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AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用
被引量：
2
1
作者
龚梦嘉
周建武
毕杨
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第11期1571-1576,共6页
目的构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体,并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE),将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α...
目的构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体,并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE),将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10,通过Realtime PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达,EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞,荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞,荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体,Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体,EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力,而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性,而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高,其中BMP9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性,并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。
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关键词
转录蛋白AP2α
荧光素酶报告基因
显性负性突变体
骨形态发生蛋白
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职称材料
全反式维甲酸诱导肝癌细胞Hepa1-6成熟和分化过程中的自噬
被引量：
4
2
作者
方姝煜
崔洁洁
+3 位作者
龚梦嘉
何昀
张敬芳
毕杨
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第5期527-533,共7页
目的探讨不同浓度全反式维甲酸(ATRA)对小鼠肝癌细胞Hepa1-6成熟分化及细胞自噬水平的影响。方法以小鼠肝癌细胞Hepa1-6为研究对象,分别给予0.1、1、10μmol/L浓度的ATRA处理,荧光定量PCR和Western blot检测肝细胞相关标志基因的表达,...
目的探讨不同浓度全反式维甲酸(ATRA)对小鼠肝癌细胞Hepa1-6成熟分化及细胞自噬水平的影响。方法以小鼠肝癌细胞Hepa1-6为研究对象,分别给予0.1、1、10μmol/L浓度的ATRA处理,荧光定量PCR和Western blot检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(ICG)及过碘酸-希夫(PAS)染色检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6的成熟功能,透射电镜观测细胞连接及自噬小体,选择最适的ATRA作用浓度;Western blot检测自噬相关标志蛋白的表达,ptf LC3质粒转染细胞后共聚焦观察自噬流变化,检测自噬流是否通畅。结果相较于空白对照组,ATRA可呈浓度依赖性抑制肝前体标志蛋白AFP的表达,并促进肝细胞成熟标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色提示阳性细胞数明显增多;透射电镜结果显示ATRA诱导组的紧密连接和细胞骨架明显增多,可见高尔基复合体以及较多的自噬小体和自噬溶酶体。均以10μmol/L组最为显著,作为最适终浓度。自噬相关标志蛋白LC3-II、Beclin-1、RAB7、P62的表达不同程度增高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显增加(P<0.05),激光共聚焦可见10μmol/LATRA处理组细胞胞浆内绿色亮点的自噬小体及红色亮点的自噬溶酶体均较对照组明显增多。结论 ATRA可诱导小鼠肝癌细胞Hepa1-6的成熟分化,并促进细胞自噬水平增高。
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关键词
原发性肝癌
全反式维甲酸
自噬
细胞分化
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职称材料
AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨
3
作者
龚梦嘉
李娅莎
毕杨
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2015年第2期181-186,共6页
目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△b ...
目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△b HLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果:BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、OPN及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的增高(OC:F=56.929,P=0.000;OPN:F=54.789,P=0.000;OPG:F=159.451,P=0.000),ALP活性(F=69.776,P=0.000)及红色钙盐沉积减少。结论:BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。
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关键词
转录蛋白AP2α
显性负性突变体
骨形态发生蛋白9
成骨分化
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职称材料
题名
AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用
被引量：
2
1
作者
龚梦嘉
周建武
毕杨
机构
重庆医科大学附属儿童医院儿研所干细胞实验室
//
儿童
发育疾病
研
究教育部重点
实验室
//
重庆
市
干细胞
治疗工程技术
研
究中心
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第11期1571-1576,共6页
基金
国家自然科学基金(81100309)~~
文摘
目的构建一种携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体,并应用于筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。方法设计4个串联的AP2α效应元件(AP2α-RE),将其克隆至经Bam HⅠ和MluⅠ双酶切的pBGLuc荧光素酶报告基因质粒构建pBGLuc-AP2α-RE载体。重组腺病毒Ad-AP2α及其两种显性负性突变体Ad-dnAP2α感染小鼠间充质干细胞C3H10,通过Realtime PCR、Western blot检测AP2α的mRNA和蛋白水平表达,EMSA检测AP2α的DNA结合能力。pBGLuc-AP2α-RE转染C3H10细胞,荧光素酶报告基因检测同上各组AP2α的转录活性。Ad-BMPs感染pBGLuc-AP2α-RE转染的C3H10细胞,荧光素酶报告基因筛选BMPs对AP2α转录活性的影响。结果经PCR、酶切及测序鉴定,证实AP2α-RE正确克隆至pBGLuc-AP2α-RE荧光素酶报告基因载体,Ad-AP2α感染能显著提高AP2α的表达及结合DNA的能力。显性负性突变体可以表达各自的突变体,EMSA结果显示Ad-dnAP2α-△bHLH组能显著抑制AP2α结合DNA的能力,而Ad-dnAP2α-△TAD组结合的DNA探针强于对照组。荧光素酶报告基因提示AP2α过表达组能促进AP2α转录活性,而两种显性负性突变体均能抑制AP2α转录活性。重组腺病毒BMPs感染组的AP2α转录活性均有增高,其中BMP9最为显著。结论成功构建携带转录蛋白AP2α效应元件的荧光素酶报告基因载体用于检测AP2α的转录活性,并初步发现BMP9对AP2α的转录活性有明显的促进作用。
关键词
转录蛋白AP2α
荧光素酶报告基因
显性负性突变体
骨形态发生蛋白
Keywords
activator protein 2a
luciferase reporter gene
dominant negative mutants
bone morphogenetic protein
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
全反式维甲酸诱导肝癌细胞Hepa1-6成熟和分化过程中的自噬
被引量：
4
2
作者
方姝煜
崔洁洁
龚梦嘉
何昀
张敬芳
毕杨
机构
重庆医科大学附属儿童医院儿研所干细胞实验室
//
儿童
发育疾病
研
究教育部重点
实验室
//
儿童
发育重大疾病国家国际科技合作基地//儿科学
重庆
市重点
实验室
濮阳市人民
医院儿
科
重庆医科大学附属儿童医院
胃肠新生儿外科
出处
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第5期527-533,共7页
基金
重庆市自然科学基金(csct2016jcyjA0228)
文摘
目的探讨不同浓度全反式维甲酸(ATRA)对小鼠肝癌细胞Hepa1-6成熟分化及细胞自噬水平的影响。方法以小鼠肝癌细胞Hepa1-6为研究对象,分别给予0.1、1、10μmol/L浓度的ATRA处理,荧光定量PCR和Western blot检测肝细胞相关标志基因的表达,吲哚菁绿(ICG)及过碘酸-希夫(PAS)染色检测小鼠肝癌细胞Hepa1-6的成熟功能,透射电镜观测细胞连接及自噬小体,选择最适的ATRA作用浓度;Western blot检测自噬相关标志蛋白的表达,ptf LC3质粒转染细胞后共聚焦观察自噬流变化,检测自噬流是否通畅。结果相较于空白对照组,ATRA可呈浓度依赖性抑制肝前体标志蛋白AFP的表达,并促进肝细胞成熟标志ALB、CK18、TAT和Apo B的表达,ICG及PAS染色提示阳性细胞数明显增多;透射电镜结果显示ATRA诱导组的紧密连接和细胞骨架明显增多,可见高尔基复合体以及较多的自噬小体和自噬溶酶体。均以10μmol/L组最为显著,作为最适终浓度。自噬相关标志蛋白LC3-II、Beclin-1、RAB7、P62的表达不同程度增高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值明显增加(P<0.05),激光共聚焦可见10μmol/LATRA处理组细胞胞浆内绿色亮点的自噬小体及红色亮点的自噬溶酶体均较对照组明显增多。结论 ATRA可诱导小鼠肝癌细胞Hepa1-6的成熟分化,并促进细胞自噬水平增高。
关键词
原发性肝癌
全反式维甲酸
自噬
细胞分化
Keywords
primary hepatic carcinoma
all-trans retinoic acid
autophagy
cell differentiation
分类号
R735.7 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨
3
作者
龚梦嘉
李娅莎
毕杨
机构
重庆医科大学附属儿童医院儿研所干细胞实验室
出处
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2015年第2期181-186,共6页
基金
国家自然科学基金资助项目(编号:81100309)
重庆市教委科学技术研究项目(编号:KJ110301)
文摘
目的:研究转录蛋白2(activator protein 2,AP2)α在骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)9诱导小鼠间充质干细胞C3H10成骨分化中的作用及可能的分子机制。方法:重组腺病毒Ad-BMP9感染小鼠C3H10细胞,显性负性突变体AP2α-△b HLH和AP2α-△TAD抑制AP2α转录活性,通过RT-PCR、real-time PCR检测AP2α、BMP9及成骨相关基因的表达水平,Western blot检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)表达,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、茜红素染色实验观测C3H10成骨分化。结果:BMP9具有强促成骨分化的作用,对AP2α的表达水平无影响,AP2α显性负性突变体可抑制BMP9诱导的成骨基因骨钙蛋白(osteocalcin,OC)、OPN及骨保护素(osteoprotegerin,OPG)表达的增高(OC:F=56.929,P=0.000;OPN:F=54.789,P=0.000;OPG:F=159.451,P=0.000),ALP活性(F=69.776,P=0.000)及红色钙盐沉积减少。结论:BMP9可能通过影响AP2α的转录活性调控成骨分化进程。
关键词
转录蛋白AP2α
显性负性突变体
骨形态发生蛋白9
成骨分化
Keywords
activator protein 2α
dominant negative mutant
bone morphogenetic protein 9
osteogenesis differentiation
分类号
R34 [医药卫生—基础医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
AP2α荧光素酶报告基因的构建及在BMPs诱导成骨分化研究中的应用
龚梦嘉
周建武
毕杨
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
2
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职称材料
2
全反式维甲酸诱导肝癌细胞Hepa1-6成熟和分化过程中的自噬
方姝煜
崔洁洁
龚梦嘉
何昀
张敬芳
毕杨
《南方医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018
4
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职称材料
3
AP2α在BMP9诱导C3H10成骨分化中的作用及机制探讨
龚梦嘉
李娅莎
毕杨
《重庆医科大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2015
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