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89株副猪嗜血杆菌临床分离株血清型、基因型鉴定与分析 被引量：12
1
作者 王迪 陈章 +6 位作者 邢刚 何长生 刘晓露 魏建忠 孙裴 刘雪兰 李郁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期2802-2811,共10页
旨在明确副猪嗜血杆菌(HPS)临床分离株分离部位的组织分布,进而探讨其血清型和基因型的流行分布特点及相关性,为猪格氏病(Glässer’s disease)的有效防控提供科学依据。针对临床分离鉴定的89株HPS,利用PCR技术鉴定血清型,统计各血... 旨在明确副猪嗜血杆菌(HPS)临床分离株分离部位的组织分布,进而探讨其血清型和基因型的流行分布特点及相关性,为猪格氏病(Glässer’s disease)的有效防控提供科学依据。针对临床分离鉴定的89株HPS,利用PCR技术鉴定血清型,统计各血清型HPS在不同分离部位的菌株分布数量;应用多位点序列分型(MLST)方法进行序列类型(ST)鉴定分析、位点多态性分析、BURST分群统计和UPGMA系统发育树聚类分析。89株HPS临床分离株共鉴定出9种血清型(1、2、4、5、7、11、12、13、14)以及未定型(NT),血清4、13、7和5型为优势血清型,分别占比28.09%、22.47%、13.48%和10.11%,有64株HPS分离于肺,占比71.91%;24种ST型,ST267、ST268、ST387和ST365为优势基因型,分别占比26.97%、21.35%、8.99%和5.62%,每个基因位点存在3~13个等位基因,多态性位点从3(g3pd)到71(6pgd)不等,BURST分析中划分为2个单个ST型和11个克隆群(CC),UPGMA系统发育树被分为4个分支,优势ST型处于2、3、4三个分支中,均对应具有毒力血清型的HPS分离株。HPS临床分离株流行血清型和基因型呈现多元化,具有明显的遗传异质性,同时,ST型与血清型存在一定的交叉性,且与HPS临床致病力相关。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌 分离株 血清型 基因型
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猪链球菌三价灭活苗的制备及对小鼠免疫效果的评价 被引量：5
2
作者 崔丽荣 王嘉珍 +6 位作者 李亮 何长生 邢刚 刘雪兰 孙裴 魏建忠 李郁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期169-178,共10页
为制备猪链球菌(SS)三价灭活苗并评价其对小鼠的免疫效果,本研究利用筛选出的3株SS菌株(代号/血清型分别为HF2/SS2、BB15-4/SS3、HBgu18-4/SS4)作为疫苗株,甲醛为灭活剂、ISA 201VG矿物油为佐剂制备灭活前分别为1.0×10^(9)cfu/mL、... 为制备猪链球菌(SS)三价灭活苗并评价其对小鼠的免疫效果,本研究利用筛选出的3株SS菌株(代号/血清型分别为HF2/SS2、BB15-4/SS3、HBgu18-4/SS4)作为疫苗株,甲醛为灭活剂、ISA 201VG矿物油为佐剂制备灭活前分别为1.0×10^(9)cfu/mL、2.0×10^(9)cfu/mL、4.0×10^(9)cfu/mL 3种活菌浓度的SS三价灭活苗,分别命名为V-a、V-b和V-c。以昆明鼠为实验动物模型,将V-a、V-b、V-c、商用疫苗均以0.2 mL/只的剂量采取颈背部皮下多点注射的方式依次免疫A~D组小鼠后进行以下免疫效果评价:采集首免后14 d与二免后7 d的小鼠血清,每组3只,通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清中IgG抗体效价;以血清杀菌试验检测血清中功能性抗体水平。血清中IgG抗体检测结果显示,在各个免疫阶段,A~D组小鼠的IgG抗体含量始终保持相同水平且均显著高于阴性对照组(P<0.05),二免后7 d,A~D组小鼠的IgG抗体水平显著上升,抗体效价均为1:12800;血清杀菌试验结果显示,二免后7 d,A~D组均能诱导小鼠血清中功能性抗体水平持续升高且无显著差异(P>0.05),具有高度杀菌活性。利用噻唑蓝溴化四唑溶液(MTT)测定小鼠脾淋巴细胞增殖指数(SI);采用双抗夹心ELISA方法检测小鼠血清相关细胞因子含量(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1);利用流式细胞术测定CD4^(+)与CD8^(+)外周血T淋巴细胞亚群的百分比。结果显示,二免后7 d,A~D组均能刺激小鼠血清中相关细胞因子水平、SI及CD4^(+)与CD8^(+)外周血T细胞亚群百分比持续上升且均显著高于阴性对照组(P<0.05)。二免7 d后,均以BZ1、BB15-4和HBgu18-4菌株攻毒各免疫组和攻毒对照组小鼠,阴性对照组接种等体积灭菌生理盐水,每组15只,观察7 d,计算小鼠死亡率;在小鼠攻毒3 d、7 d后,采用平板计数法测定攻毒菌株在小鼠体内的定植情况;并于攻毒7 d后取各组小鼠的肺、肝、脾、肾脏制作组织病理切片,观察各组织病理变化。结果显示,腹腔攻毒后7 d,A~D组及攻毒对照组小鼠免疫保护率依次为86.67%、100%、100%、80%和0;A~C免疫组小鼠各脏器的细菌定植量均显著降低且低于免疫组D(P<0.05);与D组相比,A~C组小鼠各器官病理变化均较为轻微。本研究结果表明,V-a、V-b和V-c免疫小鼠后均能产生良好的体液免疫和细胞免疫反应,其中V-b和V-c的免疫效力最优,均可有效抵抗SS2、SS3、SS4强毒株的攻击,可作为SS三价(血清2、3、4型)灭活苗的候选疫苗。本研究首次制备了新型SS三价灭活苗,并初步进行了免疫效果评价,为SS疫苗研发提供技术储备。 展开更多
关键词 猪链球菌 三价灭活苗(血清2、3、4型) 免疫效果 昆明鼠
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猪丹毒丝菌CbpB蛋白对小鼠的免疫效果分析 被引量：2
3
作者 刘君雯 吴琼娟 +5 位作者 邢刚 占松鹤 魏建忠 孙裴 刘雪兰 李郁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第6期1689-1699,共11页
探究猪丹毒丝菌(ER)CbpB蛋白的免疫原性和保护作用,为深入研制ER基因工程亚单位疫苗提供新的思路和技术储备。以表达的ER重组蛋白CbpB、SpaA、CbpB+SpaA以及ER灭活全菌体(V-AEr21)、商品化弱毒疫苗、商品化灭活疫苗分别免疫小鼠。利用间... 探究猪丹毒丝菌(ER)CbpB蛋白的免疫原性和保护作用,为深入研制ER基因工程亚单位疫苗提供新的思路和技术储备。以表达的ER重组蛋白CbpB、SpaA、CbpB+SpaA以及ER灭活全菌体(V-AEr21)、商品化弱毒疫苗、商品化灭活疫苗分别免疫小鼠。利用间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体,血清杀菌试验测定功能性抗体水平,攻毒试验测定免疫保护率,组织荷菌数试验测定ER定植情况,并采集小鼠组织脏器(脾、肺、肝、肾)制备切片,观察病理变化。结果显示:与免疫原性最优的商品化弱毒疫苗相比,CbpB和SpaA虽产生的IgG抗体均仅为1∶6400,但血清杀菌效果强;对小鼠的免疫攻毒保护率与商品化弱毒疫苗相同,均为100%,且在脾、肺、肝、肾组织中均无细菌定植,病理组织学观察与空白对照无明显区别。CbpB重组蛋白具有良好的免疫原性和保护作用,能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,可以作为猪丹毒基因工程亚单位疫苗的候选抗原。 展开更多
关键词 猪丹毒丝菌 CbpB蛋白 小鼠 免疫原性 免疫保护力
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猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用 被引量：2
4
作者 刘君雯 王迪 +7 位作者 朱艳艳 邢刚 占松鹤 刘晓露 魏建忠 孙裴 刘雪兰 李郁 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第5期816-824,共9页
利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法。克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-... 利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法。克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物。以纯化重组CbpB蛋白作为包被抗原,通过一系列反应条件优化,建立检测ER抗体的间接ELISA方法(CbpB-ELISA),并用于临床猪血清样品检测。建立该方法的最适条件:包被抗原浓度为1.0μg·mL^(-1),4℃过夜;5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:100,37℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1∶1000,37℃作用45 min;显色时间为37℃作用10 min。该方法可特异性地检测ER抗体,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应性;阳性血清稀释至1:12800时仍可检出;批内及批间变异系数均小于10.00%;与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western-blot比较,该方法总符合率分别为91.67%、93.33%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为92.45%、94.55%、88.89%、90.91%,阴性符合率分别为85.71%、80.00%、66.67%、80.00%。对进行和未进行ER免疫的猪血清样品检测,免疫抗体阳性率为86.67%,感染抗体阳性率为30.50%。该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为ER的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。 展开更多
关键词 猪丹毒丝菌 胆碱结合蛋白B 间接ELISA 抗体检测
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副猪嗜血杆菌病四价灭活苗的制备及对豚鼠的免疫效果评价 被引量：2
5
作者 程家园 王迪 +6 位作者 李亮 占松鹤 邢刚 刘雪兰 孙裴 魏建忠 李郁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第10期1091-1098,共8页
为了对一种新型副猪嗜血杆菌病(又称猪革拉瑟氏病,Gl?sser’s disease)四价灭活疫苗的研发提供技术储备,本研究利用筛选的4株副猪嗜血杆菌(HPS)(血清4、5、7和13型,编号分别为AT-2、SX-1P、HF-1P和HQ-2)作为疫苗菌株,经甲醛灭活后,配比I... 为了对一种新型副猪嗜血杆菌病(又称猪革拉瑟氏病,Gl?sser’s disease)四价灭活疫苗的研发提供技术储备,本研究利用筛选的4株副猪嗜血杆菌(HPS)(血清4、5、7和13型,编号分别为AT-2、SX-1P、HF-1P和HQ-2)作为疫苗菌株,经甲醛灭活后,配比ISA 201 VG双向油乳佐剂,制成灭活前活菌分别为1.0×10~9cfu/mL、2.0×10~9cfu/mL、4.0×10~9cfu/mL的四价灭活苗,依次命名为V-1、V-2和V-3。以豚鼠为实验动物模型,将V-1、V-2和V-3与商品化疫苗(血清4、5型HPS,灭活前活菌浓度各为4.0×10~9cfu/mL)分别免疫(依次为I组~IV组,空白对照组注射等量生理盐水)并进行免疫效果评价:通过间接ELISA测定各组豚鼠血清中IgG抗体水平;通过血清杀菌试验(SBT)测定各组豚鼠血清功能性抗体吞噬活性;通过噻唑蓝溴化四唑溶液(MTT)法测定豚鼠脾淋巴细胞的增殖指数;通过双抗夹心ELISA测定各组豚鼠细胞因子(IL-10、IL-4、TNF-β、IFN-γ、MCP-1)含量;对免疫豚鼠腹腔攻毒后检测各组疫苗的保护率;采用平板计数法测定各组豚鼠组织荷菌数以评估攻毒菌株在其中的定植数量;制作攻毒后各组豚鼠的肺、肝、脾和肾脏病理组织切片并观察。结果显示,在整个免疫周期,空白对照组各项检测指标始终无明显变化。I~IV组豚鼠血清IgG抗体效价均为1:12800;与空白对照组相比,I~IV组均能诱导豚鼠血清功能性抗体水平持续升高且无显著差异(P>0.05),表明各疫苗均具有较强的杀菌效果;I~IV组均能刺激豚鼠血清相关细胞因子水平(IL-4、IL-10、INF-γ、TNF-β、MCP-1)持续上升且无显著差异(P>0.05)。腹腔攻毒后,I~IV组总体保护率分别为85%、100%、100%和60%;I~III组豚鼠各脏器(肺、肝、肾、脾)细菌定植量均显著降低且显著低于免疫组IV(P<0.05),且该3组豚鼠各脏器病理变化均较免疫组IV轻微。上述结果表明,V-1、V-2和V-3免疫豚鼠后均能产生良好的体液免疫和细胞免疫反应,其中V-2和V-3能够100%抵抗致死剂量HPS血清4、5、7和13型的攻毒。本研究首次证明V-2和V-3可作为HPS病四价(血清4、5、7和13型)灭活苗的候选疫苗,为HPS病的疫苗研制奠定了基础。 展开更多
关键词 副猪嗜血杆菌病 四价(血清4、5、7和13型)灭活苗 豚鼠 免疫效果评价
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猪源肠外致病性大肠杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立 被引量：1
6
作者 程家园 李亮 +4 位作者 邢刚 刘雪兰 孙裴 魏建忠 李郁 《养猪》 2022年第2期89-94,共6页
利用制备的猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)全菌体蛋白建立一种检测猪源ExPEC抗体的间接ELISA方法。将2株猪源ExPEC SDjie18-10(O;)、HByan18-2(O;)超声裂解的全菌体蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测猪源ExPEC抗体的间接EL... 利用制备的猪源肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)全菌体蛋白建立一种检测猪源ExPEC抗体的间接ELISA方法。将2株猪源ExPEC SDjie18-10(O;)、HByan18-2(O;)超声裂解的全菌体蛋白作为包被抗原,对反应条件进行优化,建立检测猪源ExPEC抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价。该方法的最佳条件:包被抗原浓度为15μg/m L,37℃1 h+4℃过夜;2%BSA于37℃封闭2 h;血清稀释度为1∶800,37℃孵育30 min;酶标二抗稀释度为1∶5 000,37℃作用30 min;显色时间为37℃15 min。该方法可特异性检测猪源ExPEC抗体,阳性血清稀释至1∶6 400仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10%。应用间接ELISA与MAT进行符合性比较及临床猪血清样品感染抗体的同步检测,两种方法的符合率分别为93.33%和94.50%且无显著性差异(P>0.05),具有较高的均一性,同时间接ELISA的感染抗体阳性检出率(19.00%)略高于MAT(17.50%),两者检测结果高度一致(K=0.816)。基于猪源ExPEC全菌体蛋白建立的猪源ExPEC抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,可用于猪源ExPEC的免疫监测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪源ExPEC 全菌体蛋白 间接ELISA 抗体检测
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