目的:探讨洋椿苦素对骨关节炎的治疗效果及其作用机制。方法:使用软骨细胞系C28/I2作为体外研究对象,采用MTT法检测洋椿苦素的细胞毒性,使用Western blot和免疫荧光检测洋椿苦素对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin...目的:探讨洋椿苦素对骨关节炎的治疗效果及其作用机制。方法:使用软骨细胞系C28/I2作为体外研究对象,采用MTT法检测洋椿苦素的细胞毒性,使用Western blot和免疫荧光检测洋椿苦素对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的抑制作用和对自噬的激活效果;选用C57BL/6J小鼠(n=40)建立右膝骨关节炎模型,同只小鼠的左膝作为正常对照,经腹腔分别给以洋椿苦素(n=20)和生理盐水(n=20)治疗后,利用Western blot、免疫组化、免疫荧光、番红O染色、HE染色、软骨损伤半定量评分系统及炎症分级系统,检测洋椿苦素对mTOR的抑制效果、自噬的激活情况、对软骨的保护和滑膜炎症抑制的效果。结果:(1)洋椿苦素可抑制C28/I2细胞mTOR的Ser-2448磷酸化位点,同时抑制核糖体S6蛋白激酶磷酸化(ribosomal protein S6,rpS6)的Thr-389和Ser-371位点,其最佳剂量为40μmol/L(Ser-2448:t=13.42,P=0.000;Thr-389:t=19.06,P=0.000;Ser-371:t=9.52,P=0.000),最佳作用时间为24 h(Ser-2448:t=34.82,P=0.000;Thr-389:t=3.14,P=0.007;Ser-371:t=19.32,P=0.000);(2)洋椿苦素可促进C28/I2细胞LC3II/LC3I的比值(t=8.15,P=0.002),并增加自噬小体阳性细胞的数量(t=9.71,P=0.000);(3)在骨关节炎中,洋椿苦素可抑制mTOR的磷酸化水平(t=19.03,P=0.005)及rpS6表达阳性的细胞数量(t=27.97,P=0.000),并增加LC3II/LC3I表达水平(t=24.65,P=0.000)和LC3表达阳性的细胞数量(t=33.89,P=0.000);(4)洋椿苦素可降低骨关节炎模型中关节软骨的损伤程度(t=8.32,P=0.009),增加软骨细胞的密度(F=3.59,P=0.013),抑制具有I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motifs 5,ADAMTS-5)的表达(F=1.82,P=0.002);(5)在骨关节炎模型的滑膜组织中,洋椿苦素可通过对白介素-1β(Interleukine-1 beta,IL-1β)的抑制(F=3.20,P=0.000)从而抑制滑膜组织中的炎症反应(F=5.44,P=0.029)。结论:洋椿苦素作为一种潜在的m TOR抑制剂,在小鼠模型中可通过激活自噬降低关节软骨的损伤并保护软骨细胞,还可通过对ADAMTS-5和IL-1β的抑制实现对细胞外基质的保护和炎症的抑制,但对骨关节炎中软骨的损伤的保护效果及机制还需进一步研究。展开更多
文摘目的:探讨洋椿苦素对骨关节炎的治疗效果及其作用机制。方法:使用软骨细胞系C28/I2作为体外研究对象,采用MTT法检测洋椿苦素的细胞毒性,使用Western blot和免疫荧光检测洋椿苦素对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)的抑制作用和对自噬的激活效果;选用C57BL/6J小鼠(n=40)建立右膝骨关节炎模型,同只小鼠的左膝作为正常对照,经腹腔分别给以洋椿苦素(n=20)和生理盐水(n=20)治疗后,利用Western blot、免疫组化、免疫荧光、番红O染色、HE染色、软骨损伤半定量评分系统及炎症分级系统,检测洋椿苦素对mTOR的抑制效果、自噬的激活情况、对软骨的保护和滑膜炎症抑制的效果。结果:(1)洋椿苦素可抑制C28/I2细胞mTOR的Ser-2448磷酸化位点,同时抑制核糖体S6蛋白激酶磷酸化(ribosomal protein S6,rpS6)的Thr-389和Ser-371位点,其最佳剂量为40μmol/L(Ser-2448:t=13.42,P=0.000;Thr-389:t=19.06,P=0.000;Ser-371:t=9.52,P=0.000),最佳作用时间为24 h(Ser-2448:t=34.82,P=0.000;Thr-389:t=3.14,P=0.007;Ser-371:t=19.32,P=0.000);(2)洋椿苦素可促进C28/I2细胞LC3II/LC3I的比值(t=8.15,P=0.002),并增加自噬小体阳性细胞的数量(t=9.71,P=0.000);(3)在骨关节炎中,洋椿苦素可抑制mTOR的磷酸化水平(t=19.03,P=0.005)及rpS6表达阳性的细胞数量(t=27.97,P=0.000),并增加LC3II/LC3I表达水平(t=24.65,P=0.000)和LC3表达阳性的细胞数量(t=33.89,P=0.000);(4)洋椿苦素可降低骨关节炎模型中关节软骨的损伤程度(t=8.32,P=0.009),增加软骨细胞的密度(F=3.59,P=0.013),抑制具有I型血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motifs 5,ADAMTS-5)的表达(F=1.82,P=0.002);(5)在骨关节炎模型的滑膜组织中,洋椿苦素可通过对白介素-1β(Interleukine-1 beta,IL-1β)的抑制(F=3.20,P=0.000)从而抑制滑膜组织中的炎症反应(F=5.44,P=0.029)。结论:洋椿苦素作为一种潜在的m TOR抑制剂,在小鼠模型中可通过激活自噬降低关节软骨的损伤并保护软骨细胞,还可通过对ADAMTS-5和IL-1β的抑制实现对细胞外基质的保护和炎症的抑制,但对骨关节炎中软骨的损伤的保护效果及机制还需进一步研究。
