摘要
目的许多研究表明,心肌细胞的凋亡与心衰和冠心病等心血管疾病关系密切。另外有研究表明,ROCK1(Rho-associated coiled-coil protein kinase-1)和ROCK2的表达下调可抑制某些细胞的凋亡。为此,我们将靶向ROCK1和ROCK2基因的shRNA转染大鼠心肌细胞,以沉默ROCK1和ROCK2的表达,探讨ROCK1和ROCK2在缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法 (1)原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。(2)构建并鉴定靶向大鼠ROCK1和ROCK2基因的重组质粒ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA各3个。(3)用脂质体转染法将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后提取蛋白,用Western Blotting检测ROCK1和ROCK2蛋白的表达量,并筛选出沉默效率最高的shRNA。(4)将沉默效率最高的ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:①空白对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照shRNA组;④缺氧+ROCK1-shRNA;⑤缺氧+ROCK2-shRNA组。缺氧结束后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况。(5)转染和缺氧处理后收获细胞,用Western Blotting检测Caspase3、p-PI3K和PI3K的表达情况,用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律,用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用MTS检测细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 (1)鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。(2)Western Blotting的结果显示,shRNA转染能有效抑制ROCK1和ROCK2基因的表达,其中ROCK1-shRNA1和ROCK2-shRNA2的沉默效率最高。(3).荧光显微镜发现,在转染了ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功。(4)缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(5)全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(6)MTS检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(7)流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(8)Western blotting检测发现,缺氧能导致Caspase3表达升高、p-PI3K表达降低,ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。PI3K表达无明显变化。结论 (1)ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA转染能有效沉默大鼠心肌细胞内ROCK1和ROCK2基因的表达。(2)ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞增殖减弱及凋亡增强的作用。(3)缺氧影响Caspase3和p-PI3K的表达是通过ROCK1和ROCK2介导的。(4)为心衰和冠心病等心血管疾病的治疗提供了一种新的可能途径。
目的许多研究表明,心肌细胞的凋亡与心衰和冠心病等心血管疾病关系密切。另外有研究表明,ROCK1(Rho-associated coiled-coil protein kinase-1)和ROCK2的表达下调可抑制某些细胞的凋亡。为此,我们将靶向ROCK1和ROCK2基因的shRNA转染大鼠心肌细胞,以沉默ROCK1和ROCK2的表达,探讨ROCK1和ROCK2在缺氧致心肌细胞凋亡中的作用。方法 (1)原代培养大鼠心肌细胞,并用抗α-横纹肌肌动蛋白免疫组化法进行鉴定。(2)构建并鉴定靶向大鼠ROCK1和ROCK2基因的重组质粒ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA各3个。(3)用脂质体转染法将ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后提取蛋白,用Western Blotting检测ROCK1和ROCK2蛋白的表达量,并筛选出沉默效率最高的shRNA。(4)将沉默效率最高的ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA瞬时转染心肌细胞,48 h后给予缺氧6 h处理。实验分为5组:①空白对照组;②缺氧组;③缺氧+阴性对照shRNA组;④缺氧+ROCK1-shRNA;⑤缺氧+ROCK2-shRNA组。缺氧结束后,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白报告基因表达情况。(5)转染和缺氧处理后收获细胞,用Western Blotting检测Caspase3、p-PI3K和PI3K的表达情况,用倒置显微镜观察心肌细胞搏动频率与节律,用全自动生化分析仪测定细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量,用MTS检测细胞存活率,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 (1)鉴定证实大鼠心肌细胞原代培养成功。(2)Western Blotting的结果显示,shRNA转染能有效抑制ROCK1和ROCK2基因的表达,其中ROCK1-shRNA1和ROCK2-shRNA2的沉默效率最高。(3).荧光显微镜发现,在转染了ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的细胞中观察到绿色荧光,即转染成功。(4)缺氧损伤后心肌细胞搏动频率较对照组明显减慢,搏动幅度减弱,节律不规整,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(5)全自动生化分析仪检测发现,缺氧能导致细胞培养液LDH含量升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(6)MTS检测发现,缺氧能导致心肌细胞存活率降低,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(7)流式细胞仪检测发现,缺氧能导致心肌细胞凋亡率升高,而ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。(8)Western blotting检测发现,缺氧能导致Caspase3表达升高、p-PI3K表达降低,ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA的转染能抑制缺氧导致的这一作用。PI3K表达无明显变化。结论 (1)ROCK1-shRNA和ROCK2-shRNA转染能有效沉默大鼠心肌细胞内ROCK1和ROCK2基因的表达。(2)ROCK1和ROCK2表达下调能抑制缺氧损伤导致的大鼠心肌细胞增殖减弱及凋亡增强的作用。(3)缺氧影响Caspase3和p-PI3K的表达是通过ROCK1和ROCK2介导的。(4)为心衰和冠心病等心血管疾病的治疗提供了一种新的可能途径。
出处
《岭南心血管病杂志》
2011年第S1期220-222,共3页
South China Journal of Cardiovascular Diseases
