基于CRISPR/Cas9技术的SS18-SSX1阳性细胞模型的构建与验证

1

作者 田娇 张乾儒 +4 位作者 王宁 史奇 李亚 张琨岚 李锋 《石河子大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期8-15,共8页

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建并验证SS18-SSX1^(+)-HEK293T细胞模型。方法 靶向SS18和SSX1分别设计sgRNA,构建Lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP一体化慢病毒载体,通过慢病毒转染和荧光流式分选技术筛选转入载体的HEK293... 目的 利用CRISPR/Cas9技术构建并验证SS18-SSX1^(+)-HEK293T细胞模型。方法 靶向SS18和SSX1分别设计sgRNA,构建Lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP一体化慢病毒载体,通过慢病毒转染和荧光流式分选技术筛选转入载体的HEK293T多克隆细胞,在多克隆细胞的基础上挑选SS18-SSX1阳性的单克隆细胞株,通过RT-PCR、Sanger测序和Western Blot验证SS18-SSX1^(+)-HEK293T单克隆细胞系构建成功。结果 成功构建了Lentivirus-CRISPR v2-SS18-gRNA-SSX1-gRNA-EGFP慢病毒载体;通过RT-PCR、Sanger测序和WB实验在178个HEK293T单克隆细胞中成功筛选并验证出1株SS18-SSX1阳性的单克隆细胞系。结论 利用CRISPR/Cas9技术成功构建SS18-SSX1融合基因阳性的HEK293T细胞系。 展开更多

关键词 CRISPR/Cas9 滑膜肉瘤 SS18-SSX1 HEK293T细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

长链非编码RNA对免疫应答调节的研究进展 被引量：6

2

作者 安志远 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1878-1884,共7页

lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录生成,长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA,它没有开放读码框,不能翻译成蛋白质,曾被认为是基因组中的＂暗物质＂。目前科学家们还没有精确掌握其功能信息以及全部的二维和三维结构,所以很难对lncRNA进行分类... lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ转录生成,长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA,它没有开放读码框,不能翻译成蛋白质,曾被认为是基因组中的＂暗物质＂。目前科学家们还没有精确掌握其功能信息以及全部的二维和三维结构,所以很难对lncRNA进行分类,现在是通过lncRNA和蛋白编码基因的相对位置对其进行分类的。 展开更多

关键词 RNA 免疫应答调节 开放读码框 病毒复制 转录本 树突状细胞 宿主免疫 干扰素应答 固有免疫 多聚腺苷酸

在线阅读 下载PDF 职称材料

TGF-α作为体-肺分流性肺动脉高压诊断生物标志物的研究

3

作者 袁雯 孟刘坤 +3 位作者 李君 郑美丽 李鹰 刘晓艳 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期96-101,共6页

目的评估转化生长因子α(transforming growth factorα, TGF-α)作为体-肺分流性肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)诊断生物标志物的可行性。方法用联合手术(右肺动脉结扎+1周后建立颈部分流)的方法构建体-肺分流性PAH... 目的评估转化生长因子α(transforming growth factorα, TGF-α)作为体-肺分流性肺动脉高压(pulmonary artery hypertension, PAH)诊断生物标志物的可行性。方法用联合手术(右肺动脉结扎+1周后建立颈部分流)的方法构建体-肺分流性PAH大鼠模型。纳入先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)患者49例,其中CHD不合并PAH患者24例,CHD-PAH患者25例;同时纳入年龄、性别相匹配的健康志愿者(control, CON) 20例。酶联免疫吸附实验法检测分流性PAH大鼠和CHD-PAH患者血浆TGF-α的浓度。结果体-肺分流性PAH大鼠血浆中TGF-α的浓度较假手术组明显升高;Spearman相关性分析表明,大鼠血浆TGF-α的水平与肺血流动力学指标及右室肥厚指数均呈明显正相关。TGF-α的血浆浓度在CHD-PAH组较CHD及CON组均明显升高,而在CHD组与CON组之间差异无显著性;血浆TGF-α的浓度为314 ng·L^(-1)时,诊断CHD-PAH的敏感度为0.760,特异度为0.750,ROC曲线下面积0.895。结论 TGF-α的血浆浓度在体-肺分流性PAH发生、发展过程中表达逐渐升高,血浆中TGF-α的水平可能是诊断体-肺分流性PAH潜在的生物标志物。 展开更多

关键词 体-肺分流性先天性心脏病 肺动脉高压 诊断 生物标志物 TGF-Α 联合手术

在线阅读 下载PDF 职称材料

基于CRISPR/Cas9技术构建PAX3-FOXO1融合基因敲除腺泡状横纹肌肉瘤细胞模型

4

作者 张乾儒 田娇 +4 位作者 孟莲 史奇 李亚 夏慧欣 李锋 《石河子大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2024年第5期621-630,共10页

目的使用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除PAX3-FOXO1融合基因的人腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)细胞系(RH30),并验证PAX3-FOXO1功能。方法运用在线网站针对PAX3、FOXO1设计sgRNA,选择切割效率最高的一组构建LV-PAX3-sgRNA、LV-FOXO1-sgRNA及LV-C... 目的使用CRISPR/Cas9技术构建稳定敲除PAX3-FOXO1融合基因的人腺泡状横纹肌肉瘤(ARMS)细胞系(RH30),并验证PAX3-FOXO1功能。方法运用在线网站针对PAX3、FOXO1设计sgRNA,选择切割效率最高的一组构建LV-PAX3-sgRNA、LV-FOXO1-sgRNA及LV-Cas9慢病毒载体;LV-Cas9病毒感染RH30细胞,潮霉素筛选后,通过RT-PCR及qRT-PCR检测RH30-Cas9细胞中Cas9基因表达;LV-PAX3-sgRNA及LV-FOXO1-sgRNA慢病毒载体分别感染RH30-Cas9细胞,流式分选筛选荧光阳性细胞;Sanger测序、PCR等分别验证RH30-PAX3-KO细胞及RH30-FOXO1-KO细胞中PAX3-FOXO1表达;EDU、TUNEL、Transwell实验检测敲除RH30-PAX3-KO细胞及RH30-FOXO1-KO细胞功能改变。结果成功构建靶向PAX3、FOXO1的CRISPR/Cas9慢病毒载体;PCR验证稳定表达Cas9的RH30细胞系(RH30-Cas9)构建成功;PCR、Western Blot验证靶向PAX3或FOXO1均成功敲除RH30中PAX3-FOXO1融合基因;靶向PAX3或FOXO1抑制RH30细胞增殖、侵袭、迁移,促进凋亡。结论使用CRISPR/Cas9成功构建敲除PAX3-FOXO1的RH30细胞系;敲除PAX3-FOXO1抑制了RH30细胞增殖、迁移等恶性生物学行为。 展开更多

关键词 横纹肌肉瘤 PAX3-FOXO1 CRISPR/Cas9 基因编辑

在线阅读 下载PDF 职称材料

卵巢癌SOX4介导TGF-β1诱导的上皮间质转化对侵袭转移能力的影响 被引量：12

5

作者 刘群 李丽娜 +1 位作者 刘健 苗劲蔚 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2022年第3期336-342,共7页

目的探讨SOX4(SRY-related HMG-box4)在卵巢癌中的表达、调控及其对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导卵巢癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力的影响。方法通过对TCGA、GEO等数据... 目的探讨SOX4(SRY-related HMG-box4)在卵巢癌中的表达、调控及其对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导卵巢癌上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)能力的影响。方法通过对TCGA、GEO等数据库中卵巢癌样本表达谱数据进行分析,探讨SOX4在卵巢癌中的表达情况,及其与EMT相关标志物的相关性。利用shRNA技术敲降卵巢癌SKOV3细胞系中SOX4的表达;利用Western blotting和qRT-PCR技术检测SOX4敲降对上皮标志物ZO1及间质标志物Vimentin和Slug表达的影响;利用Transwell技术检测SOX4敲降对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响;使用TGF-β1(10 ng/mL)处理SKOV3细胞72 h,然后通过Western blotting和qRT-PCR技术,检测TGF-β1对SOX4表达的调控情况,以及SOX4敲除对TGF-β1诱导EMT能力的影响。结果SOX4在卵巢癌中的表达显著上调,并与EMT间质标志物呈显著正相关;敲除SOX4可显著下调卵巢癌SKOV3细胞的EMT水平及其侵袭转移能力;TGF-β1可显著上调卵巢癌SKOV3细胞中SOX4的表达水平,而SOX4敲除可显著抑制TGF-β1诱导卵巢癌EMT的能力。结论SOX4在卵巢癌中表达上调,通过激活EMT促进其侵袭转移能力;并且,作为TGF-β1下游靶蛋白,SOX4介导了TGF-β1对卵巢癌EMT的诱导过程。因此,SOX4是一个干预卵巢癌转移的重要靶点。 展开更多

关键词 卵巢癌 转移 SOX4 转化生长因子β1(TGF-β1) 上皮间质转化

在线阅读 下载PDF 职称材料

分泌型簇蛋白在肺动脉高压大鼠中的表达变化 被引量：6

6

作者 刘晓艳 孟刘坤 +1 位作者 李君 魏英杰 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期764-768,共5页

目的探讨分泌型簇蛋白(secretory clusterin,sCLU)在野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)大鼠肺组织和血浆中的表达变化。方法 30只♂Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为对照组(n=6)和MCT组(n... 目的探讨分泌型簇蛋白(secretory clusterin,sCLU)在野百合碱(monocrotaline,MCT)诱导肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)大鼠肺组织和血浆中的表达变化。方法 30只♂Sprague Dawley(SD)大鼠随机分为对照组(n=6)和MCT组(n=24),MCT组给予腹腔注射60 mg·kg-1MCT,对照组(n=6)注射同体积的生理盐水。分别检测注射MCT后1、2、3、4周大鼠肺组织中sCLU的mRNA和蛋白质水平的表达变化、sCLU在肺血管中的定位情况及血浆中sCLU浓度的变化。结果 sCLU的mRNA和蛋白表达在MCT组大鼠肺组织中呈时间依赖性的明显升高,并且其主要定位于重构肺小动脉的胞质及细胞外基质中;sCLU的血浆浓度随PAH的进展而逐渐升高,且其与肺血流动力学指标及右室肥厚指数均呈正相关。结论 sCLU在MCT诱导PAH大鼠的肺组织和血浆中表达明显升高,它可能在肺血管重构过程中发挥着重要的作用,并可能是反应PAH严重程度的生物标志物。 展开更多

关键词 分泌型簇蛋白 肺动脉高压 肺血管重构 野百合碱 大鼠 增殖

在线阅读 下载PDF 职称材料

松果菊苷对刀豆蛋白A所致急性肝损伤小鼠的保护作用及对细胞外组蛋白的影响 被引量：15

7

作者 雷箴 温韬 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第2期97-102,共6页

目的研究松果菊苷对刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用以及对细胞外组蛋白水平的影响,并初步探讨其可能机制。方法将野生型C57BL/6(B6)小鼠随机分为正常对照组(n=6)、Con A染毒组(n=8)和松果菊苷+Con A组(n=8)。Con A染... 目的研究松果菊苷对刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性肝损伤小鼠的保护作用以及对细胞外组蛋白水平的影响,并初步探讨其可能机制。方法将野生型C57BL/6(B6)小鼠随机分为正常对照组(n=6)、Con A染毒组(n=8)和松果菊苷+Con A组(n=8)。Con A染毒组小鼠经尾静脉注射Con A(30mg/kg)诱导急性肝损伤,松果菊苷+Con A组小鼠先给予松果菊苷(50mg/kg)连续灌胃3d,然后再给予Con A染毒;正常对照组仅给予生理盐水。计算各组小鼠的生存率,HE染色观察肝损伤情况,ELISA法检测血清细胞外组蛋白表达情况,高效液相芯片系统测定细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平的变化。结果与正常对照组相比,Con A染毒组小鼠肝损伤严重,病理学观察可见大量肝细胞凋亡变性坏死,血清ALT、AST水平明显升高,血清中细胞外组蛋白和细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平均明显升高(P<0.01)。与Con A染毒组比较,松果菊苷+Con A组生存小鼠明显增多,肝损伤程度亦减轻;细胞外组蛋白、IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α水平均显著低于染毒组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论松果菊苷能明显减轻Con A诱导的小鼠急性肝损伤,其机制可能与降低血清中细胞外组蛋白及肝损伤相关的细胞因子水平有关。 展开更多

关键词 药物性肝损伤 松果菊苷 伴刀豆球蛋白A 组蛋白类 细胞因子类

在线阅读 下载PDF 职称材料

鲍曼不动杆菌外膜蛋白A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264.7细胞自噬 被引量：5

8

作者 安志远 丁文一 +1 位作者 郑春明 黄骁舾 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第12期2267-2270,2276,共5页

目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blo... 目的:分析鲍曼不动杆菌标准株ATCC 19606(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)对RAW264. 7细胞的自噬诱导作用。方法:建立Omp A刺激RAW264. 7细胞的模型,通过细胞免疫荧光染色、Western blot和透射电子显微镜检测Omp A对RAW264. 7细胞自噬的影响。结果:Omp A可以引起自噬蛋白LC3B-II表达升高,并抑制Akt/mTOR/p70S6K的磷酸化水平;雷帕霉素可以进一步降低mTOR和p70S6K磷酸化,并提高Omp A引起的LC3B-II表达升高。结论:鲍曼不动杆菌Omp A通过Akt/mTOR/p70S6K信号通路引起RAW264. 7细胞自噬。这为将来进一步研究鲍曼不动杆菌引起自噬的分子机制及找到对抗其感染的新方法提供理论依据。 展开更多

关键词 鲍曼不动杆菌 外膜蛋白A RAW264.7细胞 自噬 Akt/mTOR/p70S6K信号通路

在线阅读 下载PDF 职称材料

DCLK1敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响 被引量：6

9

作者 范晓娜 姚健楠 +2 位作者 葛洋 安广宇 李鹰 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第3期417-423,共7页

目的研究双皮质素样激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)的敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响及其潜在的作用机制。方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除食管鳞癌细胞(Kyse450,Kyse70)的DCLK1基因。通过细胞划痕实验和Tr... 目的研究双皮质素样激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)的敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响及其潜在的作用机制。方法使用CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除食管鳞癌细胞(Kyse450,Kyse70)的DCLK1基因。通过细胞划痕实验和Transwell实验评估DCLK1敲除对食管鳞癌细胞迁移和侵袭能力的影响。Western blotting法检测DCLK1敲除细胞系中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关转录因子的表达变化。通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atla,TCGA)数据库进一步分析食管鳞癌患者(n=95)中DCLK1表达和EMT相关转录因子之间的相关性。结果CRISPR/Cas9基因编辑技术能够有效地敲除食管鳞癌细胞系DCLK1基因并影响其表达。DCLK1缺失显著抑制食管鳞癌细胞的体外迁移和侵袭能力(P<0.05),并上调上皮标志物E-cadherin的表达,下调间质标志物如Vimentin、ZEB1、Slug和Snail的表达(P<0.05)。另外TCGA数据库分析显示食管鳞癌患者中DCLK1与EMT相关转录因子存在相关性。结论DCLK1敲除可通过抑制EMT进程影响食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。 展开更多

关键词 双皮质素样激酶 1 食管鳞癌 上皮间质转化 迁移 侵袭

在线阅读 下载PDF 职称材料

肺纤维化风险预测的临床生物化学模型 被引量：3

10

作者 冷冬 李桂芹 +3 位作者 王颖 缪冉 陈铎 黄骁舾 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2019年第6期875-880,共6页

目的应用数据挖掘技术分析肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)患者及对照组血清生物化学数据,为疾病的早期诊断提供有益线索。方法本研究收集PF患者(n=29)和健康对照(n=55)的生物化学检测数据,采用Z-计分和Log2转换方式将数据进行归一化处... 目的应用数据挖掘技术分析肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)患者及对照组血清生物化学数据,为疾病的早期诊断提供有益线索。方法本研究收集PF患者(n=29)和健康对照(n=55)的生物化学检测数据,采用Z-计分和Log2转换方式将数据进行归一化处理,用主成分分析与贝叶斯回归分析方法提取特征指标,构建PF患者血清生物化学指标的风险预测模型,并进行受试者操作特征分析。结果与正常对照相比,PF患者血清中的α-羟丁酸脱氢酶、乳酸脱氢酶、白蛋白、白蛋白与球蛋白比值、前白蛋白及钙浓度差异有统计学意义(P<0.05)。其中α-羟丁酸脱氢酶是一种有效预测潜在PF风险的生物化学检测指标。结论本研究对PF血清生物化学数据进行挖掘分析,成功构建了PF血清生物化学预测模型。 展开更多

关键词 肺纤维化 临床生物化学 数据建模

在线阅读 下载PDF 职称材料

神经母细胞瘤抑瘤蛋白1在肺动脉高压大鼠中的表达变化

11

作者 孟刘坤 滕晓 +3 位作者 袁雯 孟健 李君 刘晓艳 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第9期1226-1231,共6页

目的 研究神经母细胞瘤抑瘤蛋白1(neuroblastoma suppression of tumorigenicity 1,NBL1)在野百合碱(monocro-taline,MCT)诱导的肺动脉高压(pulmonary arterial hyperten-sion,PAH)大鼠中表达的变化.方法 将40只大鼠随机分为对照组(n=10... 目的 研究神经母细胞瘤抑瘤蛋白1(neuroblastoma suppression of tumorigenicity 1,NBL1)在野百合碱(monocro-taline,MCT)诱导的肺动脉高压(pulmonary arterial hyperten-sion,PAH)大鼠中表达的变化.方法 将40只大鼠随机分为对照组(n=10)和MCT组(n=30).MCT组腹腔注射MCT 60 mg·kg-1,对照组腹腔注射等体积生理盐水;3周、4周、5周后,检测肺组织和血浆中NBL1的变化.结果 MCT注射后3周、4周、5周,大鼠肺组织NBL1 mRNA水平分别下降了70%、81%和89%,蛋白水平分别下降了36%、78%和99%,而NBL1血浆浓度由对照组的(2.82±0.58)μg·L-1分别下降为(1.90±0.55)μg·L-1、(1.51±0.43)μg·L-1、(0.64±0.34)μg·L-1,且与肺血流动力学指标及右室肥厚程度均呈明显负相关;免疫组织化学染色显示,对照组NBL1主要定位于肺小动脉,而MCT组重构肺小动脉鲜有表达;细胞实验发现,NBL1能明显抑制BMP2/4对肺动脉内皮细胞BMP信号通路的激活.结论 NBL1的表达水平在MCT诱导的PAH中逐渐降低,说明NBL1或在肺血管重构中发挥重要的作用,而其血浆水平可能是PAH潜在的生物标志物. 展开更多

关键词 野百合碱 肺动脉高压 肺血管重构 神经母细胞瘤抑瘤蛋白1 生物标志物 诊断

在线阅读 下载PDF 职称材料

结直肠癌中O-型糖基化相关差异基因的筛选及分析 被引量：2

12

作者 姚健楠 高天博 +4 位作者 段凌 刘健 蒋玉良 安广宇 葛洋 《首都医科大学学报》 CAS 北大核心 2020年第3期403-410,共8页

目的通过鉴定得出正常和异常O-型糖基化结肠癌细胞之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),即O-型糖基化相关差异基因,并探讨其促进肿瘤发生发展的潜在机制。方法运用单色标记表达谱芯片技术对经Cosmc表达质粒或其空... 目的通过鉴定得出正常和异常O-型糖基化结肠癌细胞之间的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),即O-型糖基化相关差异基因,并探讨其促进肿瘤发生发展的潜在机制。方法运用单色标记表达谱芯片技术对经Cosmc表达质粒或其空白对照质粒稳定转染的LS174T Tn(+)细胞进行检测,采用RNA杂交获得基因表达谱数据,通过Wegstalt平台的基因通路富集(gene set enrichment analysis, GESA)方法行GO基因本体(gene ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)肿瘤相关通路分析,R语言行热图聚类分析,STRING在线软件对蛋白网络进行差异及整合分析。结果通过分析获得了1 474个符合条件的DEGs,其中有502个基因上调,972个基因下调;GO分析显示DEGs主要参与细胞外基质组织及生长因子活性相关的生物学过程;KEGG分析DEGs主要富集在磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)和Wnt等经典信号通路上。结论本研究首次着眼于结肠癌细胞中由O-型糖基化引起的转录组学变化,有助于揭示O-型糖基化修饰的结直肠癌分子特征,并为科学研究和临床治疗提供新的方向。 展开更多

关键词 结直肠癌 O-型糖基化 基因表达谱 差异表达基因 Cosmc 生物信息学

在线阅读 下载PDF 职称材料