目的肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法以HSC细胞系(...目的肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法以HSC细胞系(LX-2)及肝癌细胞系(Hep G2、PLC/PRF/5)为研究对象。RT-q PCR和Western Blot(WB)法检测LX-2中H2S关键合成酶——胱硫醚γ-裂解酶(CSE)m RNA及表达水平;ELISA测定上清液LX-2产生的H2S浓度;二代测序、细胞免疫荧光、染色质免疫沉淀(Ch IP)及WB检测H2S(内源性和外源性)作用Hep G2和PLC/PRF/5细胞后,JNK/Jun B-TNFSF14信号通路基因、结合位点及相关蛋白。Transwell小室将LX-2分别与Hep G2和PLC/PRF/5共培养,CCK-8和流式细胞术检测肝癌细胞的细胞活力、凋亡,WB测定H2S-TNFSF14信号通路相关蛋白。所有细胞实验均重复3次。计量资料两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。结果LX-2主要通过CSE合成H2S,LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加[(22.89±0.08)pg/m L vs(28.29±0.15)pg/m L vs(36.19±1.90)pg/m L,F=79.63,P<0.05]。LX-2中CSE m RNA水平显著高于CBS m RNA和MPST m RNA(1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02,F=80.84,P<0.05)。当CSE被炔丙基甘氨酸(PPG)抑制之后,随着PPG浓度增加,H2S浓度下降(P<0.05)。LX-2分别与Hep G2、PLC/PRF/5共培养,随着培养时间延长,Hep G2(87.48%±0.82%vs70.48%±0.641%vs 52.89%±0.57%vs 45.20%±0.69%,F=1517.13,P<0.001)和PLC/PRF/5(92.41%±0.48%vs 74.10%±0.73%vs 53.70%±0.60%vs 44.00%±0.27%,F=2626.21,P<0.001)细胞活力降低;凋亡增加(Hep G2:12.88%±0.64%vs15.5%±0.16%vs 18.43%±0.37%vs 13.01%±0.58%,F=142.15,P<0.001;PLC/PRF/5:8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30,F=676.40,P<0.001),第3天最显著。二代测序显示,内源性H2S(LX-2产生)和Na HS(外源性H2S供体)参与调控Hep G2中多种基因表达。Na HS和LX-2通过释放H2S,激活肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路、上调凋亡基因TNFSF14表达,且p-Jun B与TNFSF14基因转录调控区域结合增加。结论在肝癌微环境中,HSC通过信号分子CSE/H2S,激活了肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路,TNFSF14表达增加,从而促进了肝癌细胞凋亡。展开更多
文摘目的肝星状细胞(HSC)和硫化氢(H2S)信号分子作为肝细胞癌(HCC)微环境中重要的组分,参与调控HCC的发生发展等多种生物学进程。本研究通过HSC与肝癌细胞系共培养,探讨HSC通过分泌H2S参与调控肝癌细胞凋亡的作用及其机制。方法以HSC细胞系(LX-2)及肝癌细胞系(Hep G2、PLC/PRF/5)为研究对象。RT-q PCR和Western Blot(WB)法检测LX-2中H2S关键合成酶——胱硫醚γ-裂解酶(CSE)m RNA及表达水平;ELISA测定上清液LX-2产生的H2S浓度;二代测序、细胞免疫荧光、染色质免疫沉淀(Ch IP)及WB检测H2S(内源性和外源性)作用Hep G2和PLC/PRF/5细胞后,JNK/Jun B-TNFSF14信号通路基因、结合位点及相关蛋白。Transwell小室将LX-2分别与Hep G2和PLC/PRF/5共培养,CCK-8和流式细胞术检测肝癌细胞的细胞活力、凋亡,WB测定H2S-TNFSF14信号通路相关蛋白。所有细胞实验均重复3次。计量资料两组间比较采用成组t检验;多组间比较采用单因素方差分析或重复测量方差分析,进一步两两比较采用Dunnett-t检验。结果LX-2主要通过CSE合成H2S,LX-2培养上清液中H2S浓度随着时间延长逐渐增加[(22.89±0.08)pg/m L vs(28.29±0.15)pg/m L vs(36.19±1.90)pg/m L,F=79.63,P<0.05]。LX-2中CSE m RNA水平显著高于CBS m RNA和MPST m RNA(1.008±0.13 vs 0.320±0.014 vs 0.05±0.02,F=80.84,P<0.05)。当CSE被炔丙基甘氨酸(PPG)抑制之后,随着PPG浓度增加,H2S浓度下降(P<0.05)。LX-2分别与Hep G2、PLC/PRF/5共培养,随着培养时间延长,Hep G2(87.48%±0.82%vs70.48%±0.641%vs 52.89%±0.57%vs 45.20%±0.69%,F=1517.13,P<0.001)和PLC/PRF/5(92.41%±0.48%vs 74.10%±0.73%vs 53.70%±0.60%vs 44.00%±0.27%,F=2626.21,P<0.001)细胞活力降低;凋亡增加(Hep G2:12.88%±0.64%vs15.5%±0.16%vs 18.43%±0.37%vs 13.01%±0.58%,F=142.15,P<0.001;PLC/PRF/5:8.51±0.05 vs 12.80±0.33 vs 15.59±0.21 vs 10.72±0.30,F=676.40,P<0.001),第3天最显著。二代测序显示,内源性H2S(LX-2产生)和Na HS(外源性H2S供体)参与调控Hep G2中多种基因表达。Na HS和LX-2通过释放H2S,激活肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路、上调凋亡基因TNFSF14表达,且p-Jun B与TNFSF14基因转录调控区域结合增加。结论在肝癌微环境中,HSC通过信号分子CSE/H2S,激活了肝癌细胞中JNK/Jun B信号通路,TNFSF14表达增加,从而促进了肝癌细胞凋亡。
