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肺炎链球菌热休克蛋白Grp E的表达、纯化及热稳定性研究
1
作者
张宏鹏
赵沙沙
+5 位作者
龙小滨
吴爽
白垒
罗淼
黄爱龙
汪德强
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第10期1448-1451,共4页
目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp...
目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp E,并在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)B834中表达,Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化Grp E蛋白,Hiload Superdex 75凝胶层析柱分析在溶液中的聚集状态,热稳定性(thermal shift assay,TSA)法测定热稳定性。结果:1成功构建重组质粒p W28-Grp E,在表达菌E.coli B834中可溶性表达。2获得高纯度(95.0%以上)Grp E蛋白,发现该蛋白在溶液中以二聚体形式存在。3测定Grp E蛋白在p H 6.0、20 mmol/L盐浓度缓冲液中有较高热稳定性。结论:利用经典的蛋白质克隆表达纯化技术,获得了高表达量高纯度的Grp E蛋白,并初步测定其热稳定性为下一步蛋白晶体培养、三维结构解析及感染机制研究提供重要基础。
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关键词
肺炎链球菌
热休克蛋白Grp
E
蛋白质表达纯化
热稳定性
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职称材料
GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究
2
作者
吴爽
张祥
+2 位作者
魏杰
汪德强
罗淼
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第4期384-388,共5页
目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pA...
目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd Track-TO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAd Track-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒。以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染。通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达。最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响。结果:测序验证pAd Track-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功。在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达。MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用。结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白。证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖。为进一步研究GRP78的功能奠定了基础。
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关键词
腺病毒
葡萄糖调节蛋白78
HEPG2细胞
MTS
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职称材料
题名
肺炎链球菌热休克蛋白Grp E的表达、纯化及热稳定性研究
1
作者
张宏鹏
赵沙沙
龙小滨
吴爽
白垒
罗淼
黄爱龙
汪德强
机构
重庆
医
科
大学
检验
医学
院临床
检验
诊断重点实验室
成都中医药大学附属
医院
检验
科
感染性疾病分子生物学教育部重点实验室
重庆市渝北区人民医院医学检验科
出处
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第10期1448-1451,共4页
基金
国家自然科学基金资助项目(编号:31240082)
国家青年自然基金资助项目(编号:81301395)
重庆市自然科学基金资助项目(编号:2011BB5124)
文摘
目的:肺炎链球菌可引起细菌性肺炎和脑膜炎、发热性菌血症等多种疾病。对肺炎链球菌热休克蛋白Grp E进行克隆表达,纯化及热稳定性测定,以便于进一步分析肺炎链球菌感染的分子机制。方法:利用PCR技术扩增Grp E基因,构建重组质粒p W28-Grp E,并在大肠杆菌(escherichia coli,E.coli)B834中表达,Ni2+-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化Grp E蛋白,Hiload Superdex 75凝胶层析柱分析在溶液中的聚集状态,热稳定性(thermal shift assay,TSA)法测定热稳定性。结果:1成功构建重组质粒p W28-Grp E,在表达菌E.coli B834中可溶性表达。2获得高纯度(95.0%以上)Grp E蛋白,发现该蛋白在溶液中以二聚体形式存在。3测定Grp E蛋白在p H 6.0、20 mmol/L盐浓度缓冲液中有较高热稳定性。结论:利用经典的蛋白质克隆表达纯化技术,获得了高表达量高纯度的Grp E蛋白,并初步测定其热稳定性为下一步蛋白晶体培养、三维结构解析及感染机制研究提供重要基础。
关键词
肺炎链球菌
热休克蛋白Grp
E
蛋白质表达纯化
热稳定性
Keywords
Streptococcus pneumonia
heat shock protein GrpE
expression and purification
thermal stability
分类号
R378.14 [医药卫生—病原生物学]
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职称材料
题名
GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究
2
作者
吴爽
张祥
魏杰
汪德强
罗淼
机构
重庆
医
科
大学
检验
医学
院
感染性疾病分子生物学教育部重点实验室
重庆市渝北区人民医院医学检验科
出处
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016年第4期384-388,共5页
基金
国家自然科学基金资助项目(编号:81301395)
文摘
目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd Track-TO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAd Track-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒。以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染。通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达。最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响。结果:测序验证pAd Track-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功。在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达。MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用。结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白。证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖。为进一步研究GRP78的功能奠定了基础。
关键词
腺病毒
葡萄糖调节蛋白78
HEPG2细胞
MTS
Keywords
adenovirus
glucose regulated protein 78（GRP78）
HepG2 cell
MTS
分类号
Q71 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
肺炎链球菌热休克蛋白Grp E的表达、纯化及热稳定性研究
张宏鹏
赵沙沙
龙小滨
吴爽
白垒
罗淼
黄爱龙
汪德强
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2014
0
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职称材料
2
GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究
吴爽
张祥
魏杰
汪德强
罗淼
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2016
0
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