PTD-mFoxp3融合蛋白对异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响 被引量：1

1

作者 徐三荣 李伟 +1 位作者 周庆 韩博 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期1541-1545,共5页

本研究探讨静脉输注PTD-mFoxp3融合蛋白对同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。10周龄C57BL/6小鼠为受体并随机分为A、B、C 3组,每组10只,移植当天(第0天)接受直线加速器X射线6.0 Gy全身照射,4-6 h内输注供体BALB/c鼠全骨髓细胞3... 本研究探讨静脉输注PTD-mFoxp3融合蛋白对同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的影响。10周龄C57BL/6小鼠为受体并随机分为A、B、C 3组,每组10只,移植当天(第0天)接受直线加速器X射线6.0 Gy全身照射,4-6 h内输注供体BALB/c鼠全骨髓细胞3×107+脾细胞1.5×107个。A组于移植前2 d和移植后0、1、3、5、7、9、11、13 d间断多次输入生理盐水,B组输入mFoxp3蛋白,C组输注等量PTD-mFoxp3融合蛋白。移植后每天观察受体有无移植物抗宿主病的表现;取受体肝脏、空肠上端组织做病理学检查,判断组织损伤及淋巴细胞浸润程度;用ELISA法检测受体外周血中炎性因子IL-2及INF-γ浓度;流式细胞术测定长期存活受体外周血供体细胞的比例。结果表明,照射后60 d内A、B和C组受体平均生存期分别为(32.95±5.48)d、(38.00±5.45)d和(55.30±3.15)d;病理组织学观察示,A组和B组的小肠及肝脏发生明显的损伤,符合GVHD的表现,C组的病理损伤较轻;酶联免疫吸附测定表明,C组IL-2及IFN-γ浓度明显低于A和B组;长期存活的受体形成了稳定的嵌合体状态,移植后60 d A、B、C组活存动物供体细胞比例分别为(79.46±1.80)%、(79.13±2.23)%和(85.92±2.82)%。结论:PTD-mFoxp3融合蛋白可有效降低同种异基因骨髓移植后移植物抗宿主病的发生,并减轻其临床表现,降低死亡率。 展开更多

关键词 骨髓移植 ptd-mfoxp3融合蛋白 移植物抗宿主病 调节性T细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

IL-3-LDM融合蛋白对CD123^(+)白血病细胞的靶向杀伤作用 被引量：3

2

作者 张砚君 李双静 +8 位作者 姜琳琳 刘荣 高雪 袁向飞 齐怀丰 范冬梅 苗庆芳 甄永苏 熊冬生 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期391-397,共7页

目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-... 目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系(KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji)表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。结果:组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)KG-1a细胞表面CD123阳性率最高(88.9%),其次为MO7e和TF-1细胞(>75%),再次为HL-60细胞(7.8%),而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞)的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星(adriamycin,ADR)的1415.8倍,而IL-3-LDM的杀伤强度又是LDM的9.6倍。结论:IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。 展开更多

关键词 IL-3 力达霉素 融合蛋白 CD123 白血病 肿瘤干细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组融合蛋白大肠杆菌不对称合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸 被引量：3

3

作者 朱益波 蒋卓越 +5 位作者 郭倩 郑青云 林容天 钱志浩 齐斌 王立梅 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2017年第1期49-54,共6页

将来自于Lactobacillus plantarum的突变D-乳酸脱氢酶(D-LDH^(Y52V))和Candida boidinii的甲酸脱氢酶(FDH)进行融合,重组成双功能融合蛋白,为生物法合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法。利用重叠延伸PCR技术,将对底物苯丙酮... 将来自于Lactobacillus plantarum的突变D-乳酸脱氢酶(D-LDH^(Y52V))和Candida boidinii的甲酸脱氢酶(FDH)进行融合,重组成双功能融合蛋白,为生物法合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法。利用重叠延伸PCR技术,将对底物苯丙酮酸(PPA)亲合力更高的突变蛋白D-LDH^(Y52V)与FDH通过连接肽(Gly4Ser)3融合,将融合基因克隆至表达载体p ET-28a(+),并转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导得到高效表达。SDS-PAGE电泳分析结果表明,融合蛋白分子质量为79.7 k Da,在重组菌中获得了正确表达;酶活性测定结果表明,融合蛋白具有D-LDH和FDH的双重生物学活性。在不对称转化PPA合成(R)-2-羟基-3-苯基丙酸(DPLA)的应用中,融合蛋白体系比D-LDH^(Y52V)单独表达体系的D-PLA产量提高了40.71%。通过5 h底物分批补加发酵,D-PLA产量为17.34 g/L,底物转化率为77.64%,生产强度3.47 g/(L·h)。双功能融合蛋白增强了辅酶再生的效率,有效促进了(R)-2-羟基-3-苯基丙酸的不对称合成。 展开更多

关键词 D-LDHY52V 甲酸脱氢酶 融合蛋白 D-3-苯基乳酸 辅酶再生

在线阅读 下载PDF 职称材料

EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位 被引量：2

4

作者 谷雨 李青 +6 位作者 叶菁 李烦繁 闵婕 张丽英 马钰 李航 刘芳 《医学研究生学报》 CAS 2008年第9期911-914,I0002,共5页

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位。方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed1 ... 目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位。方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a(+)-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed1、CIDE-3克隆入真核表达载体pShuttle-CMV中。酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染入293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系。结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3构建成功。荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系。 展开更多

关键词 CIDE-3 融合蛋白 EGFP DsRed1 293T细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

人分化抑制因子3基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达 被引量：5

5

作者 贾丽 李晓军 《医学研究生学报》 CAS 2008年第10期1018-1020,1025,共4页

目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础。方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-TEsay载体中并测序鉴定。将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a(+),转化入... 目的:在大肠埃希菌中表达和纯化人分化抑制因子3(Id3),为进一步研究Id3的生物学活性打下基础。方法:PCR扩增人Id3基因编码区的DNA片段,将PCR产物克隆至pGEM-TEsay载体中并测序鉴定。将Id3 cDNA片段重组入原核表达质粒pET-32a(+),转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,表达产物经Western blot鉴定,并通过镍亲和层析柱纯化His-Tag标记的融合蛋白。结果:成功地构建了Id3的原核表达载体。Western blot分析证实,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了His-Tag融合蛋白,亲和层析法纯化后获相对分子质量为34 000的Id3融合蛋白。结论:重组质粒pET32a(+)-Id3能在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白。 展开更多

关键词 分化抑制因子3 原核表达 融合蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

利用内蛋白子剪切功能一步纯化重组人神经营养因子-3 被引量：4

6

作者 袁静明 李卓玉 +2 位作者 王雅梅 徐明群 sxu.edu.cn 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第3期335-339,共5页

将人神经营养因子 - 3(h NT3)基因插入含内蛋白子 -几丁质结合区 (Intein- CBD)片段的质粒p TXB1的多克隆位点 ,构建成重组子 p TXB- h NT3,随后转化入 E.coli 2 566并进行融合表达 .表达产物包涵体经 8mol/ L脲变性 ,并在 GSH,GSSG存... 将人神经营养因子 - 3(h NT3)基因插入含内蛋白子 -几丁质结合区 (Intein- CBD)片段的质粒p TXB1的多克隆位点 ,构建成重组子 p TXB- h NT3,随后转化入 E.coli 2 566并进行融合表达 .表达产物包涵体经 8mol/ L脲变性 ,并在 GSH,GSSG存在下复性 .复性后的融合蛋白经几丁质珠亲和柱吸附 .待洗涤杂蛋白后 ,加入 50 mmol/ L DTT在 4℃或 2 5℃进行剪切反应 48h,再用缓冲液洗脱 ,即得 h NT3.SDS- PAGE分析表明 ,h NT3达电泳纯 .其分子量约为 1 4 k 展开更多

关键词 人神经营养因子-3 内蛋白子 DTT剪切 纯化

在线阅读 下载PDF 职称材料

犬卵透明带3蛋白原核表达和抗血清的制备 被引量：1

7

作者 张贝贝 王颖 +1 位作者 张冀 张富春 《四川动物》 北大核心 2016年第5期697-702,共6页

在研发控制流浪犬卵透明带3(CZP3)免疫不育疫苗的过程中,需要制备特异性的CZP3抗血清进行免疫检测。本研究克隆获得CZP3的c DNA(全长1 281 bp)和除去跨膜区和信号肽的核心片段(CZP3C,984 bp),通过构建原核表达载体p ET28a-CZP3C,转化大... 在研发控制流浪犬卵透明带3(CZP3)免疫不育疫苗的过程中,需要制备特异性的CZP3抗血清进行免疫检测。本研究克隆获得CZP3的c DNA(全长1 281 bp)和除去跨膜区和信号肽的核心片段(CZP3C,984 bp),通过构建原核表达载体p ET28a-CZP3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)。在28℃下以0.6 mmol·L^(-1)异丙基硫代β-D-半乳糖苷诱导表达4 h,获得CZP3C融合蛋白。利用CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备特异性的抗血清,并对抗血清的特异性和效价进行评价。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白以包涵体形式存在。经过镍柱亲和纯化及8 mmol·L^(-1)尿素复性后,获得了高纯度的CZP3C融合蛋白。用0.8μg·μL^(-1)的CZP3C融合蛋白免疫新西兰大白兔,免疫后的兔抗血清用Western blot及间接免疫荧光实验检测,结果证明CZP3C兔抗血清具有较高的特异性,ELISA检测效价为1∶409600。本研究所制备的抗血清能够为流浪犬免疫不育疫苗的研制提供检测材料。 展开更多

关键词 犬 卵透明带3 原核表达 融合蛋白 抗血清

在线阅读 下载PDF 职称材料

胶质细胞源性神经营养因子(△N39)-R9神经营养活性和透过血脑屏障的研究

8

作者 崔敏 潘新 王丽梅 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第8期738-744,共7页

为了研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在中枢神经系统疾病中的治疗应用,运用基因突变、蛋白质融合表达和蛋白质纯化技术获得分子质量较小的GDNF(!N39)活性片段.将HIV-1Tat蛋白转导区(proteintransductiondomain,PTD)的9个碱性氨基酸4... 为了研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在中枢神经系统疾病中的治疗应用,运用基因突变、蛋白质融合表达和蛋白质纯化技术获得分子质量较小的GDNF(!N39)活性片段.将HIV-1Tat蛋白转导区(proteintransductiondomain,PTD)的9个碱性氨基酸49RKKRRQRRR57模拟物9个精氨酸(R9)与GDNF("N39)活性片段融合表达,获得纯度达95%以上的GDNF(#N39)-R9融合蛋白.将GDNF、GDNF($N39)、GDNF(%N39)-R9分别加入原代培养的中脑多巴胺能神经元和转染GDNF受体GFR&1和Ret的PC12细胞中,观察它们的神经营养活性和毒性.运用脑微血管内皮细胞株B-Endo3,观察GDNF(’N39)-R9蛋白穿越血管内皮细胞膜的功能;运用脑血管内皮细胞和Matrigel铺板模拟血脑屏障,Transwell法检测Tat-GDNF((N39)蛋白穿越脑血管内皮细胞和外周胶质膜的能力.结果显示:GDNF()N39)-R9蛋白具有类似GDNF的神经营养活性,促进原代培养的中脑多巴胺能神经元和稳定表达GFR*1和Ret受体的PC12-GFR+1-Ret细胞株的存活,没有显示毒性,并且能很好地穿过脑微血管内皮细胞层和模拟的血脑屏障. 展开更多

关键词 胶质细胞源性神经营养因子(GDNF) 融合蛋白 脑微血管内皮细胞(B-Endo 3) 蛋白质转运 血脑屏障

在线阅读 下载PDF 职称材料

EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

9

作者 毛丽萍 王惠民 +1 位作者 王跃国 汪晓莺 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期954-957,共4页

目的:构建早期B细胞因子3(EBF3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3,使EBF3-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。方法:采用RT-PCR技术,从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因,构建EBF3... 目的:构建早期B细胞因子3(EBF3)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3,使EBF3-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞株HepG2中得到表达。方法:采用RT-PCR技术,从人胎盘组织总RNA中逆转录并扩增出EBF3全长编码基因,构建EBF3与EGFP的融合基因真核表达载体pEGFP/EBF3,用脂质体转染技术将pEGFP/EBF3导入HepG2,使EBF3-EGFP融合蛋白得到表达。结果:经转化细菌、抽提质粒、酶切鉴定和DNA序列分析证实,EBF3基因已正确插入pEGFP-N1中EGFP基因的上游,获得融合基因表达载体pEGFP/EBF3。将pEGFP/EBF3导入HepG2细胞24h后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内,转染pEGFP/EBF3和pEG-FP-N1后48h的转染效率分别为52%和59%。Westernblot证实转染pEGFP/EBF3后24h和48h细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87000的EBF3-EGFP融合蛋白,转染pEGFP/EBF3后48h和72h,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组和未转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP/EBF3,并在HepG2细胞中进行了表达,为进一步研究EBF3的功能提供实验基础。 展开更多

关键词 早期B细胞因子3 融合蛋白 增强型绿色荧光蛋白 HEPG2细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组大鼠14-3-3γ蛋白在大肠杆菌中的融合表达与分离纯化

10

作者 彭少君 何明 周复辉 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第1期58-60,共3页

目的:利用分子克隆技术在原核细胞中研究14-3-3γ融合蛋白的表达及分离纯化。方法:采用RT-PCR法从大鼠心肌组织中扩增14-3-3γcDNA编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-KG中,免疫印迹法检测表达产物。结果:... 目的:利用分子克隆技术在原核细胞中研究14-3-3γ融合蛋白的表达及分离纯化。方法:采用RT-PCR法从大鼠心肌组织中扩增14-3-3γcDNA编码区,并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-KG中,免疫印迹法检测表达产物。结果:经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达,表达产物的蛋白量约为菌体总蛋白的27.08%,相对分子质量为56000左右。能与抗鼠14-3-3γ多克隆抗体特异性结合。结论:表明成功构建了GST-14-3-3γ融合蛋白载体,在大肠杆菌中有高效表达,并具有良好的免疫反应性。 展开更多

关键词 重组14—3—3γ蛋白 原核表达 GST-融合蛋白 分离纯化 多克隆抗体 大鼠

在线阅读 下载PDF 职称材料

基因重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-3融合蛋白在猕猴中的药代动力学

11

作者 刘秀文 汤仲明 +1 位作者 屠敏 薛爱群 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期389-393,共5页

目的　研究重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 白细胞介素 3融合蛋白 (PIXY32 1)在猕猴中的药动学。方法　12 5I 标记结合反相高效液相和酸沉淀法。结果　 12 5I PIXY32 1纯度为 94 5 % ,标记前后PIXY32 1对TF 1细胞增殖的ED50 分别为 0... 目的　研究重组人粒 /巨噬细胞集落刺激因子 白细胞介素 3融合蛋白 (PIXY32 1)在猕猴中的药动学。方法　12 5I 标记结合反相高效液相和酸沉淀法。结果　 12 5I PIXY32 1纯度为 94 5 % ,标记前后PIXY32 1对TF 1细胞增殖的ED50 分别为 0 12 5和 0 119μg·L-1。12 5I PIXY32 1在体内迅速降解。iv和sc后末端T1/ 2 相近 ,为 6 6～ 8 2h。AUC随sc剂量增大 ,全身清除率ClS 相近 ,sc生物利用度6 3 %± 2 1%。泌尿系统浓度最高 ,胆汁其次 ,骨髓和脾脏高于其它组织略低于血清 ,脑内最低。主要经尿排泄 ,少部分在尿中以原型排出。结论　猕猴sc12 5I PIXY32 12 0～ 80 μg·kg-1后为线性药代动力学。肾脏在12 5I PIXY32 展开更多

关键词 粒-巨噬细胞集落刺激因子 白细胞介素-3 融合蛋白 猕猴 药代动力学

在线阅读 下载PDF 职称材料

磷脂酰肌醇-3激酶不直接调控PC12细胞的分泌 被引量：1

12

作者 刘媛媛 赵平 +2 位作者 吴政星 瞿安连 徐涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第8期734-739,共6页

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是磷脂酰肌醇代谢过程中一种重要的酶,通过其代谢产物参与了对多种细胞生理活动的调节,如囊泡运输、细胞骨架重组、细胞存活、吞噬作用、细胞凋亡等.为研究其对细胞分泌功能的作用,使用磷脂酰肌醇-3激酶家族的特... 磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)是磷脂酰肌醇代谢过程中一种重要的酶,通过其代谢产物参与了对多种细胞生理活动的调节,如囊泡运输、细胞骨架重组、细胞存活、吞噬作用、细胞凋亡等.为研究其对细胞分泌功能的作用,使用磷脂酰肌醇-3激酶家族的特异性抑制剂渥曼青霉素(wortmannin)阻断磷脂酰肌醇-3激酶的活性,以EGFP-2xFYVE融合蛋白与磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的结合为指征,使用荧光显微成像技术检测渥曼青霉素对磷脂酰肌醇-3激酶的抑制作用,采用膜片钳膜电容测量方法及光解钙离子释放技术检测渥曼青霉素对PC12细胞分泌功能的影响.实验结果表明,wortmannin阻断了磷脂酰肌醇-3激酶的活性,抑制了磷脂酰肌醇-3-磷酸(PtdIns-3-P)的产生,并使FYVE与PtdIns-3-P解离,但渥曼青霉素处理之前和处理30min后的PC12细胞分泌反应的幅度、动力学特性和分泌的钙依赖性均无显著差异,表明磷脂酰肌醇-3激酶对PC12细胞的分泌无显著的直接影响. 展开更多

关键词 磷酸酰肌醇-3激酶 渥曼青霉素 PC12细胞 分泌动力学 钙依赖性 钙离子光解释放技术 EGFP-2xFYVE融合蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

具有生物活性的人带3蛋白胞质片段融合蛋白的克隆、表达与纯化

13

作者 郑玉娟 邢菲菲 +3 位作者 孙立伟 刘立岩 赵大庆 倪嘉缵 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2003年第3期386-389,共4页

用 PCR法从质粒 p HB3中扩增了人红细胞带 3蛋白胞质片段 (CDB3 )基因 .PCR产物经限制性内切酶切割后与多克隆位点处带有编码 6个组氨酸序列的高效表达载体 p ET2 8b连接 ,构建为重组子p CDBHistag.重组子经酶切及序列测定后在大肠杆菌 ... 用 PCR法从质粒 p HB3中扩增了人红细胞带 3蛋白胞质片段 (CDB3 )基因 .PCR产物经限制性内切酶切割后与多克隆位点处带有编码 6个组氨酸序列的高效表达载体 p ET2 8b连接 ,构建为重组子p CDBHistag.重组子经酶切及序列测定后在大肠杆菌 BL2 1 (DE3 )中获得高效表达 ,可溶性目的蛋白占菌体总蛋白的 4 0 %左右 .C端带有 6个连续组氨酸的带 3蛋白胞质片段作为融合蛋白不仅可以降低宿主菌蛋白酶对其水解程度 ,而且简化了目的蛋白的纯化过程 .经一步螯合 Ni2 +的亲和层析获得了电泳纯的带 3蛋白胞质片段融合蛋白 .活性测定结果表明 ,带 3蛋白胞质片段融合蛋白能够抑制醛缩酶 (Aldolase)活性的70 % ,与文献报道的人红细胞内带 3蛋白胞质片段具有相同的功能 . 展开更多

关键词 带3蛋白胞质片段 融合蛋白 纯化 亲和层析 基因表达 基因克隆

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组人可溶性Tim-3原核表达载体的构建及其重组蛋白的优化表达

14

作者 白少云 卿吉琳 +2 位作者 刘振 谭源福 陈治中 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第3期276-280,290,共6页

目的构建人可溶性Tim-3(sTim-3)的重组质粒表达载体pET28a-sTim-3-EGFP,在大肠埃希菌中进行诱导表达并对其表达条件进行优化。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增Tim-3基因胞外段序列,克隆入已构建的表达载体pET28a-EGFP中,鉴定阳... 目的构建人可溶性Tim-3(sTim-3)的重组质粒表达载体pET28a-sTim-3-EGFP,在大肠埃希菌中进行诱导表达并对其表达条件进行优化。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增Tim-3基因胞外段序列,克隆入已构建的表达载体pET28a-EGFP中,鉴定阳性克隆。重组质粒转化BL21(DE3),通过调整IPTG浓度、诱导时机、诱导温度与诱导时间优化蛋白表达条件。结果成功构建原核表达载体pET28a-sTim-3-EGFP,并转化BL21(DE3)进行诱导表达。温度和IPTG浓度对蛋白表达量影响不大;在培养至A600nm值约为0.6~0.8时于25℃诱导5h可获得较高的蛋白表达。结论成功表达可溶性重组蛋白sTim-3-EGFP,为该蛋白的进一步纯化生产及应用奠定了良好基础。 展开更多

关键词 TIM-3 原核表达 增强绿色荧光蛋白 融合蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

rhGM-CSF/IL-3融合蛋白对人骨髓造血祖细胞体外培养的研究 被引量：2

15

作者 戴盛明 肖桂元 +3 位作者 周少雄 郑兴武 饶颖竹 周甘平 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1998年第5期326-328,共3页

研究了ｒｈＧＭＣＳＦ／ＩＬ３融合蛋白对人骨髓造血祖细胞（ＣＦＵＧＭ、ＣＦＵＧＥＭＭ、ＢＦＵＥ）集落形成的影响，结果表明ｒｈＧＭＣＳＦ／ＩＬ３能显著促进ＣＦＵＧＭ、ＣＦＵＧＥＭＭ、ＢＦＵＥ集落的形成... 研究了ｒｈＧＭＣＳＦ／ＩＬ３融合蛋白对人骨髓造血祖细胞（ＣＦＵＧＭ、ＣＦＵＧＥＭＭ、ＢＦＵＥ）集落形成的影响，结果表明ｒｈＧＭＣＳＦ／ＩＬ３能显著促进ＣＦＵＧＭ、ＣＦＵＧＥＭＭ、ＢＦＵＥ集落的形成，分别与ＧＭＣＳＦ、ＩＬ３单独或联合用药比较，差异有显著性（Ｐ＜０００１），ＣＦＵＧＭ、ＣＦＵＧＥＭＭ、ＢＦＵＥ集落的形成对融合蛋白均有剂量依赖性，培养体系浓度在５～１０ｎｇ／ｍｌ时，各个集落生长效果最好。提示ｒｈＧＭＣＳＦ／ＩＬ３对造血祖细胞的生长发挥着重要作用，可能成为放疗、化疗后继ＧＭＣＳＦ及ＩＬ３更重要的造血制剂。 展开更多

关键词 RHGM-CSF IL-3 融合蛋白 骨髓 造血干细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

16

作者 伍贤军 缪璇 +3 位作者 程秀 王妍青 辻一郎 李晓萌 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1024-1027,1175,共5页

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP... 目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果:重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论:成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。 展开更多

关键词 GFP-SUMO-3融合蛋白 重组蛋白质类 LNCAP细胞 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

rhGM-CSF/IL-3融合蛋白对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡的影响

17

作者 戴盛明 肖桂元 +4 位作者 周少雄 饶颖竹 郑兴武 周甘平 吴茂莲 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1998年第1期36-38,共3页

本研究采用HL-60白血病细胞系探讨了rhGM-CSF/IL-3融合蛋白对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡的影响,结果表明,Ara-C与rhGM-CSF/IL-3联合应用处理HL-60比Ara-C单独作用更能显著提高寡核苷体DNA片段、抑制HL-60集落形成;rhGM-CSF/IL-3对Ara-C... 本研究采用HL-60白血病细胞系探讨了rhGM-CSF/IL-3融合蛋白对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡的影响,结果表明,Ara-C与rhGM-CSF/IL-3联合应用处理HL-60比Ara-C单独作用更能显著提高寡核苷体DNA片段、抑制HL-60集落形成;rhGM-CSF/IL-3对Ara-C介导的HL-60细胞凋亡率的影响比不加rhGM-CSF/IL-3的对照组有明显提高,且比rhGM-CSF与rhIL-3联用作用更明显,但对正常人外周血白细胞作用较弱,提示可能对于rhGM-CSF/IL-3诱导缓解期白血病具有一定作用. 展开更多

关键词 GM-CSF IL-3 融合蛋白 HL-60细胞系 白血病

在线阅读 下载PDF 职称材料

融合蛋白催化D-葡萄糖合成D-阿洛酮糖的研究

18

作者 张家赫 冯敬杰 +4 位作者 刘微微 常楚婷 郭庆彬 丁文涛 王昌禄 《食品科学技术学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第6期113-120,153,共9页

D-阿洛酮糖是一种新型功能性代糖,目前主要以价格较高的D-果糖为底物,通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化获得。寻找低价原料替代D-果糖生产D-阿洛酮糖对其产业化具有重要意义。将葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖3-差向异构酶通过柔性或刚性连接... D-阿洛酮糖是一种新型功能性代糖,目前主要以价格较高的D-果糖为底物,通过D-阿洛酮糖3-差向异构酶转化获得。寻找低价原料替代D-果糖生产D-阿洛酮糖对其产业化具有重要意义。将葡萄糖异构酶与D-阿洛酮糖3-差向异构酶通过柔性或刚性连接肽,以不同顺序首尾相连,构建4种构型的融合蛋白,从中选择催化效果最好的融合蛋白构型并对此融合蛋白的催化条件进行优化,实现了以价格较低的D-葡萄糖为底物经催化合成D-阿洛酮糖。研究结果表明:融合蛋白AE3G和AS3G同时具备葡萄糖异构酶和D-阿洛酮糖3-差向异构酶活性,能够将D-葡萄糖转化为D-果糖和D-阿洛酮糖。采用刚性连接肽连接的AE3G活性优于使用柔性连接肽连接的AS3G。优化后的AE3G催化条件为65℃,Tris-HCl缓冲液为50 mmol/L,pH值为7.5,Co 2+浓度为0.5 mmol/L,Mn 2+浓度为0.5 mmol/L,湿细胞质量浓度为75 g/L。在此条件下,分别以100 g/L D-葡萄糖和体积分数为5%的F55果葡糖浆为底物,利用融合蛋白催化产生17.2 g/L和12.5 g/L D-阿洛酮糖,反应液中D-葡萄糖、D-果糖和D-阿洛酮糖的质量比为2.5∶2.3∶1.0。研究旨在证明融合蛋白催化D-葡萄糖转化成D-阿洛酮糖的可行性。研究结果表明,D-阿洛酮糖平衡浓度高于文献报道值,希望为低成本生产D-阿洛酮糖提供理论参考。 展开更多

关键词 融合蛋白 葡萄糖异构酶 D-阿洛酮糖3-差向异构酶 D-阿洛酮糖 果葡糖浆 D-葡萄糖

在线阅读 下载PDF 职称材料

结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)抑制小鼠巨噬细胞自噬 被引量：8

19

作者 胡东 王婉 +5 位作者 赵润鹏 徐雪维 邢应如 徐从景 张荣波 吴静 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期726-729,共4页

目的研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(Sap M)对小鼠巨噬细胞自噬的影响。方法分别用Sap M、渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-Raw264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ水平;再用Sap M处... 目的研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(Sap M)对小鼠巨噬细胞自噬的影响。方法分别用Sap M、渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-Raw264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ水平;再用Sap M处理GFP-LC3-Raw264.7细胞后加氯喹,Western blot法检测LC3Ⅱ水平。结果 Sap M和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高,在Sap M处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。结论 Sap M可阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。 展开更多

关键词 结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM) 自噬 融合 Raw264.7细胞 微管蛋白相关轻链3(LC3)

在线阅读 下载PDF 职称材料

鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达 被引量：1

20

作者 刘雪兰 戴银 +3 位作者 程宝艳 彭明义 王骏俊 余为一 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2010年第7期3862-3864,共3页

[目的]研究鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位(NDV F2-3)的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重... [目的]研究鸡γ-干扰素(ChIFN-γ)的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位(NDV F2-3)的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。 展开更多

关键词 鸡IFN-γ NDVF2-3 融合蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料