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重组人IL-12在CHO细胞中高效表达克隆的筛选及产物的生物学活性分析 被引量:5
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作者 吕锐 张文卿 +1 位作者 于红 李丹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期564-566,共3页
目的:重组人白细胞介素-12(rhIL-12)真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-p70)转染CHO细胞,筛选高效稳定表达克隆;并对表达产物进行生物学活性分析。方法:采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5-his-p70转入CHO细胞;用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳... 目的:重组人白细胞介素-12(rhIL-12)真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-p70)转染CHO细胞,筛选高效稳定表达克隆;并对表达产物进行生物学活性分析。方法:采用聚乙烯亚胺(PEI)将pcDNA6/v5-his-p70转入CHO细胞;用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选阳性表达克隆,并进行单克隆扩增;RT-PCR进行表达鉴定;ELISA检测各克隆rhIL-12的表达量;应用淋巴细胞增生实验及细胞内细胞因子染色方法分析rhIL-12的生物学活性。同时,对筛选出的阳性克隆进行表达稳定性观察。结果:RT-PCR结果显示,选取的20个阳性克隆均可扩增出1800bp的特异性片段;ELISA表明,其中6个克隆rhIL-12表达水平较高(312.69~719.10ng/L),最高表达量达到719ng/L(5×104个细胞,48h);生物学活性分析表明,表达的rhIL-12可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV反应的CD4/IFN-γ及CD8/IFN-γ双标记阳性细胞克隆的频数;并且,可明显提高献血员外周血PBMC对PHA/HCMV刺激的增生反应效能。阳性克隆在维持量的筛选药物(2ng/LBlasticidin)压力下传代6个月,其表达水平无明显变化。结论:rhIL-12真核表达载体(pcDNA6/v5-his-p70)能在CHO细胞中高效稳定表达;其表达产物具有良好的生物学活性。 展开更多
关键词 白细胞介素-12 中国仓鼠卵巢细胞 基因表达
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益生菌对大鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制研究 被引量:31
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作者 梁惠 吕锐 +6 位作者 傅泳 周治彤 刘颖 周晓彬 王文成 刘曼 马爱国 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第7期991-997,共7页
目的探讨益生菌对大鼠酒精性肝损伤的保护作用。方法建立酒精性肝损伤模型,同时以碧悠益生菌发酵乳5×108CFU·kg-1·d-1灌胃干预,持续8周。HE染色观察各组大鼠肝组织病理学改变;透射电镜观察肝及小肠组织超微结构变化;酶... 目的探讨益生菌对大鼠酒精性肝损伤的保护作用。方法建立酒精性肝损伤模型,同时以碧悠益生菌发酵乳5×108CFU·kg-1·d-1灌胃干预,持续8周。HE染色观察各组大鼠肝组织病理学改变;透射电镜观察肝及小肠组织超微结构变化;酶法检测血清转氨酶及ALP活力;ELISA法检测血清DAO和D-LA水平;免疫组化法检测小肠组织FOXO4表达情况;16S r DNA高通量测序进行粪便肠道菌群结构分子生态学分析。结果益生菌干预使酒精诱导的肝脂肪变性得到明显缓解,肝及小肠组织超微结构亦得到不同程度改善,其病理学评分明显降低(P<0.05);同时,血清ALT、AST、ALP、DAO和D-LA水平均明显下降,小肠FOXO4表达明显提高(P<0.05)。益生菌干预在肠道菌群菌门、菌属水平均较酒精模型组有不同程度改变,丰度最高的前20个菌属与正常对照组一致率达到90%,对恢复肠道菌群多样性及丰度正常状态具有一定调节作用。结论益生菌对大鼠酒精性肝损伤具有一定保护作用,其作用机制可能与益生菌纠正肠道菌群结构紊乱,修复肠道屏障功能,改善肠道内环境有关。 展开更多
关键词 益生菌 酒精性肝损伤 肠道屏障功能 肠道菌群 16 S rDNA高通量测序 分子生态学
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eglA p-Her2/neu-IL-12融合基因穿梭载体的构建 被引量:5
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作者 刘颖 张文卿 +4 位作者 于红 吕锐 张艳丽 徐腾飞 李丹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期370-373,共4页
目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-h... 目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,并探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。方法:以含有全长hHer2/neu序列的真核表达质粒(pcDNA3.1 hHer2/neu)为模板,采用PCR方法,扩增hHer2/neu ECD基因片段;将其插入重组rhIL-12真核表达质粒pcD-NA6 rhIL-12(p1)中的rhIL-12基因上游,获得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL-12(p2)真核表达质粒;设计合成eglAp基因中一段55 bp序列作为模板,通过连续PCR的方法,扩增eglAp片段(335 bp),并构建T-eglA p(p3)亚克隆质粒;通过酶切连接的方法,将eglA p片段插入p2质粒中的hHer2/neu ECD基因上游,构建pcDNA6 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p4)真核表达质粒;通过in-fusion技术,将融合基因eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12插入pIMP1穿梭表达质粒,构建重组pIMP1eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12(p5)穿梭表达载体,并进行菌液PCR、酶切及测序鉴定。结果:获得的hHer2/neu ECD和eglA p片段及p2、p3、p4重组质粒、p5融合基因重组穿梭表达载体,其PCR产物和酶切片段大小与预期一致,测序结果证实各基因序列与GenBank中mRNA或DNA序列一致。结论:成功地构建了大肠杆菌-厌氧芽胞梭菌融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu ECD-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。 展开更多
关键词 eglA启动子 人表皮生长因子受体2胞外区 IL-12 穿梭表达质粒
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重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选 被引量:4
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作者 徐腾飞 张文卿 +1 位作者 于红 李丹 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期226-228,232,共4页
目的:构建人表皮生长因子受体(HER2)胞外区(1896bp)基因的真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-HER2),转染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),获得其稳定表达细胞株(EMT6/HER2)。方法:用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1-HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列... 目的:构建人表皮生长因子受体(HER2)胞外区(1896bp)基因的真核表达质粒(pcDNA6/v5-his-HER2),转染小鼠乳腺癌细胞(EMT6),获得其稳定表达细胞株(EMT6/HER2)。方法:用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1-HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列;经酶切、连接构建pcDNA6/v5-his-HER2;转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,对其进行酶切及测序鉴定;以PEI法将pcDNA6/v5-his-HER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞,经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选1~2周,获得抗性克隆EMT6/HER2;用RT-PCR检测EMT6/HER2中HER2mRNA,免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果:PCR产物与预期片段大小一致;pcDNA6/v5-his-HER2经酶切、琼脂糖凝胶电泳后,可见与PCR产物大小相同的片段;DNA测序结果显示,pcDNA6/v5-his-HER2中HER2基因序列无误,读码框正确;用RT-PCR可在EMT6/HER2中检测到HER2mRNA,免疫组化法证实,EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论:成功地构建了HER2胞外区真核表达载体,获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株,为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。 展开更多
关键词 HER2 真核表达 转染
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凹顶藻萜提取物对荷H22肿瘤小鼠氧化应激及p53和MMP-9表达的影响 被引量:1
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作者 梁惠 刘颖 +3 位作者 韩磊 贺娟 张文卿 马爱国 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第8期1183-1184,共2页
肝癌是严重危害人类生命健康的顽症之一。近年来,海洋萜类化合物的天然抗氧化、抗肿瘤活性已引起人们的广泛关注。
关键词 凹顶藻 H22肿瘤 P53 MMP-9 抗氧化
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重组穿梭质粒pIMP1-eHER2/neu的构建及其生孢梭菌稳定转化株的筛选与鉴定
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作者 张艳丽 张文卿 +3 位作者 王秋波 丁守怡 吕锐 孟林 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1184-1187,共4页
目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-H... 目的:制备人原癌基因HER2/neu的细胞外区域(ECD)基因修饰的重组生孢梭菌,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法:利用SOE-PCR将HER2/neu ECD基因连接到厌氧菌的内β1,4-葡聚糖酶的启动子和信号肽基因(eg-lAp)下游,构建融合基因eglAp-HER2/neu;将其插入大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒pIMP1,构建重组质粒;首先将重组质粒导入大肠杆菌DH5α内并进行鉴定;然后用电穿孔法将重组质粒导入生孢梭菌。利用红霉素抗性筛选重组生孢梭菌;采用菌液PCR鉴定阳性克隆。结果:酶切和测序结果显示,插入质粒pIMP1内的eglAp-HER2/neu融合基因序列及读框正确。菌液PCR结果表明,重组质粒pIMP1-eHER2/neu成功转化生孢梭菌;经过20多代抗生素压力筛选,重组生孢梭菌仍能稳定携带pIMP1-eHER2/neu。结论:成功制备了重组质粒pIMP1-eHER2/neu生孢梭菌的稳定转化株,为其进一步的抗肿瘤作用研究奠定基础。 展开更多
关键词 大肠杆菌-厌氧菌穿梭质粒 生孢梭菌 HER2/NEU ECD pIMP1
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重组大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1-eIL-12稳定转化生孢梭菌
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作者 张艳丽 张文卿 +3 位作者 王秋波 丁守怡 吕锐 孟林 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2012年第9期923-926,共4页
目的近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注。文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础。方法用SOE-PC... 目的近些年来,以厌氧芽孢梭菌作为实体瘤基因治疗载体的研究逐渐受到关注。文中用重组人白细胞介素-12(rhIL-12)基因重组大肠埃希菌(E.coli)-厌氧梭菌穿梭质粒pIMP1,并稳定转化生孢梭菌,为增强杀伤肿瘤细胞的研究提供基础。方法用SOE-PCR法将rhIL-12基因连到厌氧梭菌的内源性β1,4-葡聚糖酶(endo-1,4-glucanase,eglA)启动子和信号肽之后,构建融合基因eglAp-rhIL-12,将其插入pIMP1,构建重组质粒pIMP1-eIL-12;重组质粒首先在E.coli DH5α内进行鉴定,然后用电穿孔法转化生孢梭菌;利用红霉素抗性筛选阳性克隆,并提取质粒鉴定阳性克隆。结果酶切和测序结果表明插入到pIMP1内的融合基因eglAp-rhIL-12序列及读框正确;抗生素压力筛选和20多代随机质粒提取酶切鉴定结果表明重组质粒pIMP1-eIL-12已稳定转化生孢梭菌。结论成功获得重组质粒pIMP1-eIL-12及其生孢梭菌稳定转化株,为以后的抗肿瘤研究奠定了基础。 展开更多
关键词 大肠埃希菌-厌氧梭菌穿梭质粒 生孢梭菌 rhIL-12 pIMP1
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几株高产蛋白酶菌株的分离鉴定及初步研究 被引量:4
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作者 朱绍辉 王斌 +5 位作者 夏伟 张浩 张国雨 王晓丽 李超 徐权汉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第7期182-186,共5页
从采集的245份海洋生物及环境样本中筛选高产蛋白酶菌株,进行形态学和分子生物学鉴定,并对其生物学特性和菌株间的配伍效果进行研究。结果显示,所分离的菌株中Pe、Pc为枯草芽孢杆菌,Ps为地衣芽孢杆菌。培养16h后进入生长平台期,Pc和Ps... 从采集的245份海洋生物及环境样本中筛选高产蛋白酶菌株,进行形态学和分子生物学鉴定,并对其生物学特性和菌株间的配伍效果进行研究。结果显示,所分离的菌株中Pe、Pc为枯草芽孢杆菌,Ps为地衣芽孢杆菌。培养16h后进入生长平台期,Pc和Ps菌株生长的最适pH均为7.0,最适生长温度均为35℃;菌株Pe的最适pH为6.5,最适生长温度是30℃。菌株Pe与Ps 1∶1配伍后产酶效果最好。 展开更多
关键词 蛋白酶 菌株 分离 鉴定
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