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猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及抗原表位的鉴定
1
作者 林琪虹 李长尧 +2 位作者 张朝霞 宋厚辉 翁长江 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第2期179-184,共6页
为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb... 为制备猪瘟病毒(CSFV)鼠源E2蛋白单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究通过昆虫细胞杆状病毒表达系统表达并纯化了重组E2蛋白(rE2),将其免疫BALB/c小鼠后通过间接ELISA方法筛选到1株能够稳定分泌E2蛋白MAb的杂交瘤细胞株3D5。经MAb亚类鉴定试剂盒检测结果显示3D5 MAb为IgM型。采用western blot检测制备的3D5 MAb与293T细胞中过表达的E2蛋白及CSFV感染猪肾细胞(PK-15细胞)后(感染后不同时间)天然表达E2蛋白的反应性;采用间接免疫荧光试验(IFA)检测3D5 MAb与PK-15细胞中天然表达E2蛋白的反应性。Western blot结果显示,过表达E2蛋白的293T细胞和感染CSFV的PK-15细胞中(感染后12 h)均出现了40 ku左右的特异性条带。IFA结果显示,感染CSFV的PK-15细胞中出现红色荧光。以上结果表明,制备的3D5 MAb均能够与过表达的和天然表达的E2蛋白有较强的反应性。利用一系列表达截短的重组E2片段,通过western blot鉴定3D5 MAb识别的抗原表位,结果显示,E2蛋白氨基酸序列中的157REKPFPHRMD167为3D5 MAb的抗原表位。本研究首次制备了CSFV E2蛋白的MAb,并对其进行了表位鉴定,为进一步深入研究CSFV E2蛋白的结构、功能、抗原表位的筛选及新疫苗的研制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 E2蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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非洲猪瘟病毒免疫调节基因的功能及其在病毒感染和致病中的作用 被引量：2
2
作者 翁长江 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2023年第11期74-84,共11页
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,ASFV强毒株感染家猪的发病率和致死率可达100%。由于没有安全有效的疫苗和药物,ASF疫情已经给世界养猪产业造成了巨大的经济损失。ASFV是一... 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病,ASFV强毒株感染家猪的发病率和致死率可达100%。由于没有安全有效的疫苗和药物,ASF疫情已经给世界养猪产业造成了巨大的经济损失。ASFV是一种有囊膜的双链DNA病毒,能够编码150~200种蛋白。ASFV编码的一些蛋白参与病毒入侵、基因组复制、DNA修复和病毒粒子组装;另外一些蛋白还执行免疫调节功能,在逃逸宿主抗病毒免疫反应中发挥着重要的作用,如调控NF-κB信号、干扰素(IFN)信号和炎症反应,调控细胞死亡和细胞自噬等。本综述将编码调控NF-κB信号、天然免疫反应、炎症反应、细胞死亡和细胞自噬等功能的ASFV蛋白的基因,统一称为ASFV免疫调节基因。大量研究证据表明,ASFV免疫调节基因与病毒的致病力密切相关。缺失一个或多个ASFV免疫调节基因的ASFV毒株毒力降低,用这些减毒毒株免疫猪可以抵抗ASFV强毒株的攻击。然而,ASFV免疫调节基因在ASFV感染和发病过程中如何发挥作用仍然未知。因此,本综述对ASFV免疫调节基因的功能及其在病毒感染和致病中的作用进行了总结,以期为研究ASFV感染、致病性和疫情防控提供重要的科技信息参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟 免疫调节基因 减毒活疫苗 细胞凋亡 细胞自噬
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Annexin蛋白家族调控病毒复制和抗病毒天然免疫反应的研究进展
3
作者 薛梦迪 黄丽 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期1014-1019,共6页
病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和... 病毒复制一般包括吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放5个阶段,Annexin蛋白能够与流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等病毒编码的蛋白相互作用进而影响病毒吸附、穿入及脱壳等复制过程。天然免疫是机体针对各种病原微生物和异物的侵袭而介导抗病毒免疫反应的第一道防线,其激活依赖于模式识别受体(Pattern-recognition receptors,PRRs)识别病原体保守的分子结构称病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),以激活下游相关信号通路,发挥抵御病原体侵入的功能。 展开更多
关键词 病毒吸附 模式识别受体 病毒复制 复制过程 病原相关分子模式 第一道防线 病原微生物 流感病毒
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A型塞内卡病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA检测方法的建立 被引量：1
4
作者 周函蓉 苏世博 +8 位作者 孙明霞 蒙靓 杨巍 史鑫琪 李鑫 安同庆 蔡雪辉 王海伟 孟凡丹 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1034-1042,共9页
为建立一种快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,本研究利用氯化铯密度梯度离心法纯化的SVA粒子免疫BALB/c小鼠3次,采用杂交瘤技术制备SVA单克隆抗体(MAb)。结果显示,共获得7株能够稳定分泌SVA MAb的杂交瘤细胞株。采用过碘酸钠法将其中5... 为建立一种快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,本研究利用氯化铯密度梯度离心法纯化的SVA粒子免疫BALB/c小鼠3次,采用杂交瘤技术制备SVA单克隆抗体(MAb)。结果显示,共获得7株能够稳定分泌SVA MAb的杂交瘤细胞株。采用过碘酸钠法将其中5株MAb标记HRP(MAb-HRP),并采用ELISA法检测标记效果。将7株MAb与5株MAb-HRP两两组合进行抗体配对试验。结果显示,5株MAb均标记上HRP,且其中各稀释度标记的MAb 2C8-HRP的反应性均最强;当MAb 2G7作为捕获抗体,MAb 2C8-HRP作为检测抗体时,P/N值最大,表明这两种MAb的配对效果最好。在此基础上,通过优化各反应条件初步建立检测SVA的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法。利用建立的DAS-ELISA方法检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、O型和A型口蹄疫病毒和SVA,结果显示,该方法仅能检测SVA,其他常见的猪源病毒均为阴性结果,表明该方法特异性强。利用本研究建立的DAS-ELISA方法分别检测系列稀释的SVA上清液(1~1:80000,对应的病毒滴度分别为107.5TCID50/mL~1.25×10^(2.5)TCID_(50)/mL)和2倍倍比稀释的SVA猪阳性猪血清(1:2~1:256),同时采用猪塞内卡病毒抗原(SVA-Ag)ELISA试剂盒分别检测上述SVA上清液和SVA猪阳性血清,评估本研究建立DAS-ELISA方法的敏感性。结果显示SVA稀释40000倍后,其OD450nm值仍大于临界值0.115,即该方法对SVA上清液的检测限为2.5×10^(2.5)TCID_(50)/mL,且1:64倍稀释的SVA猪阳性血清样品仍为阳性;(SVA-Ag)ELISA结果显示,该方法检测的SVA最大稀释度为1:20000,即对SVA上清液的检测限为5×10^(2.5)TCID_(50)/mL,且仅能检测到稀释至32倍的SVA猪阳性血清,均低于本实验建立的DAS-ELISA方法,表明该方法敏感性高。对4份SVA猪阳性血清和1份SVA猪阴性血清采用DAS-ELISA方法进行批内和批间重复性试验,结果显示批间和批内重复性试验的变异系数均在10%以下,重复性较好。对采集的205份疑似SVA感染的猪扁桃体组织、鼻咽拭子及血清样品分别采用DAS-ELISA及RT-PCR方法检测。DAS-ELISA的检测结果显示,36份样品为阳性,169份样品为阴性;RT-PCR检测结果显示,50份样品为阳性,155份样品为阴性。经计算两种方法的阳性符合率为72%(36/50),总符合率为93%(191/205)。以上结果表明,本研究建立的DAS-ELISA适用于大规模多种临床样品的检测,为SVA的检测及流行病学调查提供技术支撑。 展开更多
关键词 A型塞内卡病毒 单克隆抗体 双抗体夹心ELISA方法
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H240R和MGF505-7R基因缺失非洲猪瘟病毒的构建及其生长特性的初步研究 被引量：2
5
作者 周仕君 宋洁 +3 位作者 李帅 刘佳 李江南 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期423-428,共6页
为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mch... 为探究H240R和MGF505-7R基因对非洲猪瘟病毒(ASFV)复制水平的影响,本研究采用PCR扩增ASFV HLJ/18株H240R基因和MGF505-7R基因阅读框前后各1000 bp的同源臂,分别克隆至pBS-EGFP及pBS-Mcherry载体中,构建同源臂质粒pBS-GFP-H240R和pBS-Mcherry-MGF505-7R,采用PCR和测序鉴定正确。根据CRISPR/Cas9系统sgRNA设计原则设计分别靶向H240R和MGF505-7R基因的小向导RNA(sgRNA),并克隆至pX330载体中,构建重组质粒pX330-sgH240R和pX330-sgMGF505-7R,经测序鉴定正确后,将线性化的同源臂质粒pBS-GFP-H240R与pX330-sgH240R共转染猪肺泡巨噬细胞(PAM),再以ASFV感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建H240R基因缺失病毒ASFV-ΔH240R;采用上述类似的方式构建MGF505-7R基因缺失病毒ASFV-Δ7R;在ASFV-ΔH240R的基础上,将线性化的同源臂质粒pBS-Mcherry-MGF505-7R与pX330-sgMGF505-7R共转染PAM后,再以ASFV-ΔH240R感染,通过观察荧光并采用噬斑筛选纯化,构建双基因缺失病毒ASFV-ΔH240R-Δ7R。上述3株基因缺失病毒均采用PCR和测序鉴定正确后,均以MOI 1感染PAM,24 h后于荧光显微镜观察;同时采用红细胞吸附试验测定不同培养时间的病毒载量即半数红细胞吸附量(HAD50),并绘制各病毒的生长曲线。结果显示,ASFV-ΔH240R、ASFV-Δ7R及ASFV-ΔH240R-Δ7R感染的PAM分别出现绿色荧光、红色荧光及红绿色双色荧光,而ASFV-WT感染的细胞无荧光,表明正确构建各基因缺失病毒。生长曲线测定结果显示,ASFV-Δ7R和亲本病毒生长曲线基本一致,ASFV-ΔH240R复制水平显著低于亲本病毒(P<0.001),ASFV-ΔH240R-Δ7R复制水平显著高于ASFV-ΔH240R(P<0.01),但仍低于亲本株。表明MGF505-7R基因与病毒的复制无关,但H240R基因与病毒的复制有关,在ASFV-ΔH240R的基础上缺失MGF505-7R基因则可部分恢复病毒的复制能力。本研究构建了3株基因缺失ASFV并测定其生长曲线,为进一步研究ASFV基因功能提供了数据参考。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 H240R MGF5050-7R 基因缺失病毒
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猪源GSDMA蛋白多克隆抗体的制备与初步应用 被引量：1
6
作者 李帅 宋洁 +3 位作者 周仕君 刘佳 李江南 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第12期1311-1316,1331,共7页
Gasdermin A(GSDMA)作为Gasdermin(GSDM)蛋白家族的一员,参与细胞的炎症反应,其经切割产生的片段可以诱导细胞焦亡。为制备猪GSDMA(pGSDMA)多克隆抗体,本研究构建了重组表达质粒pET-21apGSDMA,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导,表... Gasdermin A(GSDMA)作为Gasdermin(GSDM)蛋白家族的一员,参与细胞的炎症反应,其经切割产生的片段可以诱导细胞焦亡。为制备猪GSDMA(pGSDMA)多克隆抗体,本研究构建了重组表达质粒pET-21apGSDMA,转化BL21(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导,表达并纯化了重组pGSDMA蛋白。将纯化的该重组蛋白免疫小鼠制备pGSDMA多克隆抗体(pAb),并进行western blot和间接免疫荧光试验鉴定。结果显示,pGSDMA pAb能够特异性地识别外源表达的pGSDMA蛋白和猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中内源表达的pGSDMA蛋白。利用该pAb检测猪主要组织器官中pGSDMA蛋白的表达,结果显示其能识别猪不同组织器官中的pGSDMA蛋白,且pGSDMA在猪心脏中的表达量最低,在肝、脾、肺和肾中的表达量较高。利用该pAb检测不同剂量高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染PAMs中p GSDMA的表达,结果显示pGSDMA蛋白的表达量随着病毒感染剂量的增加而降低,表明pGSDMA在HP-PRRSV感染过程中发挥相关生物学作用。本研究首次制备了pGSDMA pAb,为深入探究pGSDMA生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 GSDMA 原核表达 多克隆抗体 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒
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非洲猪瘟病毒B318L蛋白的多克隆抗体的制备及应用 被引量：2
7
作者 刘晓红 刘宏扬 +4 位作者 叶光强 焦爽 宿志民 黄丽 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第9期922-929,共8页
非洲猪瘟病毒(ASFV)B318L是ASFV编码的晚期蛋白,具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用,本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L,经PCR和... 非洲猪瘟病毒(ASFV)B318L是ASFV编码的晚期蛋白,具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用,本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L,经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导并克隆至p GEX-6p-1载体中,采用GST亲和层析柱纯化重组蛋白,利用SDS-PAGE检测该蛋白的表达,采用western blot鉴定重组蛋白的纯化效果和反应原性,采用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。结果显示,在约60 ku处出现特异性条带,且重组B318L蛋白(rB318L)主要以可溶性形式表达;纯化后在约60 ku处出现了单一特异性条带,经超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度为10 mg/m L。将纯化的r B318L 4次免疫小鼠并于3免后一周采血,采用western blot鉴定该多克隆抗体(pAb),经Protein G亲和层析介质纯化后采用SDS-PAGE进一步鉴定纯化效果,采用间接ELISA检测p Ab的效价。结果显示,制备的小鼠血清(pAb)在60 ku处出现特异性条带,其与原核表达的r B318L发生了反应;该p Ab包含重、轻链且纯度较好,且其效价可达1∶32000。将不同剂量的p CAGGS-HA-B318L(1μg、2μg、4μg)分别转染HEK293T细胞,24 h后收集细胞,将MOI 1的ASFV HLJ/18株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),并分别于感染后6 h、12 h、24 h收集细胞。上述细胞均经相应处理后分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)(pCAGGS-HA-B318L转染剂量为1μg)检测制备的p Ab的反应原性。Western blot结果显示,HEK293T细胞中出现约35 ku的特异性条带,并随转染质粒浓度的增加B318L蛋白表达量增多;ASFV感染24 h后的PAM在35 ku处出现特异性条带,其余时间点均无该条带。IFA结果显示,过表达B318L蛋白的HEK293T细胞中出现红色荧光;ASFV感染12 h后的PAM中出现红色荧光,24 h后PAM中红色荧光的量增加。将制备的B318L p Ab用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的B318L、ASFV感染PAM后内源表达的B318L,以及两种细胞中表达的B38L蛋白与p Ab、Protein A/G Magnetic beads三者结合物的反应性。结果显示,B318L p Ab可以检测到上述细胞中内源过表达和外源表达的B318L蛋白以及结合在beads上的B318L蛋白,均出现约35 ku的特异性条带。上述结果表明,B318L蛋白是ASFV晚期表达的蛋白,且制备并纯化的B318L p Ab反应原性较强,既可以与HEK293T细胞中过表达的B318L蛋白也可以与ASFV感染的PAM中内源表达的B318L蛋白反应,反应原性较强,且可以用于Co-IP试验检测细胞中表达的B318L蛋白,本研究为深入研究ASFV B318L的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 B318L蛋白 多克隆抗体
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一种检测蛋白酶活性的荧光素酶报告基因系统的构建及应用
8
作者 周仕君 宋洁 +3 位作者 李帅 刘佳 李江南 翁长江 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期535-539,共5页
为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该... 为建立一种检测蛋白酶活性的方法,本研究将IL-1β前体基因和荧光素酶基因融合,克隆至p CAGGS真核载体,构建了基于荧光素酶的报告基因系统(iGLuc),同时构建GLuc真核表达质粒作为对照。以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶为检测对象,利用该报告基因系统对病毒蛋白酶活性进行检测,将iGLuc中蛋白酶酶切位点(FVCDAN)相对应的基因序列替换为Kpn I酶切位点,构建重组质粒Kpn I-iGLuc,然后分别将PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶切割位点对应的核酸序列插入至报告基因Kpn I-iGLuc中的Kpn I位点,构建重组质粒nsp4-iGLuc和S273R-i GLuc。分别将报告基因质粒(iGLuc、GLuc、Kpn I-i GLuc、nsp4-i GLuc和S273R-iGLuc)与不同剂量的相应蛋白酶真核表达质粒共转染HEK293T细胞,24 h后检测上清中荧光素酶GLuc的活性。结果显示,转染i GLuc、nsp4-iGLuc或S273R-iGLuc质粒的上清中荧光信号随着相应蛋白酶的剂量增加而升高,呈现剂量依赖性,而缺失蛋白酶切位点的对照质粒无该现象,表明构建的荧光素酶报告基因能够特异性地检测细胞蛋白酶和病毒蛋白酶的活性。本研究首次建立了一种检测蛋白酶活性的方法,并以PRRSV nsp4和ASFV S273R蛋白酶验证了该方法的应用价值,为后续开展高通量化筛选抗PRRSV、ASFV等药物的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 蛋白酶活性 荧光素酶报告基因 病毒蛋白酶 检测方法
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非洲猪瘟病毒E184L蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备
9
作者 李雪雯 李婷婷 +4 位作者 李长尧 焦爽 郑君 荣俊 翁长江 《中国动物传染病学报》 2025年第3期130-136,共7页
本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)E184L蛋白(pE184L),并制备单克隆抗体(mAb),为其功能研究提供物质基础。首先,构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白,使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化,用纯化后的蛋白对小... 本研究旨在表达非洲猪瘟病毒(ASFV)E184L蛋白(pE184L),并制备单克隆抗体(mAb),为其功能研究提供物质基础。首先,构建出了原核表达质粒pET21a-E184L并表达重组pE184L-His蛋白,使用镍亲和层析的方法对pE184L进行纯化,用纯化后的蛋白对小鼠进行免疫,随后取阳性小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA方法筛选出能稳定分泌pE184L mAb的杂交瘤细胞。Western blot结果显示,该抗体能够特异性识别过表达的外源pE184蛋白以及ASFV感染猪肺泡巨噬细胞(PAMs)表达的内源pE184蛋白。IFA结果表明该株mAb能特异性标记过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。Co-IP试验结果表明该株mAb能特异性结合过表达的pE184L蛋白及在ASFV感染的PAMs细胞中表达的内源pE184L蛋白。本研究成功表达并纯化了可溶性E184L蛋白,并制备了1株pE184L mAb,该mAb与pE184L蛋白具有良好的反应性,这为ASFV pE184L的生物学功能研究奠定了基础。 展开更多
关键词 ASFV E184L 原核表达 单克隆抗体
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