DNA修复基因XRCC1的194位点多态性与晚期非小细胞肺癌铂类化疗敏感性关系的Meta分析 被引量：11

1

作者 李文骏 向华 马庆波 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第21期2417-2420,共4页

目的探讨晚期非小细胞肺癌患者中XRCC1基因多态性与铂类化疗敏感性的关系。方法电子检索1990年1月—2010年1月VIP、CNKI、CBM、万方数据库、PubMed及EBSCO数据库,收集有关晚期非小细胞肺癌患者的XRCC1 Arg194Trp基因多态性与铂类化疗敏... 目的探讨晚期非小细胞肺癌患者中XRCC1基因多态性与铂类化疗敏感性的关系。方法电子检索1990年1月—2010年1月VIP、CNKI、CBM、万方数据库、PubMed及EBSCO数据库,收集有关晚期非小细胞肺癌患者的XRCC1 Arg194Trp基因多态性与铂类化疗敏感性的文献,以非条件Logistic回归校正年龄、性别、吸烟状况等混杂因素后的OR值为效应指标,对文献进行评价筛选、异质性检验。采用RevMan 4.3软件进行Meta分析,计算合并OR值及其95%可信区间(CI)。结果本次Meta共纳入7篇文献,累计病例915例。其中Arg/Trp和Trp/Trp等位基因同Arg/Arg比较,OR值分别为2.63[95%CI(1.96,3.53)]、2.27[95%CI(1.45,3.56)]。结论晚期非小细胞肺癌患者XRCC1基因第194位变异型(Arg/Trp或Trp/Trp)对铂类化疗敏感性优于野生型(Arg/Arg)。 展开更多

关键词 XRCC1 多态性 单核苷酸 癌 非小细胞肺 铂化合物 META分析

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外源性重组S100A6蛋白对5株转化细胞系的增殖、迁移能力及β-catenin水平的影响 被引量：2

2

作者 马闻 李星星 +4 位作者 王胜 游莉 郭元元 徐兰兰 周兰 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期1321-1326,共6页

目的:探讨S100A6对5种转化细胞系株(HEK293、9HTE、CHO、MEF和C3H10T1/2)的增殖、迁移能力和β-catenin水平的影响。方法:通过转化质粒pMoluc-GST-hS100A6到大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组S100A6蛋白,为后续实验提供材料;MTT法检测细... 目的:探讨S100A6对5种转化细胞系株(HEK293、9HTE、CHO、MEF和C3H10T1/2)的增殖、迁移能力和β-catenin水平的影响。方法:通过转化质粒pMoluc-GST-hS100A6到大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组S100A6蛋白,为后续实验提供材料;MTT法检测细胞增殖,细胞划痕和Transwell法检测细胞迁移,免疫细胞化学法及Western-blotting检测β-catenin表达水平。结果:①通过IPTG诱导表达,从大肠杆菌中收获了高纯度重组S100A6(GST-S100A6);②外源性重组S100A6对作为阳性对照的肿瘤细胞系——人骨肉瘤细胞143B的增殖及迁移均有抑制作用(P<0.05),而对5株转化细胞系的增殖及迁移均无显著影响(P>0.05);③免疫细胞化学法和Western-blotting一致揭示重组S100A6可上调5株转化细胞系的β-catenin水平(P<0.05)。结论:S100A6对5株转化细胞系的增殖、迁移无明显影响,但可上调此5株转化细胞系Wnt/β-catenin水平。 展开更多

关键词 S100A6 转化细胞系 细胞增殖 细胞迁移 Β-CATENIN

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硼替佐米联合化疗对多发性骨髓瘤的疗效与相关血液学指标分析

3

作者 杨再林 张勇 +10 位作者 张伶 夏顺中 裴莉 符刚 秦大兵 白海雁 田小波 朱艳 陈润 徐双年 陈洁平 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期975-978,共4页

目的观察硼替佐米治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的疗效及血液学指标的改变。方法2007年4月至2009年12月本院血液病中心收治的18例多发性骨髓瘤患者,其中7例初治患者与11例复发难治患者,均采用以硼替佐米为主的联合方案化疗,3周... 目的观察硼替佐米治疗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的疗效及血液学指标的改变。方法2007年4月至2009年12月本院血液病中心收治的18例多发性骨髓瘤患者,其中7例初治患者与11例复发难治患者,均采用以硼替佐米为主的联合方案化疗,3周为1个疗程,每例患者至少接受1～6个疗程的治疗。观察疗效及相关血液学指标的改变。结果7例初治患者中5例患者完全缓解(CR),后1例行自体造血干细胞移植,2例患者获得部分缓解(PR)。11例复发难治患者中7例达CR,2例达PR,2例无效。患者浆细胞比例、血清总蛋白含量(TP)、球蛋白(G)、M蛋白含量、尿蛋白、β2-微球蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)等随化疗周期呈明显下降趋势,患者血红蛋白(Hb)、白蛋白(Alb)含量、A/G比值等呈明显的上升趋势。不良反应多为1～2级,常为一过性,包括周围神经病变(4/18)、骨痛(1/18)、胃肠道反应(8/18),经对症治疗后均好转。结论硼替佐米对初发及难治复发多发性骨髓瘤的治疗均有较好疗效,对治疗相关不良反应患者可耐受,相关血液学指标改善明显。 展开更多

关键词 多发性骨髓瘤 硼替佐米 疗效 不良反应 血液学指标

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电化学极化玻碳电极构建的葡萄糖生物传感器 被引量：3

4

作者 张伟 甄生航 +3 位作者 谢国明 刁奇智 罗鹏 郑军 《传感器与微系统》 CSCD 北大核心 2011年第8期110-112,119,共4页

在硝酸溶液中电化学极化处理玻碳电极（GCE）,以硫堇（TH）为电子介体,通过金—硫、金—氮共价键作用和静电吸附作用将纳米金（GNPs）、葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根过氧化物酶（HRP）修饰于电极上,最后在电极上滴涂Nafion水溶液制备抗干... 在硝酸溶液中电化学极化处理玻碳电极（GCE）,以硫堇（TH）为电子介体,通过金—硫、金—氮共价键作用和静电吸附作用将纳米金（GNPs）、葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根过氧化物酶（HRP）修饰于电极上,最后在电极上滴涂Nafion水溶液制备抗干扰膜并固定酶电极,构建了一种新型双酶葡萄糖生物传感器。实验结果表明：电化学极化处理电极提高了生物传感器的性能,传感器响应电流与葡萄糖浓度在1×10-3~18×10-3mol/L范围内有良好的线性关系,R=0.991 7,检出限为5×10-5mol/L。该生物传感器具有良好的灵敏度、抗干扰性和稳定性,可以重复使用。 展开更多

关键词 葡萄糖 电化学极化 硫堇 生物传感器

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高效液相色谱-程序波长紫外检测法同时测定血浆中的色氨酸及其代谢物 被引量：12

5

作者 甄乾娜 黄小兰 +2 位作者 张晓清 班艳娜 丁敏 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期435-438,共4页

建立了一种高效液相色谱-程序波长紫外检测法同时测定血浆中色氨酸(Trp)及其主要代谢产物犬尿氨酸(Kyn)和5-羟色胺(5-HT)。以茶碱为内标(IS),采用BDS-Hypersil-C8柱(150 mm×4.6 mm,5μm)分离。流动相为10 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.... 建立了一种高效液相色谱-程序波长紫外检测法同时测定血浆中色氨酸(Trp)及其主要代谢产物犬尿氨酸(Kyn)和5-羟色胺(5-HT)。以茶碱为内标(IS),采用BDS-Hypersil-C8柱(150 mm×4.6 mm,5μm)分离。流动相为10 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.5)-乙腈(94∶6,v/v),流速为0.6 mL/min;柱温为25℃;紫外检测波长设定:Kyn和IS为360 nm,5-HT为220 nm,Trp为302 nm。3种物质的平均回收率为87%～113%;线性范围分别为3.97～400μmol/L(Trp),0.421～20.2μmol/L(Kyn),4.36～980 nmol/L(5-HT);检出限分别为0.134μmol/L(Trp),0.016 0μmol/L(Kyn),2.03 nmol/L(5-HT)。利用该方法对15例抑郁症患者和15例健康志愿者的血浆进行测定,结果表明两组间Trp的代谢存在显著的差异。 展开更多

关键词 高效液相色谱法 色氨酸 犬尿氨酸 5-羟色胺 血浆

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Notch信号通路在骨形态发生蛋白9诱导的多潜能干细胞成骨分化中的作用 被引量：9

6

作者 刘强 翁亚光 +2 位作者 徐道晶 罗敏 唐敏 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第23期2492-2496,共5页

目的初步探讨Notch信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导多潜能干细胞成骨分化的作用和机制。方法腺病毒表达载体(AdBM P9/AdGFP、AdHey1/AdRFP)和BMP9/GFP条件培养基处理C2C12细胞,细胞化学染色和活性定... 目的初步探讨Notch信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导多潜能干细胞成骨分化的作用和机制。方法腺病毒表达载体(AdBM P9/AdGFP、AdHey1/AdRFP)和BMP9/GFP条件培养基处理C2C12细胞,细胞化学染色和活性定量检测早期成骨标志物碱性磷酸酶(ALP),定量RT-PCR检测Notch信号通路靶基因Hey1,以了解Hey1在AdBMP9介导的成骨分化作用中的表达和作用;采用细胞密度实验和Notch信号通路抑制剂(DAPT)检测Notch信号通路对成骨的影响;在AdBMP9/AdGFP处理下,检测细胞上Notch信号通路配体、受体表达变化。结果 AdBMP9作用下,1、3、5、7dALP活性持续增加(P<0.05);Hey1一过性升高,其与AdBMP9呈剂量依赖性;Hey1可协助BMP9成骨(P<0.05),不能单独起效。80%和40%细胞密度组ALP量和Hey1表达均高于20%组(P<0.05);DAPT组中ALP活性明显降低(P<0.05);在AdBMP9作用下,Notch信号通路配受体有不同程度的上调,其中受体Notch4和配体Jag-1上调最为明显(分别为11.3倍和5.1倍)。结论 Notch信号通路参与BMP9介导的多潜能干细胞成骨分化,其可能的机制是BMP9通过诱导Notch通路配体、受体表达上调使Hey1升高,后者协同成骨。 展开更多

关键词 NOTCH信号通路 骨形态发生蛋白9 多潜能干细胞 发状分裂相关增强子-1 DAPT

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带核定位信号的RARα与谷氨酸氨连接酶蛋白相互作用的胞内外验证 被引量：4

7

作者 吴燕 刘北忠 +4 位作者 王翀 钟梁 朱丹 王春光 金丹婷 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期468-471,共4页

目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活... 目的通过胞内外实验验证谷氨酸氨连接酶(GLUL)与带有核定位信号的维甲酸受体α(NLS-RARα)之间的相互作用。方法将表达GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白的两种重组表达质粒共同转化入AH109酵母菌,采用一对一的酵母双杂交技术验证它们在活细胞内的相互作用;通过构建GLUL及NLS-RARα蛋白标签融合表达载体,共转染至人胚肾HEK293细胞,利用免疫共沉淀技术在细胞外验证它们之间的相互作用。结果 GLUL靶蛋白和NLS-RARα诱饵蛋白质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色的阳性克隆;GLUL蛋白及NLS-RARα标签融合表达载体构建成功,共同转染至HEK293细胞,采用抗HA多克隆抗体免疫沉淀HA-NLS-RARα相互作用蛋白复合物后,抗c-Myc单克隆抗体免疫印迹检测,检测到GLUL-cMyc蛋白。结论采用酵母双杂交和免疫共沉淀技术成功地在胞内外验证了GLUL与NLS-RARα之间存在特异性的相互作用。 展开更多

关键词 维甲酸受体Α 核定位信号 谷氨酸氨连接酶 蛋白质相互作用 双杂交系统技术 免疫共沉淀

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高效液相色谱-串联质谱法测定妊娠肝内胆汁淤积患者血清牛磺结合型胆汁酸 被引量：6

8

作者 邓文平 王文娟 +2 位作者 邵勇 邓丹 丁敏 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期732-734,共3页

目的:研究妊娠肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)患者血清中牛磺结合型胆汁酸的变化。方法:收集ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎患者和正常孕妇血清,经固相萃取,采用高效液相色谱-串联质谱(Highperfor-manc... 目的:研究妊娠肝内胆汁淤积症(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)患者血清中牛磺结合型胆汁酸的变化。方法:收集ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎患者和正常孕妇血清,经固相萃取,采用高效液相色谱-串联质谱(Highperfor-mance liquid chromatography-tendem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)法测定牛磺结合型胆汁酸的含量。结果:ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎患者血清中牛磺胆酸(Taurocholicacid,TCA)、牛磺鹅脱氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(Taurodeoxycholic acid,TDCA)分别比正常孕妇有10倍、5倍和3倍以上的显著性增高(P<0.01)。ICP及ICP伴糖尿病、ICP伴病毒性肝炎三组间TCA和TCDCA的差异均有显著性(P<0.05)。结论:ICP患者有特征的血清牛磺结合型胆汁酸变化。 展开更多

关键词 胆汁酸 血清 妊娠肝内胆汁淤积症 高效液相色谱 串联质谱

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核仁磷酸蛋白突变基因表达对NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响 被引量：4

9

作者 邵会媛 杨再林 +5 位作者 高玉洁 苗宗玉 覃凤娴 陈先春 蔡晓钟 张伶 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期783-786,共4页

目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western... 目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western blot检测NPM突变基因和蛋白的表达。MTT、克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平的改变,并通过对周期调控因子p21及凋亡相关分子Caspase-3活性检测,初步探讨NPM突变参与细胞恶性增殖的分子机制。结果建立了稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞株。NPM-mA实验组细胞较对照组细胞增殖能力及平板克隆形成率明显增高(P<0.05);甲基纤维素集落形成实验显示各组细胞在甲基纤维素上均不能形成集落;与对照组比较,NPM-mA实验组细胞中G1期细胞比例(42.27±0.86)%显著减低(P<0.01),S期细胞比例(43.08±0.74)%显著增加(P<0.01),同时伴有p21 mRNA水平下降,稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞凋亡率(1.00±0.13)%明显降低(P<0.01),Caspase-3活性(0.784±0.080)下降(P<0.01)。结论NPM突变基因可促进NIH3T3细胞体外增殖,抑制细胞凋亡发生。 展开更多

关键词 核仁磷酸蛋白 突变 细胞增殖 细胞凋亡 NIH3T3细胞

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结肠癌中S100A2的表达及其与Wnt/β-catenin通路的相关性 被引量：6

10

作者 杨勇 朱明才 +1 位作者 段亮 周兰 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第15期1576-1579,共4页

目的探讨钙结合蛋白S100A2与Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin、pGSK-3β在人结肠癌组织中的表达和意义以及相关性。方法采用免疫组化和Western blot方法检测42例结肠癌及癌旁正常组织中S100A2、β-catenin和pGSK-3β的表达情... 目的探讨钙结合蛋白S100A2与Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin、pGSK-3β在人结肠癌组织中的表达和意义以及相关性。方法采用免疫组化和Western blot方法检测42例结肠癌及癌旁正常组织中S100A2、β-catenin和pGSK-3β的表达情况,分析它们与结肠癌临床病理参数的关系,进一步采用Pearson等级相关分析其相关性。结果①免疫组化显示S100A2和β-catenin主要定位于癌细胞核和(或)细胞质,而pGSK-3β主要定位于癌细胞质;②Western blot结果显示S100A2、β-catenin和pGSK-3β在结肠癌组织中均高表达,明显高于癌旁正常组织(P<0.01),三者在结肠癌DukesC+D期中的表达明显高于A+B期(P<0.01),在有淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组(P<0.01);③S100A2分别与β-catenin、pGSK-3β的表达呈明显正相关(r=0.637,P<0.01;r=0.626,P<0.01)。结论 S100A2可能通过调节Wnt/β-catenin通路关键分子而参与结肠癌的发生、发展。 展开更多

关键词 结肠癌 S100A2 WNT/Β-CATENIN

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PLCε shRNA质粒构建及功能鉴定 被引量：2

11

作者 郭永灿 罗春丽 +3 位作者 颜令 欧俐苹 赵懿 蔡晓钟 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第17期1657-1660,共4页

目的构建PLCε基因的shRNA表达载体及其功能鉴定。方法设计并合成针对PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列,插入绿色荧光蛋白质粒真核表达载体pGenesil中构建重组载体pGenesil-PLCε。重组载体经酶切、测序鉴定后转染膀胱癌细胞,RT-PCR及Wester... 目的构建PLCε基因的shRNA表达载体及其功能鉴定。方法设计并合成针对PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列,插入绿色荧光蛋白质粒真核表达载体pGenesil中构建重组载体pGenesil-PLCε。重组载体经酶切、测序鉴定后转染膀胱癌细胞,RT-PCR及Western blot检测对膀胱癌细胞株PLCε的抑制作用,流式细胞术(FCM)及MTT检测其对膀胱癌细胞株增殖活力影响。结果成功构建了针对2个PLCε基因的shRNA表达载体。RT-PCR、Western blot检测结果显示:2个重组质粒载体转染T24细胞株后对PLCεmRNA及对PLCε蛋白表达均有明显抑制,流式细胞术结果表明细胞阻滞于G0/G1期,MTT检测表明重组的载体质粒明显抑制T24细胞增殖活力。结论针对PLCε基因的shRNA能有效抑制膀胱癌T24细胞中PLCε基因的表达及膀胱癌细胞增殖。 展开更多

关键词 载体构建 膀胱癌 SHRNA PLCε

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带核定位信号的维甲酸受体α与Ubiquilin 1蛋白相互作用的验证(英文) 被引量：2

12

作者 朱丹 王翀 +3 位作者 刘北忠 吴燕 钟梁 王春光 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期649-654,共6页

目的:验证带有核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal-retinoic acid receptorα,NLS-RARα)与Ubiquilin 1(UBQLN1)蛋白之间的相互作用。方法:将表达NLS-RARα诱饵蛋白和UBQLN1靶蛋白的两种重组表达质粒pGBKT7-NLS-RAR... 目的:验证带有核定位信号的维甲酸受体α(nuclear localization signal-retinoic acid receptorα,NLS-RARα)与Ubiquilin 1(UBQLN1)蛋白之间的相互作用。方法:将表达NLS-RARα诱饵蛋白和UBQLN1靶蛋白的两种重组表达质粒pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1共转化AH109酵母菌,通过酵母双杂交技术验证两者在活细胞内的相互作用;构建真核细胞表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-UBQLN1,经酶切鉴定后,共转染HEK293细胞,利用抗HA多克隆抗体沉淀,抗Myc单克隆抗体检测验证他们之间的相互作用。结果:pGBKT7-NLS-RARα及pACT2-UBQLN1质粒共转化AH109酵母菌后,可见蓝色阳性克隆;构建的重组表达载体pCMV-HA-NLS-RARα和pCMV-Myc-UBQLN1经酶切鉴定成功,转染HEK293细胞后,用免疫共沉淀技术检测到Myc-UBQLN1蛋白的表达。结论:酵母双杂交和免疫共沉淀技术可验证NLS-RARα与UBQLN1之间存在相互作用。 展开更多

关键词 酵母双杂交 免疫共沉淀 蛋白质相互作用

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hS100A6抑制卵巢癌细胞HO8910和HO8910 PM增殖、促进凋亡并上调其Wnt/β-catenin活性 被引量：2

13

作者 邹正渝 陈英华 +7 位作者 孙双双 黎玉叶 叶立伟 段亮 武睿 杨霞 罗进勇 周兰 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期214-218,共5页

目的研究hS100A6(human S100A6)对人卵巢癌细胞系(低转移系HO8910和高转移系HO8910 PM)增殖、凋亡和Wnt/β-catenin信号途径的影响。方法通过MTT以及台盼蓝染色检测细胞增殖的变化;Hoechst检测细胞凋亡的变化;提取细胞总蛋白及核蛋白Wes... 目的研究hS100A6(human S100A6)对人卵巢癌细胞系(低转移系HO8910和高转移系HO8910 PM)增殖、凋亡和Wnt/β-catenin信号途径的影响。方法通过MTT以及台盼蓝染色检测细胞增殖的变化;Hoechst检测细胞凋亡的变化;提取细胞总蛋白及核蛋白Western blot检测hS100A6对β-catenin的影响。结果 MTT及台盼蓝染色结果显示hS100A6抑制HO8910细胞和HO8910 PM细胞的增殖(P<0.05),Hoechst染色结果显示hS100A6同时促进这两系细胞的凋亡(P<0.05);Western blot显示hS100A6增加β-catenin的水平并促进其发生核转位。结论 hS100A6能抑制人卵巢癌细胞系HO8910和HO8910 PM增殖,促进其凋亡,同时激活Wnt/β-catenin信号途径。 展开更多

关键词 S100A6 卵巢癌 Wnt/β-catenin信号途径

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构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体 被引量：3

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作者 韦永琼 曾照芳 陈力学 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期2414-2417,2420,共5页

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序... 目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。 展开更多

关键词 PTEN基因 RNA干扰 腺病毒 表达载体

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骨髓间充质干细胞Hey1基因表达水平荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：2

15

作者 刘强 翁亚光 +1 位作者 唐敏 罗敏 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第6期897-899,共3页

目的:建立骨髓间充质干细胞中Notch信号通路靶基因Hey1表达水平的荧光定量RT-PCR方法。方法:培养骨髓间充质干细胞(C_2C_(12)),提取总RNA,验证内参基因β-actin和目的基因Hey1的扩增效率,优化PCR条件,分析扩增曲线、融解曲线,凝胶电泳... 目的:建立骨髓间充质干细胞中Notch信号通路靶基因Hey1表达水平的荧光定量RT-PCR方法。方法:培养骨髓间充质干细胞(C_2C_(12)),提取总RNA,验证内参基因β-actin和目的基因Hey1的扩增效率,优化PCR条件,分析扩增曲线、融解曲线,凝胶电泳验证定量PCR产物。结果:内参基因β-actin和目的基因Hey1扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1),提示可以使用比较Ct法对Hey1进行相对定量分析;扩增曲线、融解曲线及凝胶电泳结果提示PCR产物特异性好。结论:本研究所建立的用于Hey1基因表达分析的定量RT-PCR检测方法,准确可靠,可用于Bmp9和Notch信号通路的研究。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 Hey1 荧光定量RT-PCR

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S100A4上调表达对HBL-100和MCF-7细胞增殖和侵袭的影响 被引量：1

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作者 黎玉叶 孙双双 +7 位作者 邹正渝 叶立伟 段亮 武睿 陈娴 杨霞 罗进勇 周兰 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第13期1388-1393,共6页

目的探讨S100A4对人乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移、侵袭和凋亡以及对这两种细胞中的Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信号途径的影响。方法用表达S100A4的重组腺病毒(AdS100A4)感染细胞,采用MTT、划痕愈合实验、Transwel... 目的探讨S100A4对人乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌细胞MCF-7的增殖、迁移、侵袭和凋亡以及对这两种细胞中的Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信号途径的影响。方法用表达S100A4的重组腺病毒(AdS100A4)感染细胞,采用MTT、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验和Hoechst染色分别检测细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡活性的变化;同时通过PCR和Western blot检测S100A4对两种细胞中Wnt/β-catenin及Wnt/JNK信号途径的影响。结果 (1)HBL-100和MCF-7细胞在第4天的增殖分别增加53.3%和59.1%(P<0.05);24 h的划痕愈合率分别增加73.6%和64.8%(P<0.05);S100A4对HBL-100的穿膜细胞数无明显影响(P>0.05),但使MCF-7的穿膜细胞数增加1倍(P<0.05);HBL-100和MCF-7细胞在48 h的凋亡率分别减少约30%和36%(P<0.05);(2)感染AdS100A4后的HBL-100和MCF-7细胞中β-catenin较GFP组分别增加49%和55%(P<0.05);尽管两种细胞中t-GSK3β无显著改变,但是其p-GSK3β却较GFP组分别增加73%和55%(P<0.05),c-Myc的表达量分别增加38%和30%(P<0.05);(3)S100A4对HBL-100中的t-JNK、p-JNK和c-Fos的mRNA以及MCF-7细胞的t-JNK的水平均无影响,但是,却致MCF-7中的p-JNK增加39%(P<0.05),c-Fos的mRNA增加32.3%(P<0.05)。结论 S100A4可促进HBL-100和MCF-7细胞的增殖、迁移,并抑制这两种细胞的凋亡;增强MCF-7细胞的侵袭能力。S100A4可增强HBL-100和MCF-7细胞中的Wnt/β-catenin信号途径活性以及MCF-7细胞中的Wnt/JNK信号途径活性。 展开更多

关键词 S100A4 乳腺癌 细胞行为 WNT信号途径

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shRNA靶向干扰COX-2促进人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡 被引量：1

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作者 陈光辉 涂植光 +5 位作者 孔飞飞 邱欣欣 成凤 匡文斌 李朴 刘预 《激光杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期64-66,共3页

目的:探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡的促进作用。方法:重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,成瘤4周后处死裸鼠,绘制肿瘤... 目的:探讨重组干扰质粒pshRNA-COX-2对人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤肿瘤细胞凋亡的促进作用。方法:重组干扰质粒pshRNA-COX-2转染Hep3B细胞并筛选后,将被成功转染的Hep3B细胞种植于裸鼠皮下,测量肿瘤大小,成瘤4周后处死裸鼠,绘制肿瘤生长曲线,RT-PCR和Western blot检测肿瘤组织中COX-2 mRNA和蛋白表达,电镜观察和TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡。结果:与空白组相比,干扰组肿瘤组织中COX-2 mRNA和蛋白表达抑制率分别为48.5%和61.4%。干扰组最终瘤体大小明显小于阴性组和空白组<P<0.01)。电镜观察显示干扰组凋亡细胞增多,TUNEL法显示干扰组肿瘤细胞凋亡指数明显高于阴性组和空白组(P<0.01)。结论:pshRNA-COX-2通过靶向抑制COX-2基因表达,可明显抑制人肝癌细胞Hep3B裸鼠皮下移植瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡。 展开更多

关键词 肝癌 环氧化酶-2 重组干扰质粒pshRNA-COX-2 皮下移植瘤 凋亡

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固相萃取-气相色谱-质谱法检测尿液中乙基葡萄糖醛酸苷 被引量：1

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作者 于天晓 李青 +2 位作者 万涛 李剑波 丁世家 《色谱》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期172-175,共4页

建立了固相萃取(SPE)-气相色谱-质谱(GC-MS)检测尿液样本中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的方法。1 mL尿液样本经100μL 3 mol/L盐酸去蛋白后,通过SPE法提取上清液中的目标物质及内标,提取物经衍生化后,采用GC-MS检测,选择离子模式(SIM)扫描,... 建立了固相萃取(SPE)-气相色谱-质谱(GC-MS)检测尿液样本中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)的方法。1 mL尿液样本经100μL 3 mol/L盐酸去蛋白后,通过SPE法提取上清液中的目标物质及内标,提取物经衍生化后,采用GC-MS检测,选择离子模式(SIM)扫描,内标法定量分析。该方法在0.1～3.2 mg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数(r)为0.992 1,检出限为28.4μg/L,绝对回收率范围为92.5%～108.7%,相对标准偏差均小于5%。实验结果表明该法灵敏度高、特异性好、分析结果准确可靠,适用于法医学鉴定和临床检验中对EtG的分析测定。 展开更多

关键词 固相萃取 气相色谱-质谱 衍生化 乙基葡萄糖醛酸苷

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特异性靶向巨噬细胞表达PR39的重组腺病毒抗胞内菌感染能力检测 被引量：1

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作者 余雪梅 文阳安 +4 位作者 李朴 孔飞飞 陈光辉 邱欣欣 涂植光 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期993-996,共4页

目的检测巨噬细胞靶向表达PR39的重组腺病毒Ad-SP/PR39在抗胞内菌方面的作用。方法重组腺病毒Ad-SP/PR39经CsCl密度梯度离心纯化,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GPF的表达并检测重组腺病毒的滴度。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7、... 目的检测巨噬细胞靶向表达PR39的重组腺病毒Ad-SP/PR39在抗胞内菌方面的作用。方法重组腺病毒Ad-SP/PR39经CsCl密度梯度离心纯化,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GPF的表达并检测重组腺病毒的滴度。Ad-SP/PR39感染小鼠巨噬细胞RAW264.7、人结肠癌细胞株Lovo、人肝癌细胞株HepG2、人乳腺癌细胞株ZR-75-30和非洲绿猴肾细胞株COS-7后,经RT-PCR和免疫细胞化学检测PR39的靶向表达特异性。将含Ad-SP/PR39的RAW264.7细胞裂解液作用于减毒结核分枝杆菌(BCG),检测其体外杀灭结核杆菌BCG的能力。另取RAW264.7细胞,吞噬BCG后,加入Ad-SP/PR39感染该细胞并检测细胞内活菌量,以观察其细胞内杀菌作用。结果经纯化后的重组腺病毒滴度可达5×1011efu/ml,能够有效感染小鼠巨噬细胞RAW264.7等多种细胞株。RT-PCR及免疫细胞化学技术检测各株细胞转录水平表达情况显示小鼠巨噬细胞RAW264.7能高效表达抗菌肽PR39,而其他细胞株几乎没有表达。与感染对照腺病毒Ad-C的RAW264.7细胞相比,转染Ad-SP/PR39的细胞显示出了更强的抗菌活性[BCG活菌数分别为(8.5±1.4)×106、(6.9±1.8)×106cfu/ml,P<0.05)],且能有效吞噬并杀灭胞内菌。结论本课题组构建的重组腺病毒能够靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因,发挥抗胞内菌作用,为抗菌肽在胞内菌感染治疗中的应用开辟了新思路。 展开更多

关键词 基因表达 腺病毒科 巨噬细胞

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操纵子comCDE调控肺炎链球菌转化的分子机制研究

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作者 袁泰先 朱兴华 +5 位作者 吴凯峰 尹楠林 胥文春 王虹 尹一兵 张雪梅 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第11期1462-1465,共4页

目的:探讨操纵子comCDE对调控肺炎链球菌转化的分子机制。方法:将D39野生菌株与comE基因缺陷菌株(△comE)分别用感受态刺激因子(Competence-stimulating peptide,CSP)诱导转化,记录不同时间点的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRN... 目的:探讨操纵子comCDE对调控肺炎链球菌转化的分子机制。方法:将D39野生菌株与comE基因缺陷菌株(△comE)分别用感受态刺激因子(Competence-stimulating peptide,CSP)诱导转化,记录不同时间点的转化率,并采用FQ-PCR技术检测其comE的mRNA表达水平,并通过双向电泳及图像分析比较CSP诱导后不同时间点的蛋白质表达谱差异及野生菌株与△comE菌株的蛋白质表达谱差异。结果:D39菌株在CSP诱导后不同时间点都能发生转化,其中0 min时转化率最高,其comE的mRNA表达量在CSP诱导10 min后表达显著增加,20 min时迅速回落(P<0.05)。△comE菌株不能被CSP诱导发生转化。蛋白质组学研究显示,△comE菌株有6个蛋白较D39菌株的表达量显著增加;CSP诱导10 min时有6个蛋白表达显著增加,而在20 min时又迅速回落;二者有2个蛋白相同;有1个蛋白在加入CSP后表达显著降低。结论:基因comE的存在是CSP诱导转化必需的,CSP诱导转化可能有非comE依赖途径,而comE可能有除转化以外调控功能,且不依赖于CSP。 展开更多

关键词 肺炎链球菌 转化 操纵子comCDE 双向凝胶电泳

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