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副结核分枝杆菌85A、85B蛋白生物信息学特征及其原核表达
1
作者
平宇明
张宏莉
+7 位作者
王佳
李明鑫
李超
赵萍萍
王娅荣
张立华
李劼
常华
《福建农业学报》
北大核心
2025年第5期467-475,共9页
【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】...
【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】运用生物信息学在线分析平台对85A和85B蛋白的氨基酸序列展开分析,去除跨膜区和信号肽结构,进行密码子优化,成功构建pET-30a-MAP-85A和pET-30a-MAP-85B重组质粒。以BL21(DE3)作为表达菌株进行原核表达,优化诱导表达的温度、IPTG浓度及诱导时间;对诱导表达蛋白进行可溶性分析,利用镍柱进行纯化;用Western blotting技术评估重组蛋白的免疫反应性。【结果】成功获得重组85A蛋白,其分子量约为31.3 kDa,在37℃、IPTG终浓度1.0 mmol·L^(-1)诱导4 h,可达到最佳表达效果;重组85B蛋白分子量为31.8 kDa,在37℃、IPTG终浓度0.8 mmol·L^(-1)诱导6 h表达量最好。两种重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍离子柱纯化后获得高纯度目标蛋白。以MAP阳性牛血清为一抗,对纯化后蛋白进行Western blotting检测,结果显示特异性条带,充分证实85A和85B重组蛋白具备良好的免疫反应性。【结论】研究成功实现副结核分枝杆菌重组85A和85B蛋白的高效表达,且有较好的免疫反应性,为该菌免疫学检测技术的开发提供重要的理论基础。
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关键词
副结核分枝杆菌
原核表达
85A
85B
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职称材料
副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
被引量：
1
2
作者
平宇明
张宏莉
+8 位作者
班亚星
刘建奇
任希恩
邬彩丽
刘东霞
徐丽媛
杨雪娇
常华
李劼
《动物医学进展》
北大核心
2024年第7期1-6,共6页
为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏...
为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。
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关键词
副结核分支杆菌
实时荧光定量PCR
检测方法
感染调查
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职称材料
题名
副结核分枝杆菌85A、85B蛋白生物信息学特征及其原核表达
1
作者
平宇明
张宏莉
王佳
李明鑫
李超
赵萍萍
王娅荣
张立华
李劼
常华
机构
云南农业大学动物医学院
金宇保灵生物药品有限公司/兽用疫苗国家工程实验室
甘肃省畜牧兽医研究所
宜宾市翠屏区农业农村局
出处
《福建农业学报》
北大核心
2025年第5期467-475,共9页
基金
云南省重大科技专项计划项目(202302AA310020)
呼和浩特市科技创新领域人才项目(2022RC-联合体-1)
云南省重点研发计划——建设面向南亚东南亚科技创新中心专项(202403AP140033)。
文摘
【目的】探究副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis,MAP)85A和85B蛋白的生物信息学结构特征,通过原核表达技术获取两种蛋白,并评估其反应原性,从而为后续该菌ELISA检测试剂盒的研发及疫苗研究奠定基础。【方法】运用生物信息学在线分析平台对85A和85B蛋白的氨基酸序列展开分析,去除跨膜区和信号肽结构,进行密码子优化,成功构建pET-30a-MAP-85A和pET-30a-MAP-85B重组质粒。以BL21(DE3)作为表达菌株进行原核表达,优化诱导表达的温度、IPTG浓度及诱导时间;对诱导表达蛋白进行可溶性分析,利用镍柱进行纯化;用Western blotting技术评估重组蛋白的免疫反应性。【结果】成功获得重组85A蛋白,其分子量约为31.3 kDa,在37℃、IPTG终浓度1.0 mmol·L^(-1)诱导4 h,可达到最佳表达效果;重组85B蛋白分子量为31.8 kDa,在37℃、IPTG终浓度0.8 mmol·L^(-1)诱导6 h表达量最好。两种重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍离子柱纯化后获得高纯度目标蛋白。以MAP阳性牛血清为一抗,对纯化后蛋白进行Western blotting检测,结果显示特异性条带,充分证实85A和85B重组蛋白具备良好的免疫反应性。【结论】研究成功实现副结核分枝杆菌重组85A和85B蛋白的高效表达,且有较好的免疫反应性,为该菌免疫学检测技术的开发提供重要的理论基础。
关键词
副结核分枝杆菌
原核表达
85A
85B
Keywords
Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis
prokaryotic expression
85A
85B
分类号
S851.2 [农业科学—预防兽医学]
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职称材料
题名
副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
被引量：
1
2
作者
平宇明
张宏莉
班亚星
刘建奇
任希恩
邬彩丽
刘东霞
徐丽媛
杨雪娇
常华
李劼
机构
云南农业大学动物医学院
金宇保灵生物药品有限公司/兽用疫苗国家工程实验室
河南省卫辉市农业农村局
出处
《动物医学进展》
北大核心
2024年第7期1-6,共6页
基金
呼和浩特市科技创新领域人才项目(2022RC-联合体-1)
云南省基础研究面上项目(202001AT070119)
+3 种基金
2023年生物医药领域科技计划项目“抗畜禽腹泻兽药创制”子项目(K2420230005)
云南省农业基础研究联合专项面上项目(2018FG001-043)
云南农业大学兽医公共卫生省创新团队项目(202105AE160014)
云南省石林县奶山羊产业科技特派团项目(202104BI090017)。
文摘
为加强副结核分支杆菌(MAP)的检测、监测与防控,建立MAP荧光定量PCR(qPCR)检测方法,根据国内MAP流行菌株特异性插入序列IS900设计1对特异性引物和探针,构建重组阳性质粒用作建立qPCR的模板,优化反应体系和条件,验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法最低检测限为5拷贝/μL;重复试验中批内和批间变异系数均小于4%;与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体、肺炎克雷伯菌和曼氏杆菌等病原检测无交叉反应,能特异性检出MAP。应用建立的qPCR开展了内蒙古自治区6个市的MAP临床样品检测和流行情况分析,结果显示MAP平均阳性率为0.85%(6/704)。结果表明,成功建立了MAP的实时荧光定量PCR检测方法,可用于临床中MAP的监测和调查,为MAP疾病诊断与监控提供了快捷的方法。
关键词
副结核分支杆菌
实时荧光定量PCR
检测方法
感染调查
Keywords
Mycobactium paratuberculosis(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis)
real-time fluorescence quantitative PCR
detection method
infection investigation
分类号
S852.619 [农业科学—基础兽医学]
S858.23 [农业科学—临床兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
副结核分枝杆菌85A、85B蛋白生物信息学特征及其原核表达
平宇明
张宏莉
王佳
李明鑫
李超
赵萍萍
王娅荣
张立华
李劼
常华
《福建农业学报》
北大核心
2025
0
在线阅读
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职称材料
2
副结核分支杆菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用
平宇明
张宏莉
班亚星
刘建奇
任希恩
邬彩丽
刘东霞
徐丽媛
杨雪娇
常华
李劼
《动物医学进展》
北大核心
2024
1
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