双Intein介导3片段vWF的反式剪接 被引量：3

1

作者 朱甫祥 郭猛 +2 位作者 刘泽隆 屈慧鸽 迟晓艳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期157-163,共7页

von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体... von Willebrand因子(vWF)基因突变导致血管性血友病(VWD),由于其基因过大在基因治疗研究中难以为多数病毒载体携带.利用双内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能研究断裂成3段的vWF基因分别表达后在蛋白水平的连接,旨在为vWF基因的3载体联合转移应用于VWD基因治疗研究提供依据.将vWF cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段(N、M和C),分别与splitSspDnaE intein的N端(En)、C端(Ec)和splitSspDnaB intein的N端(Bn)、C端(Bc)编码序列融合,构建到原核表达载体pET-28a(+)中的His-Tag的下游,得到3种表达载体pET-NEn、pET-EcMBn和pET-BcC.分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞,经IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE分析融合蛋白的表达,并进一步用His-Tag的特异性抗体进行分析;亲和层析纯化分别表达的带His-Tag标签的3段蛋白,复性后体外混合进行剪接实验以观察3片段vWF的连接.结果显示,3段预期大小的融合intein的vWF蛋白均有表达,用His-Tag抗体进行的Western印迹得到进一步证实;3段纯化的蛋白混合后可见明显的剪接条带形成,与vWF的预期分子量大小一致,表明双intein通过蛋白质反式剪接可有效连接3个片段的vWF,为进一步应用蛋白质剪接技术的3重载体真核细胞转vWF基因奠定了基础. 展开更多

关键词 内含肽 蛋白质反式剪接 von WILLEBRAND因子

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钯配合物对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用

2

作者 刘嬿 吴芩 +1 位作者 郑玉船 刘扬中 《高等学校化学学报》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2013年第2期272-276,共5页

研究了5种钯配合物Pd(bipy)Cl2,Pd(phen)Cl2,[Pd(dien)Cl]Cl,trans-Pd(NH3)2Cl2和cis-Pd(NH3)2 Cl2对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用.结果表明,trans-Pd(NH3)2 Cl2的抑制活性最好,IC50=3.3×10-5 mol/L.钯配合物通过与int... 研究了5种钯配合物Pd(bipy)Cl2,Pd(phen)Cl2,[Pd(dien)Cl]Cl,trans-Pd(NH3)2Cl2和cis-Pd(NH3)2 Cl2对结核杆菌RecA intein蛋白质剪接的抑制作用.结果表明,trans-Pd(NH3)2 Cl2的抑制活性最好,IC50=3.3×10-5 mol/L.钯配合物通过与intein的第一个氨基酸(半胱氨酸)配位,从而抑制蛋白质的剪接活性.荧光猝灭的动力学数据表明,配体的大小会明显影响钯配合物与intein的相互作用,配体越大,作用越慢. 展开更多

关键词 蛋白质内含子 蛋白质剪接 钯配合物

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Split Inteins介导的多肽链两端标记

3

作者 张晓玲 戴旭东 +1 位作者 林瑛 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期535-542,共8页

多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ub... 多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面.但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求.本文以Diub(ubiquitin dimer)蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子(split inteins)的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的. 展开更多

关键词 断裂蛋白质内含子 蛋白质反式剪接 N端和C端标记 荧光基团

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异源生物中筛选高剪接活性Intein系统的建立

4

作者 周倩 孟清 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期282-286,共5页

原始物种体内蛋白质内含子(intein)介导的自催化蛋白剪接反应以100%效率进行.当这些蛋白质内含子被克隆入异源物种时,其剪接效率往往大大降低,绝大多数甚至完全失去剪接能力.本研究根据蛋白质内含子剪接活性与蛋白质外显子(extein)C端第... 原始物种体内蛋白质内含子(intein)介导的自催化蛋白剪接反应以100%效率进行.当这些蛋白质内含子被克隆入异源物种时,其剪接效率往往大大降低,绝大多数甚至完全失去剪接能力.本研究根据蛋白质内含子剪接活性与蛋白质外显子(extein)C端第1个保守氨基酸直接相关的特点,设计含有所有这些保守氨基酸的多个短的蛋白质外显子序列,通过PCR引入到卡那霉素抗性蛋白(KanR)的不同位点中,在此外显子中克隆入相应的蛋白质内含子,构建在大肠杆菌中依赖卡那霉素抗性来筛选高剪接活性蛋白质内含子的系统.结果显示,卡那霉素平板上菌落生长的结果与Western印迹检测的结果基本一致.说明建立的筛选高剪接活性蛋白质内含子系统成功.这种含有可选择蛋白质外显子的筛选系统,将蛋白质剪接与卡那霉素抗性相结合,直接从平板上观测剪接结果,成为快速、稳定筛选在异源物种中具有剪接活性蛋白内含子的新手段. 展开更多

关键词 蛋白质内含子 蛋白质外显子 卡那霉素抗性 蛋白质剪接

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Anti-metastatic Effect of Repeated Cyclic-GRGDSPA Peptide Produced by Intein Protein Trans-splicing on Murine B16 Melanoma Cells 被引量：1

5

作者 Fuxiang ZHU Zelong LIU +1 位作者 Xiaoyan CHI Xianqing LIU 《中国肺癌杂志》 CAS 2009年第6期665-667,共3页

Background and objective Metastasis is one of the most important causes of mortality in tumor. The pathological process of metastasis includes several sequential steps as

关键词 肺癌 治疗 临床 药物

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卡纳抗性结核杆菌RecA intein蛋白剪接抑制剂筛选系统

6

作者 胡静平 姜羽婷 齐兴梅 《生物学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期101-103,共3页

结核分枝杆菌中的3个蛋白分别受intein调控,必须经过翻译后的蛋白剪接将intein去除才能成为有活性的蛋白,并且它们对结核杆菌的生长繁殖非常重要。这表明intein可以作为抗结核药物的一个新的作用靶点。因此,建立一个蛋白剪接抑制剂的高... 结核分枝杆菌中的3个蛋白分别受intein调控,必须经过翻译后的蛋白剪接将intein去除才能成为有活性的蛋白,并且它们对结核杆菌的生长繁殖非常重要。这表明intein可以作为抗结核药物的一个新的作用靶点。因此,建立一个蛋白剪接抑制剂的高通量筛选系统对于大规模筛选抗结核新药尤为重要。将结核杆菌的RecA intein插入卡那霉素抗性蛋白基因中破坏其卡那霉素抗性,再通过intein剪接将其恢复。利用卡那霉素的LB平板筛选和Western Blot验证,结果表明依赖卡那霉素抗性的筛选系统可以精确地反映intein的剪接效率,因此可以作为intein剪接抑制剂的筛选系统。为了验证该系统的可行性,在含有卡那霉素的液体LB培养基中加入对intein剪接有抑制作用的顺铂,结果表明大肠杆菌的生长受到严重影响,从而直接反映顺铂对intein的剪接抑制作用。 展开更多

关键词 结核杆菌 蛋白质内含子 蛋白质剪接 卡那霉素抗性

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1种高效纳米抗体生产方法的建立

7

作者 贺生芳 付向晶 +5 位作者 刘阳坤 慕国辉 刘海金 王兴龙 杜恩岐 杨增岐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第9期1487-1493,共7页

为实现纳米抗体的简单、高效、低成本表达,在已有的商品化原核表达载体的基础上,对其进行改造,在靶蛋白N端分别融合3种不同串联融合标签His-Intein、His-Sumo-Intein和His-Trx-Intein,以本实验室筛选的抗猪圆环病毒2(PCV2)Cap蛋白的纳... 为实现纳米抗体的简单、高效、低成本表达,在已有的商品化原核表达载体的基础上,对其进行改造,在靶蛋白N端分别融合3种不同串联融合标签His-Intein、His-Sumo-Intein和His-Trx-Intein,以本实验室筛选的抗猪圆环病毒2(PCV2)Cap蛋白的纳米抗体基因为靶蛋白,构建了pHSIE-Nb(His-Sumo-Intein)、pHSIE-intein-Nb(His-Intein)和pET32a-intein-Nb(His-Trx-Intein)3种表达载体。分别转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导融合蛋白表达,在不同表达条件下比较,选取可溶性表达最好的载体大量表达,用Ni-NTA金属螯合层析柱进行纯化,并利用Intein自剪切去除标签,纯化纳米抗体。且用制备的纳米抗体作为包被抗体,做双抗体夹心ELISA检测其反应原性。结果显示3种不同融合标签的纳米抗体都可成功表达,而融合His-Trx-Intein标签的载体可溶性表达量最高。融合蛋白经pH7、25℃剪切24h后可以得到不含融合标签的纳米抗体。双抗体夹心ELISA检测,统计学分析,制备的抗PCV2Cap纳米抗体蛋白包被的样品组与阳性对照组差异不显著(P>0.05),因此制备的纳米抗体是有活性的。本研究成功建立一种高效表达、纯化纳米抗体的方法,可以增加蛋白表达量、可溶性和简化蛋白纯化过程,获得具有活性的无标签的纳米抗体。为其进一步的纳米抗体理论研究和生产应用提供技术支持。 展开更多

关键词 纳米抗体 融合标签 自剪切intein 表达纯化 双抗夹心ELISA

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内含肽介导的绿色荧光蛋白纯化 被引量：8

8

作者 赵仲麟 顿文涛 +4 位作者 李燕 金显春 杨国玉 苏同福 袁超 《河南农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期581-584,共4页

利用来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB内含肽的剪切特性,纯化绿色荧光蛋白.在大肠杆菌中将内含肽与绿色荧光蛋白融合表达,绿色荧光蛋白融合于DnaB内含肽的C端,在20℃,pH 7.0的条件下诱导DnaB内含肽的自剪切发生,利用几丁质... 利用来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB内含肽的剪切特性,纯化绿色荧光蛋白.在大肠杆菌中将内含肽与绿色荧光蛋白融合表达,绿色荧光蛋白融合于DnaB内含肽的C端,在20℃,pH 7.0的条件下诱导DnaB内含肽的自剪切发生,利用几丁质亲和柱纯化到无亲和标签的绿色荧光蛋白,得到蛋白有较高的纯度和较好的活性. 展开更多

关键词 内含肽 蛋白质剪接 绿色荧光蛋白 纯化

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vWF-△Pro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FⅧ基因转移 被引量：6

9

作者 朱甫祥 杨树德 +2 位作者 刘泽隆 屈慧鸽 迟晓艳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期720-726,共7页

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的... 多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合SspDnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性.结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21ng/mL,活性为1.78±0.18IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12ng/mL和1.05±0.13IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19ng/mL和1.95±0.22IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性.为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据. 展开更多

关键词 von WILLEBRAND因子 BDD-FⅧ 转基因 内含肽 蛋白质反式剪接

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内含肽介导谷氨酰胺转胺酶酶原的活化 被引量：6

10

作者 杜坤 周丽 +2 位作者 堵国成 陈坚 周哲敏 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第9期90-94,共5页

链霉菌来源的谷氨酰胺转胺酶(microbial transglutaminase,MTG)以酶原(pro-MTG)的形式表达,需要蛋白酶将其活化。蛋白酶有降解MTG及其底物的可能,且增加MTG的分离纯化成本。为解决上述问题,将一种pH值依赖型的内含肽(intein)插入pro区和... 链霉菌来源的谷氨酰胺转胺酶(microbial transglutaminase,MTG)以酶原(pro-MTG)的形式表达,需要蛋白酶将其活化。蛋白酶有降解MTG及其底物的可能,且增加MTG的分离纯化成本。为解决上述问题,将一种pH值依赖型的内含肽(intein)插入pro区和MTG之间,用以介导二者之间的断裂,实现MTG的pH值控制活化。结果表明:重组蛋白(pro-Intein-MTG)在大肠杆菌中实现了可溶高表达。在pH7.0、25℃的体外环境下,重组蛋白经24h即可完全转化为MTG,且最高酶活力为0.23U/mL(菌体浓度稀释至OD600nm为1.0时测得)。重组型MTG的酶比活力和Km值分别为14.3U/mg、69.4mmol/L,与野生型MTG相近;且圆二色谱显示二者具有相似的二级结构,说明内含肽的插入对于MTG的功能和结构无显著影响。 展开更多

关键词 蛋白质剪接技术 内含肽 酶原活化 谷氨酰胺转胺酶 吸水链霉菌

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多肽融合标签的移除策略 被引量：7

11

作者 谢浩 杨程 陈丽娥 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1364-1369,共6页

多肽融合标签能够赋予目标蛋白新的特性,便于目标蛋白的定位、追踪、纯化以及结构和相互作用研究.但在很多情况下,尤其是研究蛋白质结构或分离纯化药用蛋白时,需要将多肽融合标签从融合蛋白上切除,以降低和消除多肽融合标签对目标蛋白... 多肽融合标签能够赋予目标蛋白新的特性,便于目标蛋白的定位、追踪、纯化以及结构和相互作用研究.但在很多情况下,尤其是研究蛋白质结构或分离纯化药用蛋白时,需要将多肽融合标签从融合蛋白上切除,以降低和消除多肽融合标签对目标蛋白结构和功能的影响.可用来切除多肽融合标签的方法主要有4种,即化学法、内切蛋白酶法、外切蛋白酶法以及自我剪切法.介绍和比较了每种方法的基本原理、应用以及研究进展. 展开更多

关键词 融合蛋白 多肽融合标签 标签移除 内含肽 蛋白酶

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内含肽介导的氯离子通道蛋白CFTR的反式剪接 被引量：7

12

作者 朱甫祥 刘泽隆 +1 位作者 屈慧鸽 迟晓艳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期844-848,共5页

研究利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的反式剪接作用.CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis,CF).将C... 研究利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator,CFTR)的反式剪接作用.CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis,CF).将CFTR的cDNA于剪接反应所需的保守性氨基酸残基Ser660前断裂为N端和C端,分别与split mini Ssp DnaB内含肽的106个氨基酸残基的N端和48个氨基酸残基的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pBV220.诱导表达后SDS-PAGE可见预期大小剪接形成的CFTR蛋白条带,Western印迹用CFTR特异性抗体进一步证明为剪接所产生的CFTR蛋白,表明内含肽可有效催化CFTR的反式剪接. 展开更多

关键词 内含肽 蛋白质反式剪接 囊性纤维化跨膜传导调节因子

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酸性区3融合重链促进基于蛋白质内含子的双载体B域缺失型凝血因子Ⅷ转基因表达 被引量：4

13

作者 朱甫祥 杨树德 +3 位作者 刘泽隆 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2010年第11期1225-1231,共7页

最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生.为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作... 最近的研究表明,蛋白质内含子(intein)介导的B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)的轻链和重链剪接可顺式促进后者的分泌,而且剪接反应在细胞内、外均可发生.为进一步提高基于蛋白质内含子的双载体转BDD-FⅧ基因的功效,将具有促进重链分泌作用的位于Pro1640～Ser1690的酸性区3(acidic region-3,AR-3)引入重链,检验对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性的影响.用融合蛋白内含子的附加ar-3重链(HCAR3IntN)基因和轻链(IntCLC)基因共转染培养的HEK293细胞,分别用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中剪接BDD-FⅧ蛋白量和生物活性,并用免疫印迹观察了细胞内的BDD-FⅧ剪接.结果显示,共转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞,分泌至上清的剪接BDD-FⅧ蛋白量和活性分别为(173±26)μg/L和(1.31±0.15)U/ml,明显高于未添加ar-3的蛋白质内含子融合重链(HCIntN)与轻链(IntCLC)基因共转染细胞[(102±12)μg/L和(0.79±0.09)U/ml],提示AR-3对蛋白质内含子剪接的BDD-FⅧ蛋白分泌和活性有明显改善作用.而且,分别转HCAR3IntN和IntCLC基因细胞混合培养后的上清中,亦检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白和活性[(35±7)μg/L和(0.28±0.08)U/ml],表明蛋白质内含子可进行不依赖细胞机制的蛋白质剪接.另外,转基因细胞总蛋白呈现明显的可与FⅧ多克隆抗体进行反应的剪接BDD-FⅧ蛋白条带,直观地反映细胞内BDD-FⅧ的剪接.为动物模体内运用蛋白质反式剪接技术的双腺相关病毒载体(AAV)转BDD-FⅧ基因实验提供了依据. 展开更多

关键词 凝血因子Ⅷ 酸性区3 分泌 蛋白质内含子 蛋白质反式剪接

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内含肽介导的蛋白连接技术及其应用 被引量：4

14

作者 赵仲麟 袁超 +3 位作者 朱伟 宋晓燕 李聪 马斌强 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期70-73,共4页

内含肽介导的蛋白质剪接是一种自发的翻译后事件,内含肽可介导其自身从前体蛋白上切除,同时将其两侧的外显肽连接起来。在过去10多年中,基于蛋白质剪接原理发展出的蛋白连接技术被广泛的用于蛋白质工程的研究中。这些技术打破了化学合... 内含肽介导的蛋白质剪接是一种自发的翻译后事件,内含肽可介导其自身从前体蛋白上切除,同时将其两侧的外显肽连接起来。在过去10多年中,基于蛋白质剪接原理发展出的蛋白连接技术被广泛的用于蛋白质工程的研究中。这些技术打破了化学合成方法中对目标物大小的限制,有助于化学和生物学的研究。针对近年由蛋白质连接演化出来的新技术及其应用做简要的阐述。 展开更多

关键词 内含肽 蛋白质剪接 技术 蛋白连接

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在大肠杆菌中高效表达具有抗病毒活性的可溶性犬α7干扰素 被引量：5

15

作者 唐博 崔子寅 +3 位作者 王艺萌 魏双施 高明春 王君伟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期321-324,共4页

为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein(SDI)基因,并将该融合基因连接至p... 为了在大肠杆菌表达系统中高效表达具有抗病毒活性的犬α干扰素(CaIFN-α),本研究从犬肝脏中PCR获得CaIFN-α第7亚型(CaIFN-α7)基因,通过重叠延伸PCR方法在CaIFN-α7的N端融合连接内含肽SspDnaB intein(SDI)基因,并将该融合基因连接至pMAL-c2X载体中,构建含有内含肽和麦芽糖结合蛋白基因的CaIFN-α重组质粒。重组质粒在大肠杆菌Rosetta中经IPTG诱导高效表达可溶性CaIFN-α蛋白,经直链淀粉树脂亲和层析纯化后可以得到纯度较高的目的蛋白。重组蛋白经MDCK-CDV检测系统证明具有生物学活性,为该干扰素的大量生产及临床应用奠定了基础。 展开更多

关键词 犬α干扰素 内含肽 麦芽糖结合蛋白 可溶性表达 抗病毒活性

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内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成 被引量：2

16

作者 朱甫祥 杨树德 +3 位作者 刘泽隆 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2011年第1期67-74,共8页

vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,... vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据. 展开更多

关键词 内含肽 蛋白质反式剪接 von WILLEBRAND因子 转基因 多聚体化 FVIII载体

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重组环状胸腺五肽结构类似物Cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-)的制备、鉴定和活性检测 被引量：2

17

作者 余榕捷 高媛 +4 位作者 林剑 谢秋玲 谭毅力 洪岸 周天鸿 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期652-658,共7页

为了实现蛋白内含肽(Intein)介导的重组环状胸腺五肽结构类似物[cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-),cTP]的高效制备,设计并合成编码6个氨基酸的cTP基因,克隆到表达载体pTWIN1,重组表达质粒pTW-cTp转化E.coliER2566构建工程菌,IPTG诱导... 为了实现蛋白内含肽(Intein)介导的重组环状胸腺五肽结构类似物[cyclo-(Cys-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-),cTP]的高效制备,设计并合成编码6个氨基酸的cTP基因,克隆到表达载体pTWIN1,重组表达质粒pTW-cTp转化E.coliER2566构建工程菌,IPTG诱导由几丁质结合域纯化标签(chitinbindingdomain,CBD)、2个蛋白内含肽和目的多肽组成的“多元”融合蛋白(CBD-intein1-cTP-intein2-CBD)的高效表达.几丁质柱亲合层析纯化融合蛋白后,改变pH值和温度诱导intein1C端切割,硫醇MESNA诱导intein2N端切割,释放N端为Cys,C端为硫酯的重组cTP线性前体,通过非保护多肽硫酯环合法实现环肽生成.激光飞行质谱结果显示,纯化产物的分子量为764·4,与环肽的理论值相符.免疫活性检测结果显示,环肽cTP较线性多肽TP-5具有更显著的促进巨噬细胞吞噬能力的活性(P<0·01)和促进B细胞抗体生成的活性(P<0·01). 展开更多

关键词 重组环肽 蛋白内含肽 非保护多肽硫酯环合

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蛋白质内含子演化分析 被引量：1

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作者 谢君 黄京飞 +4 位作者 石秀凡 邵丹 柳树群 梁宠荣 刘次全 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第3期396-399,共4页

蛋白质内含子是能够自我剪切的一段多肽链 .它在生物三大系统中都存在 ,但它的分布在各物种间以及蛋白质种类之间极不均衡 .蛋白质内含子的演化和扩散也因此引起了人们的极大兴趣 .经过系统搜索 ,从已知的核酸序列中找到 6 9个经典的蛋... 蛋白质内含子是能够自我剪切的一段多肽链 .它在生物三大系统中都存在 ,但它的分布在各物种间以及蛋白质种类之间极不均衡 .蛋白质内含子的演化和扩散也因此引起了人们的极大兴趣 .经过系统搜索 ,从已知的核酸序列中找到 6 9个经典的蛋白质内含子 .同源比较和系统树分析表明 ,蛋白质内含子的演化应综合先天遗传和后天转移两方面的因素 . 展开更多

关键词 蛋白质内含子 演化 亲缘关系 同源蛋白质内含子

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蓝细菌分离DnaE内含肽的自我剪接研究 被引量：2

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作者 魏新元 丑敏霞 +1 位作者 闻盼盼 刘东斌 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第2期160-164,共5页

【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时... 【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时,两段分离的dnaE序列被克隆到同一表达载体,构建双重组表达质粒,两段序列具有各自的ORF,但由同一启动子调控。双重组表达质粒经诱导之后,利用以上获得的抗体对含有内含肽的DnaE蛋白在大肠杆菌表达体系中的自我剪接反应进行检测。【结果】在双重组表达质粒的表达产物中,抗体不仅可以分别与对应的蛋白质反应,而且还可以同时识别1条新条带,该条带的表观分子量与成熟DnaE的理论值大致相符。【结论】蓝细菌分离的DnaE内含肽在大肠杆菌表达体系中可以进行自我剪接;本研究中获得的抗体具有较好的特异性,无明显背景干扰,而且效价高,抗体可以稀释1 000倍以上使用,也可以用于相关方面的研究。 展开更多

关键词 DnaE内含肽 重组表达质粒 自我剪接 蓝细菌

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Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVⅢ重链和轻链的剪接 被引量：2

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作者 朱甫祥 刘泽隆 +2 位作者 缪静 屈慧鸽 迟晓艳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期234-239,共6页

本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD-FVⅢ基因功效.将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,... 本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD-FVⅢ基因功效.将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成,用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL),明显高于野生型BDD-FVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL);混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDD-FVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL),与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞(分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05IU/mL)相近,反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接.结果表明,重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDD-FVⅢ基因的功效.为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据. 展开更多

关键词 B区缺失型凝血因子8 共表达 二硫键 蛋白内含子 蛋白质反式剪接

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