目的:初步研究78 k D的葡萄糖调节蛋白(the 78 k D glucose-regulated protein,GRP78)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的前S1蛋白(Pre S1)的相互作用位点。方法:利用PCR技术扩增GRP78的基因,将扩增的目的基因克隆至p W28载体质粒...目的:初步研究78 k D的葡萄糖调节蛋白(the 78 k D glucose-regulated protein,GRP78)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的前S1蛋白(Pre S1)的相互作用位点。方法:利用PCR技术扩增GRP78的基因,将扩增的目的基因克隆至p W28载体质粒,在大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)B834中表达,经过镍离子亲和层析柱纯化GRP78蛋白;将Pre S1 3个截短片段的重组质粒(p GST-Pre S1-X1/X2/X3)在B834中表达后,经过GST亲和层析柱纯化相应蛋白;利用蛋白质体外结合实验(pull down)、微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)检测GRP78与Pre S1 3个截短片段的相互作用。结果:成功构建重组质粒p W28-GRP78;获得GRP78蛋白及Pre S1 3个截短片段的融合蛋白;pull down及MST实验验证了GRP78可以与Pre S1的3个片段结合,且GRP78与GST-Pre S1-X1结合效果最好。结论:利用分子克隆技术及蛋白质表达纯化技术,获得GRP78蛋白及Pre S1截短片段的融合蛋白,并初步筛选了Pre S1与GRP78的相互作用位点,为后续研究打基础。展开更多
目的:研究肝细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制对分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)家族表达的影响。方法:利用q RT-PCR、Western blot检测分析Id家族在HBV瞬时或稳定复制的肝癌细胞中表达水平的变化,并在HB...目的:研究肝细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制对分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)家族表达的影响。方法:利用q RT-PCR、Western blot检测分析Id家族在HBV瞬时或稳定复制的肝癌细胞中表达水平的变化,并在HBV复制质粒PCH9-HBV1.1转染的正常肝细胞和HBV转基因小鼠肝组织细胞模型中进一步验证。将乙型肝炎病毒S蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶(hepatitis B virus DNA polymerase,HBp)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的过表达质粒转染HepG2细胞,检测各组与载体对照组细胞中Id家族表达水平的变化,分析比较乙肝病毒编码的4种蛋白对Id家族的调控作用。利用荧光素酶报告基因检测病毒各组分蛋白对Id蛋白启动子活性的影响。结果:瞬时转染HBV表达质粒的HepG2细胞较对照组细胞,Id1、Id3的mRNA和蛋白表达水平均降低(mRNA:t=3.952、3.189,P=0.017、0.033;蛋白:t=10.532、4.155,P=0.000、0.014);HepG2.2.15中Id1、Id3 mRNA和蛋白的表达水平较HepG2对照组均下降(m RNA:t=5.553、7.211,P=0.005、0.002;蛋白:t=4.193、3.849,P=0.014、0.018);HepAD38(Tet-)中Id1、Id3蛋白的表达量较HepAD38(Tet+)组均降低(t=3.052、3.712,P=0.038、0.021)。同时,HBV的复制可以抑制LO2细胞及小鼠肝组织中Id1、Id3的表达(mRNA:t=14.564、3.281、3.489、3.495,P=0.000、0.030、0.025、0.025;蛋白:t=5.651、5.336、4.948、5.149,P=0.005、0.006、0.008、0.007)。转染HBV病毒各编码蛋白质粒的HepG2细胞中,HBc组Id1、Id3较载体对照组的mRNA表达水平降低最明显(77.7%、76.2%,F=9.945、37.528,t=6.481、10.915,P=0.000、0.000),Western blot结果显示HBx组Id1、Id3蛋白表达量下降最明显(86.2%、68.4%,F=38.225、7.159,t=12.550、5.295,P=0.000、0.001)。双荧光素酶报告基因检测结果表明,HBc组Id1、Id3启动子活性较对照组降幅最大(62.2%、56.3%,F=16.530、5.210,t=5.442、3.222,P=0.000、0.019)。结论:乙型肝炎病毒可以抑制肝组织、细胞中Id1及Id3的表达,其中HBc对Id1、Id3 m RNA的下调最明显,HBx则对Id1、Id3蛋白水平上的抑制作用最明显。展开更多
文摘目的:研究肝细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制对分化抑制因子(inhibitor of differentiation,Id)家族表达的影响。方法:利用q RT-PCR、Western blot检测分析Id家族在HBV瞬时或稳定复制的肝癌细胞中表达水平的变化,并在HBV复制质粒PCH9-HBV1.1转染的正常肝细胞和HBV转基因小鼠肝组织细胞模型中进一步验证。将乙型肝炎病毒S蛋白(hepatitis B virus S protein,HBs)、乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)、乙型肝炎病毒DNA聚合酶(hepatitis B virus DNA polymerase,HBp)、乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)的过表达质粒转染HepG2细胞,检测各组与载体对照组细胞中Id家族表达水平的变化,分析比较乙肝病毒编码的4种蛋白对Id家族的调控作用。利用荧光素酶报告基因检测病毒各组分蛋白对Id蛋白启动子活性的影响。结果:瞬时转染HBV表达质粒的HepG2细胞较对照组细胞,Id1、Id3的mRNA和蛋白表达水平均降低(mRNA:t=3.952、3.189,P=0.017、0.033;蛋白:t=10.532、4.155,P=0.000、0.014);HepG2.2.15中Id1、Id3 mRNA和蛋白的表达水平较HepG2对照组均下降(m RNA:t=5.553、7.211,P=0.005、0.002;蛋白:t=4.193、3.849,P=0.014、0.018);HepAD38(Tet-)中Id1、Id3蛋白的表达量较HepAD38(Tet+)组均降低(t=3.052、3.712,P=0.038、0.021)。同时,HBV的复制可以抑制LO2细胞及小鼠肝组织中Id1、Id3的表达(mRNA:t=14.564、3.281、3.489、3.495,P=0.000、0.030、0.025、0.025;蛋白:t=5.651、5.336、4.948、5.149,P=0.005、0.006、0.008、0.007)。转染HBV病毒各编码蛋白质粒的HepG2细胞中,HBc组Id1、Id3较载体对照组的mRNA表达水平降低最明显(77.7%、76.2%,F=9.945、37.528,t=6.481、10.915,P=0.000、0.000),Western blot结果显示HBx组Id1、Id3蛋白表达量下降最明显(86.2%、68.4%,F=38.225、7.159,t=12.550、5.295,P=0.000、0.001)。双荧光素酶报告基因检测结果表明,HBc组Id1、Id3启动子活性较对照组降幅最大(62.2%、56.3%,F=16.530、5.210,t=5.442、3.222,P=0.000、0.019)。结论:乙型肝炎病毒可以抑制肝组织、细胞中Id1及Id3的表达,其中HBc对Id1、Id3 m RNA的下调最明显,HBx则对Id1、Id3蛋白水平上的抑制作用最明显。
