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IBDV单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立
1
作者 姜艳平 刘薇 +6 位作者 宫浩阳 蔡李萌 李佳璇 崔文 周晗 韩建春 唐丽杰 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第7期3433-3441,共9页
旨在建立一种快速有效的检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的方法,本研究以IBDV全病毒作为免疫原制备单克隆抗体,以获得的单抗6G3作为捕获抗体,单抗4C12作为检测抗体,建立检测IBDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该ELISA方法具有良好的... 旨在建立一种快速有效的检测鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的方法,本研究以IBDV全病毒作为免疫原制备单克隆抗体,以获得的单抗6G3作为捕获抗体,单抗4C12作为检测抗体,建立检测IBDV的双抗体夹心ELISA方法。结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性,与REV、AEV、ALV和EDSV均无交叉反应;能检测病毒的最小量为1.585×10^(3) ELD50;批间和批内重复性试验显示,该方法具有良好的重复性;通过该方法对49份临床样品进行检测,与商品化的IBDV抗原检测卡进行比较,符合率达94.18%。综上,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于IBDV的快速检测,为制备商品化的IBDV检测试剂盒奠定基础。 展开更多
关键词 传染性法氏囊病毒 单克隆抗体 检测方法 双抗体夹心ELISA
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二氢杨梅素对雏鸡免疫功能的影响 被引量：1
2
作者 郝双双 曹传保 +7 位作者 巩颖超 樊夏楠 蒋欣茹 嵇正华 常轶聪 李睿 李昌文 刘芳萍 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2409-2417,共9页
【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%... 【目的】探究二氢杨梅素(DHM)对雏鸡免疫器官指数、免疫器官组织学形态及血清中免疫因子含量的影响。【方法】选取150只7日龄海兰白蛋雏鸡,雌雄各半,随机分为5组,每组30只,对照组给予基础饲粮,给药组分别在基础饲粮中添加0.025%、0.05%、0.1%、0.2%DHM。试验于给药7、14、21、28及35 d时,每组随机选取6只雏鸡心脏采血,收集免疫器官(胸腺、脾脏、法氏囊)分别称重,计算不同给药组雏鸡免疫器官指数,检测血清免疫球蛋白G(IgG)、补体(C3、C4)含量,并对给药35 d时雏鸡免疫器官进行HE染色观察组织形态。【结果】与对照组相比,0.2%DHM组在给药35 d时雏鸡胸腺指数显著升高(P<0.05),0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡脾脏指数均显著升高(P<0.05),0.1%、0.2%DHM组雏鸡法氏囊指数在给药7 d时显著增高(P<0.05)。饲粮中添加DHM后雏鸡免疫器官细胞排列整齐、淋巴细胞数量增多、结构更加致密。与对照组相比,0.05%、0.1%、0.2%DHM组在给药28和35 d时雏鸡血清IgG含量均显著增加(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清IgG含量在给药21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.1%、0.2%DHM组雏鸡血清中补体C3含量在不同给药时间均显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C3含量在给药14和28 d时显著高于其他组,在21和35 d时显著高于0.025%和0.05%DHM组(P<0.05)。与对照组相比,0.05%、0.1%和1.2%DHM组在14、28和35 d时雏鸡血清补体C4含量显著升高(P<0.05);各剂量组之间相比,0.2%DHM组雏鸡血清补体C4含量在给药14、21和28 d时显著高于其他组,在35 d时显著高于0.025%DHM组(P<0.05)。【结论】饲粮中添加0.2%DHM能促进雏鸡免疫器官生长发育,并且能提高雏鸡免疫因子的表达,增强雏鸡免疫功能。 展开更多
关键词 二氢杨梅素 免疫功能 雏鸡
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二氢杨梅素对蛋雏鸡生长性能的影响 被引量：1
3
作者 韩晓玺 曹传保 +5 位作者 巩颖超 樊夏楠 常轶聪 李睿 李昌文 刘芳萍 《动物医学进展》 北大核心 2024年第3期97-100,共4页
为研究二氢杨梅素(DHM)对蛋雏鸡生长性能的影响,选用7日龄海兰白蛋雏鸡150只随机分成5个组,每组30只。对照组给予基础日粮,给药组分别在基础日粮添加0.25、0.5、1、2 g/kg的DHM,试验期为35 d。结果显示,与对照组相比,42日龄时1 g/kg和2 ... 为研究二氢杨梅素(DHM)对蛋雏鸡生长性能的影响,选用7日龄海兰白蛋雏鸡150只随机分成5个组,每组30只。对照组给予基础日粮,给药组分别在基础日粮添加0.25、0.5、1、2 g/kg的DHM,试验期为35 d。结果显示,与对照组相比,42日龄时1 g/kg和2 g/kg的DHM组雏鸡平均体重显著增加(P<0.05);28和35日龄时0.5、1、2 g/kg DHM组平均日采食量显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01);35和42日龄时0.5、1、2 g/kg DHM组平均日增重显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01),肉料比显著增加(P<0.05);此外,DHM对雏鸡心脏指数、肝脏指数、肾脏指数和存活率均无明显影响。由此可见,DHM能够促进蛋雏鸡生长发育并对心脏、肝脏和肾脏无不良作用,可作为养禽业中一种绿色安全的饲料添加剂。 展开更多
关键词 二氢杨梅素 生长性能 蛋雏鸡 饲料添加剂
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鸡肠炎沙门菌毒力蛋白SipD生物信息学分析及原核表达
4
作者 原亮 韩晓玺 +7 位作者 巩颖超 樊夏楠 郝蓓莉 郝双双 李昌文 常轶聪 李睿 刘芳萍 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期2998-3007,共10页
【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白... 【目的】预测肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis, SE)SipD蛋白的潜在生物学功能,并表达纯化该蛋白,为探索SipD蛋白作为抗沙门菌纳米抗体的候选抗原提供理论依据。【方法】利用DNAStar软件对GenBank中公布的不同血清型沙门菌株SipD蛋白氨基酸序列进行相似性比对,并通过在线软件对SipD蛋白进行生物信息学分析。根据GenBank中SipD基因序列设计引物,以鸡肠炎沙门菌标准菌株(ATCC 13076)为模板,PCR扩增SipD基因,构建pET-32a(+)-SipD重组质粒,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。应用IPTG诱导重组SipD蛋白的表达,并利用Ni^(2+)亲和层析法纯化。应用SDS-PAGE和Western blotting检测SipD蛋白的表达情况。【结果】SipD蛋白在不同血清型沙门菌之间高度保守;SipD蛋白分子式为C_(1619)H_(2573)N_(441)O_(540)S_(8),无跨膜区,为膜外蛋白,不存在信号肽,该蛋白的第1~343位氨基酸具有来自超家族侵袭质粒抗原IpaD的保守结构域;SipD蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲占比分别为59.18%、6.41%、3.21%和31.20%;SipD蛋白与B细胞结合的抗原表位有12个。SipD基因长1 029 bp,在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中以可溶性蛋白的形式表达;经纯化、透析、浓缩后蛋白浓度为8.6 mg/mL。SDS-PAGE和Western blotting分析发现,SipD蛋白纯度较高,可用于免疫羊驼制备纳米抗体。【结论】SipD蛋白为膜外蛋白,具有较多抗原结合位点;经表达纯化得到纯度较高的SipD重组蛋白,为进一步制备靶向鸡肠炎沙门菌SipD蛋白的纳米抗体提供材料。 展开更多
关键词 鸡 肠炎沙门菌 SipD蛋白 生物信息学 原核表达
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猪流行性腹泻病毒RT-LAMP快速检测方法的建立及应用 被引量：9
5
作者 狄亚心 谭飞 +8 位作者 秦松跃 于晓丽 崔文 姜艳平 王丽 唐丽杰 周晗 王晓娜 乔薪瑗 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期832-837,共6页
为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度... 为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,本研究以PEDV N基因的保守序列为靶基因设计引物,优化并建立了基于RT-LAMP的PEDV快速检测方法。结果显示,RT-LAMP方法的最佳反应条件为:反应温度为61℃,反应时间为50 min,Mg2+和dNTPs浓度分别为8.0 mmol/L和4.0 mmol/L,外引物和内引物最佳浓度比为1.4。特异性试验结果显示,该方法只能检测出PEDV,对其他病原检测均为阴性,具有良好的特异性;敏感性试验结果显示,该方法能够检测出的最低RNA浓度为6.52×10^(-5)mg/L,而常规RT-PCR能检测到最低浓度为6.52×10-3mg/L,表明RT-LAMP敏感性是RT-PCR的100倍;重复性试验结果显示,批内和批间重复性试验结果无明显差异,重复性较好。利用RT-LAMP和RT-PCR方法分别对3份已知阳性样品,5份已知阴性样品以及52份未知临床样品进行检测。阳性样品经RT-LAMP和RT-PCR方法均检测到PEDV,阴性样品均未检测到PEDV。52份临床样品中,RT-LAMP对PEDV检测阳性率为23.08%(12/52);RT-PCR检测阳性率为17.31%(9/52),二者的符合率为94.23%。以上结果表明,建立的RT-LAMP方法具有成本低、检测快、灵敏度高、特异性强等优点。且结果易于判定、便于现场检测,在病原检测方面具有良好的应用前景,为该病的流行病学调查及综合防制提供重要的实验依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 RT-LAMP RT-PCR 诊断方法
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猫干扰素α基因的克隆及其表达产物的抗病毒活性分析 被引量：3
6
作者 李华 汉武娇 +4 位作者 范文禄 姜艳平 崔文 李一经 徐义刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期186-190,共5页
为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析。结果显... 为制备重组猫IFN-α并检测其抗病毒活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)感染结合poly I:C刺激实验猫后,提取猫脾淋巴细胞总RNA并反转录为cDNA,以其为模板经RT-PCR方法扩增获得了567 bp的猫IFN-α基因,测序后进行生物信息学分析。结果显示,猫IFN-α有21个潜在磷酸化位点、1个N-糖基化位点和8个O-糖基化位点,二级结构以α-螺旋为主。将该基因经BamH I/Kpn I酶切处理后克隆至pCold-TF载体,构建重组表达质粒pCold-α,将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞后获得了表达猫IFN-α的重组大肠杆菌pCold-α/BL21。重组菌经IPTG诱导后SDS-PAGE检测结果显示重组猫IFN-α蛋白获得高效表达,采用His标签蛋白纯化柱纯化后得到纯化蛋白浓度为340 mg/L。以VSV和猫冠状病毒(FCoV)为模式病毒,采用微量细胞病变抑制法检测了重组猫IFN-α的抗病毒效果,结果显示,其抗VSV活性为5.91×10^(5) IU/mg,抗FCoV活性可达6.25×10^(6) IU/mg,具有良好的抗病毒活性。本研究为猫干扰素的开发应用奠定了物质基础。 展开更多
关键词 猫干扰素α 基因克隆 可溶性表达 抗病毒活性
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不同组成型启动子对乳酸菌表达系统外源基因表达影响的比较 被引量：1
7
作者 袁世豪 张海琳 +9 位作者 鞠宁 王新乐 赵海渊 邵怡岚 李佳璇 姜艳平 崔文 唐丽杰 李一经 王晓娜 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4370-4380,共11页
【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,... 【目的】构建不同组成型启动子的乳酸菌表达载体系统,评价不同启动子驱动外源基因表达的活性,筛选出强表达的启动子,为后续研究乳酸菌作为活菌载体表达外源抗原或功能性蛋白提供理论依据。【方法】以大肠杆菌-乳酸菌穿梭载体pPG为骨架,将表达载体中启动子序列分别替换为组成型强启动子Pldh、PHH和Phce,利用PCR方法扩增报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和氨苄青霉素抗性基因(Ampr),并在下游多克隆位点中分别插入荧光素酶(LUC)、EGFP和Ampr报告基因,构建9种乳酸菌表达质粒,电转入副干酪乳杆菌HLJ-27感受态细胞,筛选获得9株重组乳酸菌。通过实时荧光定量PCR检测报告基因在重组菌中的mRNA转录水平,利用Western blotting和间接ELISA检测蛋白的表达量,并检测表达蛋白的活性,以评估3个启动子的活性强弱。【结果】PCR成功扩增出大小约720 bp的EGFP基因和850 bp的Ampr基因。Western blotting结果显示,在9株重组乳酸菌中,分别成功表达出了58 ku的LUC蛋白、26 ku的EGFP蛋白和28 ku的Ampr蛋白。实时荧光定量PCR和间接ELISA检测结果显示,启动子Pldh启动外源基因转录水平和驱动外源蛋白表达水平均显著高于启动子PHH和Phce(P<0.05;P<0.01)。报告基因检测结果显示,启动子Pldh驱动LUC、EGFP和Ampr外源蛋白的活性显著高于启动子PHH和Phce(P<0.05;P<0.01)。【结论】本研究成功构建了3种启动子报告基因表达系统,确定了3种启动子活性强弱依次为Pldh、PHH和Phce,探究出一种启动子活性筛选的优势筛选系统——Ampr报告系统,为高表达乳酸菌载体系统的建立提供了必要的依据。 展开更多
关键词 乳酸菌表达系统 组成型启动子 报告基因系统 外源蛋白表达
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猫白介素18基因的克隆、表达及其产物的生物学活性分析 被引量：1
8
作者 李华 汉武娇 +5 位作者 牛超 潘荣辉 姜艳平 崔文 李一经 徐义刚 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第6期612-616,共5页
白介素18(IL-18)可以诱导IFN-γ分泌,促进T、B淋巴细胞的增殖分化,具有良好的抗病毒活性。为探究猫IL-18的生物学活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)联合poly I:C共同刺激实验猫,采用常规方法分离猫脾淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法... 白介素18(IL-18)可以诱导IFN-γ分泌,促进T、B淋巴细胞的增殖分化,具有良好的抗病毒活性。为探究猫IL-18的生物学活性,本研究采用水泡性口炎病毒(VSV)联合poly I:C共同刺激实验猫,采用常规方法分离猫脾淋巴细胞,提取总RNA,经RT-PCR方法获得大小为579 bp的猫IL-18基因。构建了可溶性表达猫IL-18的重组大肠杆菌pCold-IL-18/BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析结果显示,重组菌表达了约70 ku的重组蛋白。重组蛋白经3C蛋白酶处理后并通过Ni柱亲和纯化,获得了可溶性表达的重组猫IL-18(rIL-18)。取BALB/c小鼠和猫的脾淋巴细胞,经不同浓度rIL-18刺激,采用MTT法检测rIL-18促进淋巴细胞增殖活性,结果显示可溶性表达的rIL-18能够有效地促进淋巴细胞增殖;采用细胞病变抑制法检测rIL-18协同干扰素的抗病毒效果,结果显示rIL-18联合临床用干扰素可显著增强抗病毒效果。本研究为治疗猫病毒性疾病奠定了物质基础。 展开更多
关键词 猫白介素18 可溶性表达 生物活性
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