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伪狂犬病病毒gB蛋白纯化及单克隆抗体的制备
1
作者 焦爽 李长尧 +2 位作者 张朝霞 翁长江 熊涛 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第4期190-196,共7页
本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对伪狂犬病病毒(PRV)gB基因中富含抗原表位区段进行融合表达及纯化,并将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠以制备单克隆抗体(mAb)。小鼠经3次免疫后,利用iELISA检测其血清中抗gB蛋白的抗体效价,并将抗体效价... 本研究利用昆虫杆状病毒表达系统对伪狂犬病病毒(PRV)gB基因中富含抗原表位区段进行融合表达及纯化,并将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠以制备单克隆抗体(mAb)。小鼠经3次免疫后,利用iELISA检测其血清中抗gB蛋白的抗体效价,并将抗体效价达到2×10~4以上的小鼠进行细胞融合。随后通过iELISA和IFA实验对阳性杂交瘤细胞进行筛选。经3~4次亚克隆筛选后,得到了1株可以稳定分泌gB mAb的杂交瘤细胞株293。同时,对其进行亚类鉴定发现该株细胞分泌的抗体类型为IgM型。本研究为建立新型ELISA检测试剂盒、新型疫苗的开发,以及后续中和抗体的研究提供了良好的生物材料。 展开更多
关键词 伪狂犬病病毒 GB基因 昆虫杆状病毒 单克隆抗体
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非洲猪瘟病毒E184L蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
2
作者 李雪雯 李婷婷 +4 位作者 李长尧 焦爽 郑君 荣俊 翁长江 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第3期130-136,共7页
本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)E184L蛋白(pE184L),并制备单克隆抗体(mAb),为其功能研究提供物质基础。首先,构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白,使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化,用纯化后的蛋白对小... 本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)E184L蛋白(pE184L),并制备单克隆抗体(mAb),为其功能研究提供物质基础。首先,构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白,使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化,用纯化后的蛋白对小鼠进行免疫,随后取阳性小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选出能稳定分泌pE184L mAb的杂交瘤细胞。Western blot结果显示,该抗体能够特异性识别过表达的外源pE184蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)表达的内源pE184蛋白。IFA结果表明该株mAb能特异性标记过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。Co-IP试验结果表明该株mAb能特异性结合过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。本研究成功表达并纯化了可溶性E184L蛋白,并制备了1株pE184L mAb,该mAb与pE184L蛋白具有良好的反应性,这为ASFV pE184L的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 ASFV E184L 原核表达 单克隆抗体
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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定
3
作者 林琪虹 李长尧 +2 位作者 张朝霞 宋厚辉 翁长江 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期179-184,共6页
为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb... 为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb亚类鉴定试剂盒检测结果显示3D5 MAb为IgM型。采用western blot检测制备的3D5 MAb与293T细胞中过表达的E2蛋白及CSFV感染猪肾细胞(PK-15细胞)后(感染后不同时间)天然表达E2蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测3D5 MAb与PK-15细胞中天然表达E2蛋白的反应性。Western blot结果显示,过表达E2蛋白的293T细胞和感染CSFV的PK-15细胞中(感染后12 h)均出现了40 ku左右的特异性条带。IFA结果显示,感染CSFV的PK-15细胞中出现红色荧光。以上结果表明,制备的3D5 MAb均能够与过表达的和天然表达的E2蛋白有较强的反应性。利用一系列表达截短的重组E2片段,通过western blot鉴定3D5 MAb识别的抗原表位,结果显示,E2蛋白氨基酸序列中的157REKPFPHRMD167为3D5 MAb的抗原表位。本研究首次制备了CSFV E2蛋白的MAb,并对其进行了表位鉴定,为进一步深入研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位的筛选及新疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒免疫调节基因的功能及其在病毒感染和致病中的作用 被引量：2
4
作者 翁长江 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第11期74-84,共11页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,ASFV强毒株感染家猪的发病率和致死率可达100%。由于没有安全有效的疫苗和药物,ASF疫情已经给世界养猪产业造成了巨大的经济损失。ASFV是一... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,ASFV强毒株感染家猪的发病率和致死率可达100%。由于没有安全有效的疫苗和药物,ASF疫情已经给世界养猪产业造成了巨大的经济损失。ASFV是一种有囊膜的双链DNA病毒,能够编码150~200种蛋白。ASFV编码的一些蛋白参与病毒入侵、基因组复制、DNA修复和病毒粒子组装;另外一些蛋白还执行免疫调节功能,在逃逸宿主抗病毒免疫反应中发挥着重要的作用,如调控NF-κB信号、干扰素(IFN)信号和炎症反应,调控细胞死亡和细胞自噬等。本综述将编码调控NF-κB信号、天然免疫反应、炎症反应、细胞死亡和细胞自噬等功能的ASFV蛋白的基因,统一称为ASFV免疫调节基因。大量研究证据表明,ASFV免疫调节基因与病毒的致病力密切相关。缺失一个或多个ASFV免疫调节基因的ASFV毒株毒力降低,用这些减毒毒株免疫猪可以抵抗ASFV强毒株的攻击。然而,ASFV免疫调节基因在ASFV感染和发病过程中如何发挥作用仍然未知。因此,本综述对ASFV免疫调节基因的功能及其在病毒感染和致病中的作用进行了总结,以期为研究ASFV感染、致病性和疫情防控提供重要的科技信息参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 免疫调节基因 减毒活疫苗 细胞凋亡 细胞自噬
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Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展
5
作者 薛梦迪 黄丽 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1014-1019,共6页
病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。 展开更多
关键词 病毒吸附 模式识别受体 病毒复制 复制过程 病原相关分子模式 第一道防线 病原微生物 流感病毒
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非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用 被引量：2
6
作者 刘晓红 刘宏扬 +4 位作者 叶光强 焦爽 宿志民 黄丽 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期922-929,共8页
非洲猪瘟病毒(ASFV)B318L是ASFV编码的晚期蛋白,具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用,本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L,经PCR和... 非洲猪瘟病毒(ASFV)B318L是ASFV编码的晚期蛋白,具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用,本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L,经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导并克隆至p GEX-6p-1载体中,采用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE检测该蛋白的表达,采用western blot鉴定重组蛋白的纯化效果和反应原性,采用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。结果显示,在约60 ku处出现特异性条带,且重组B318L蛋白(rB318L)主要以可溶性形式表达;纯化后在约60 ku处出现了单一特异性条带,经超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度为10 mg/m L。将纯化的r B318L 4次免疫小鼠并于3免后一周采血,采用western blot鉴定该多克隆抗体(pAb),经Protein G亲和层析介质纯化后采用SDS-PAGE进一步鉴定纯化效果,采用间接ELISA检测p Ab的效价。结果显示,制备的小鼠血清(pAb)在60 ku处出现特异性条带,其与原核表达的r B318L发生了反应;该p Ab包含重、轻链且纯度较好,且其效价可达1∶32000。将不同剂量的p CAGGS-HA-B318L(1μg、2μg、4μg)分别转染HEK293T细胞,24 h后收集细胞,将MOI 1的ASFV HLJ/18株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),并分别于感染后6 h、12 h、24 h收集细胞。上述细胞均经相应处理后分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)(pCAGGS-HA-B318L转染剂量为1μg)检测制备的p Ab的反应原性。Western blot结果显示,HEK293T细胞中出现约35 ku的特异性条带,并随转染质粒浓度的增加B318L蛋白表达量增多;ASFV感染24 h后的PAM在35 ku处出现特异性条带,其余时间点均无该条带。IFA结果显示,过表达B318L蛋白的HEK293T细胞中出现红色荧光;ASFV感染12 h后的PAM中出现红色荧光,24 h后PAM中红色荧光的量增加。将制备的B318L p Ab用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的B318L、ASFV感染PAM后内源表达的B318L,以及两种细胞中表达的B38L蛋白与p Ab、Protein A/G Magnetic beads三者结合物的反应性。结果显示,B318L p Ab可以检测到上述细胞中内源过表达和外源表达的B318L蛋白以及结合在beads上的B318L蛋白,均出现约35 ku的特异性条带。上述结果表明,B318L蛋白是ASFV晚期表达的蛋白,且制备并纯化的B318L p Ab反应原性较强,既可以与HEK293T细胞中过表达的B318L蛋白也可以与ASFV感染的PAM中内源表达的B318L蛋白反应,反应原性较强,且可以用于Co-IP试验检测细胞中表达的B318L蛋白,本研究为深入研究ASFV B318L的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 B318L蛋白 多克隆抗体
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猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及初步应用
7
作者 俞机敏 刘宏扬 +4 位作者 刘云飞 王尚辉 宋厚辉 张朝霞 翁长江 《中国预防兽医学报》 2025年第8期832-838,共7页
为制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gE糖蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV JM株gE蛋白主要抗原表位区域(aa52~aa238)的基因序列经密码子优化后由公司合成后克隆于pET-32a载体中构建重组表达质粒pET-32a-gE,经原核表达及纯化获得重组gE蛋白(rg... 为制备猪伪狂犬病病毒(PRV)gE糖蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究将PRV JM株gE蛋白主要抗原表位区域(aa52~aa238)的基因序列经密码子优化后由公司合成后克隆于pET-32a载体中构建重组表达质粒pET-32a-gE,经原核表达及纯化获得重组gE蛋白(rgE),采用SDS-PAGE鉴定rgE的表达及纯化效果,并经BCA法测定rgE的浓度。将其免疫BALB/c小鼠。取3次免疫小鼠的脾脏制备脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。通过ELISA筛选杂交瘤细胞株,经western blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定MAb的反应性,利用MAb亚类鉴定试剂盒检测其重链和轻链类型。以截短的gE合成多肽作为抗原,采用间接ELISA方法鉴定MAb识别的抗原表位,并利用MAb通过western blot和IFA鉴定PRV野毒株JM及gE基因缺失株PRV JMΔgE/TK中gE蛋白的表达水平。结果显示,经间接ELISA方法筛选到1株稳定分泌gE蛋白的单克隆细胞株,命名为4C6B。Western blot和IFA均表明本研究筛选的MAb能够特异性识别PRV感染PK-15细胞中表达的gE蛋白;亚类鉴定结果显示MAb重链为IgM型,轻链为κ链。间接ELISA结果显示MAb能够识别gE蛋白中的一个线性B细胞表位131ACHPDLVLGRACVPEAPEMG^(150)。利用制备的MAb腹水进行PRV野毒和gE基因缺失株的鉴定,结果显示该MAb能够有效鉴别PRV JM野毒株与gE缺失株。本研究制备的PRV gE蛋白的4C6B MAb可以用于特异性鉴别PRV JM野毒株和gE基因缺失株,同时也可以为PRV检测方法的建立、PRV基因缺失疫苗的构建以及gE蛋白的生物学功能研究提供生物材料。 展开更多
关键词 猪伪狂犬病病毒 单克隆抗体 gE蛋白 表位鉴定
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基于非靶向代谢组学探究口服唾液乳杆菌对白羽肉种鸡体重及肠道代谢的影响
8
作者 刘钰锟 胡馨匀 +7 位作者 张艳萍 祁小乐 刘永振 王素艳 陈运通 段雨路 高玉龙 崔红玉 《中国家禽》 2025年第11期27-41,共15页
为探究口服唾液乳杆菌XP132对肉种鸡体重、器官指数及肠道代谢的影响,试验采用液相色谱质谱(LC-MS)非靶向代谢组学技术,以12只肉种鸡为研究对象(试验组与对照组各6只),通过分析肉鸡表型数据、肠道代谢物的变化、关键代谢通路调控及其生... 为探究口服唾液乳杆菌XP132对肉种鸡体重、器官指数及肠道代谢的影响,试验采用液相色谱质谱(LC-MS)非靶向代谢组学技术,以12只肉种鸡为研究对象(试验组与对照组各6只),通过分析肉鸡表型数据、肠道代谢物的变化、关键代谢通路调控及其生物学功能,系统阐明该菌株对肉鸡体重及肠道代谢的整体调控作用。结果显示:连续口服唾液乳杆菌XP1324周后,与对照组相比,试验组肉鸡体重显著增加(P<0.05),而肝脏指数和脾脏指数组间无显著差异(P>0.05);空肠和回肠分别鉴定到582和596个差异代谢物(试验组vs对照组);试验组中显著上调的代谢物以氨基酸类和有机酸类为主(FC>2,P<0.05),显著下调的代谢物以脂类为主(FC<0.5,P<0.05);其中L-天冬氨酸、L-缬氨酸、琥珀酸、胆碱、肌酸、黄嘌呤、牛磺鹅去氧胆酸、半胱氨酸-S-硫酸盐8种显著差异代谢物与肉鸡体重变化呈极强相关(Spearman秩相关系数|r|>0.8);空肠差异代谢物显著富集于26条通路,以氨酰-tRNA生物合成(15条)、ABC转运蛋白(11条)和β-丙氨酸代谢(8条)通路最显著(P<0.05);回肠差异代谢物显著富集于22条通路,其中氨酰-tRNA生物合成(5条)和精氨酸合成(5条)通路最显著(P<0.05)。研究表明:肉鸡口服唾液乳杆菌XP132后可显著增加其体重并与肠道代谢物的变化形成功能上的呼应,唾液乳杆菌XP132可通过上调空肠氨酰-tRNA生物合成通路促进氨基酸积累,增强蛋白质合成效率;激活β-丙氨酸代谢并优化脂质转运,提升脂类代谢和能量利用效率;同时调节精氨酸生物合成通路并减少促炎胆汁酸代谢物,改善免疫功能和肠道健康。 展开更多
关键词 唾液乳杆菌 代谢组学 白羽肉种鸡 体重 肠道代谢物
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