菌O157∶H7的一致性分别达99.6%和99.3%。基于CRISPR检测大肠埃希菌O157∶H7在模拟样品中的应用,结果显示在原样品大肠埃希菌O157∶H7浓度约2.3CFU/mL时,经12h增菌后即能检测出来。大肠埃希菌O157∶H7聚类分析显示,40株O157∶H7大肠埃希菌可分为3类。结论基于CRISPR的大肠埃希菌O157∶H7的检测方法,可以作为监测大肠埃希菌O157∶H7感染和高毒株大肠埃希菌O157∶H7有价值的流行病学工具。 展开更多
关键词 大肠埃希菌O157∶H7 成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR) 聚合酶链反应 检测
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志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列与毒力基因和耐药基因的关系 被引量:3
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作者 王颖芳 王鹏飞 +3 位作者 詹煜慧 张晓萌 段广才 郗园林 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期71-75,共5页
目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比... 目的探索志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)与毒力基因和耐药基因的关系。方法从GenBank数据库中获得志贺菌的基因组、毒力基因和耐药基因的序列,通过多序列比对等方法获得志贺菌中CRISPR1、CRISPR2和CRISPR-Q1的分布情况、重复序列和间隔序列信息,通过BLAST方法获得毒力基因和耐药基因在志贺菌中的分布情况,SPSS 21.0软件分析CRISPR与毒力基因和耐药基因的关系。结果志贺菌中的CRISPR1和CRISPR2在不同菌株中的间隔序列差别较大,CRISPRQ1分布更为广泛(超过99%)。毒力基因在志贺菌中分布比较广泛(均超过56%),耐药基因中的blaOXA-1、camr、Sul2、tetB分布也比较广(超过50%)。CRISPR1/CRISPR2与是否携带9种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05),CRISPR-Q1与是否携带3种毒力基因、4种耐药基因有关(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2和CRISPR-Q1均与志贺菌中存在的毒力基因和耐药基因的个数间有统计学关联(P<0.05)。CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目之间存在统计学关联(χ2=61.6,P<0.001)。结论志贺菌中不同CRISPR的分布差异比较大,存在的间隔序列数目不等;志贺菌CRISPR与部分毒力基因和耐药基因之间存在负相关;CRISPR1/CRISPR2与CRISPR-Q1的间隔序列数目存在正相关。 展开更多
关键词 志贺菌 成簇的规律间隔短回文重复序列 毒力基因 耐药基因
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乳酸菌CRISPR-Cas系统研究进展 被引量:4
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作者 李婉 边鑫 +2 位作者 王娜娜 李柏良 霍贵成 《中国乳品工业》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期22-25,35,共5页
对乳酸菌CRISPR-Cas系统(即:成簇的、规律间隔的短回文重复序列及相关Cas蛋白系统)抗噬菌体机制以及噬菌体进化出的相应免疫逃逸机制进行综述,旨为进一步研究噬菌体抗性乳酸菌发酵剂奠定基础。
关键词 乳酸菌 CRISPR-Cas系统 噬菌体
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空肠弯曲菌中规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)的检测与结构分析 被引量:2
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作者 吴瑜凡 申进玲 +4 位作者 崔思宇 郭旸 吴福平 王翔 邵景东 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2018年第24期139-144,共6页
规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传... 规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是近年在原核生物中发现的针对噬菌体等外源遗传物质的干扰而进化出的获得性和可遗传性生物免疫系统。因其序列的高度多态性及携带遗传信息的可追溯性,成为分子分型方法的理想位点。本研究对江苏地区分离的86株空肠弯曲菌基因组进行CRISPR结构的检测和分析。结果表明:36%的菌株基因组含有CRISPR结构,32株含有确定CRISPR结构的菌株均只含有1个CRISPR结构,CRISPR序列长度范围为92~366 bp;重复序列与数据库中出现频率最高的重复序列一致;识别到的间隔序列共111条,共分为17种类型,有10种类型的间隔序列与CRISPR DB数据库中公布的一致,有7种间隔序列为新报道的间隔序列,共55条,占总间隔序列的49.5%。通过同源性比对发现,间隔序列除与来自同属同种的质粒或噬菌体具有同源性外,有些还与其他致病菌的质粒或噬菌体具有同源性,这种现象说明空肠弯曲菌与其他致病菌可能存在基因的水平转移等信息交流方式。另外,通过CRISPR结构间隔序列的多样性,可以将38株空肠弯曲菌野生菌株分为5种不同的谱型。研究结果为空肠弯曲菌利用CRISPR结构进行分型和溯源提供数据基础。 展开更多
关键词 空肠弯曲菌 成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR) 重复序列 间隔序列 同源性
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常见食源性致病菌CRISPR系统结构与功能研究进展 被引量:2
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作者 刘伟奇 王旭 +2 位作者 刘海泉 潘迎捷 赵勇 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2017年第1期276-281,共6页
近年发现细菌和古细菌中广泛存在规律成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统,该系统能够有效地防御噬菌体等外源基因元件的入侵,限制基因的水平转移。而在食源性致病菌中CRI... 近年发现细菌和古细菌中广泛存在规律成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统,该系统能够有效地防御噬菌体等外源基因元件的入侵,限制基因的水平转移。而在食源性致病菌中CRISPR系统除了免疫防御功能以外,还可能具有调节细菌毒力等的其他功能。并且食源性致病菌的CRISPR系统呈现出的多样性在不同菌株之间存在差异,这种差异为食源性致病菌的遗传进化、分子分型提供了更为可靠的依据。因此,近年来针对食源性致病菌中CRISPR系统结构与功能的研究逐渐成为热点。为了进一步探究CRISPR系统在食源性致病菌中的作用机制与应用前景,本文综述了几种常见的食源性致病菌CRISPR系统的基本结构及相关功能的研究进展。 展开更多
关键词 食源性致病菌 规律成簇间隔的短回文重复序列 结构 功能
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CRISPR/Cas9系统在疾病模型和基因治疗中的应用 被引量:4
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作者 沈阳坤 郑志泉 蔡少丽 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期786-794,共9页
基因编辑技术的出现成功地改变了实验材料的基因序列,这为研究疾病的分子机理提供了极大的便利.然而,传统的基因编辑技术由于缺乏精确定位、随机性插入引起位置效应等原因而制约了其发展.随着规律成簇间隔短回文重复CRISPR(clustered re... 基因编辑技术的出现成功地改变了实验材料的基因序列,这为研究疾病的分子机理提供了极大的便利.然而,传统的基因编辑技术由于缺乏精确定位、随机性插入引起位置效应等原因而制约了其发展.随着规律成簇间隔短回文重复CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeat)/CRISPR相关核酸酶Cas(CRISPR-associated nuclease)系统的出现,简便高效的基因编辑技术在疾病模型的构建,损伤基因的修复和功能性基因的研究中已得到广泛应用,产生了十分重要的影响.本文就CRISPR/Cas9系统的结构特点、作用机理以及近两年来在疾病模型构建和基因治疗中的应用进行综述,以便读者了解相关领域的研究进展. 展开更多
关键词 基因编辑 成簇间隔短回文重复/CRISPR相关核酸酶系统 结构 疾病模型 基因治疗
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利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体 被引量:2
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作者 李莉梅 张婷婷 +5 位作者 欧阳乐军 陈自银 陈凯钊 刘雅丽 尹爱国 布良灏 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第3期411-417,共7页
【目的】利用高效基因编辑系统(p HDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。【方法】设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增p CBC质粒上... 【目的】利用高效基因编辑系统(p HDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础。【方法】设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增p CBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切p HDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞。提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体。【结果】重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致。成功构建了巨桉CTX基因家族p HDE-CTXA、p HDE-CTXB和p HDE-CTXC同源表达载体。【结论】利用p HDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴。 展开更多
关键词 巨桉 规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR) 细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX) 载体构建
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