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热休克转录因子1对视网膜色素上皮细胞抗氧化和抗衰老的调控作用
1
作者 蒋明君 尚国辉 +4 位作者 张凤妍 殷凡响 薛梦姣 胡延忠 彭旭艳 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期417-427,共11页
目的探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中HSF 1基因,构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(AR... 目的探讨热休克转录因子1(HSF1)对人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)抗氧化和抗衰老的作用。方法利用成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(CRISPR/Cas9)基因编辑技术敲除人ARPE-19细胞系中HSF 1基因,构建并获得2种HSF1缺失ARPE细胞株(ARPE/Hsf1-/-),分别命名为H8、H9细胞株。取野生型、H8和H9细胞株,应用DHE探针染色结合流式分析技术测定细胞内活性氧簇(ROS)含量,应用流式细胞分析方法测定细胞周期;采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法测定不同培养时间点细胞活力值;采用结晶紫染色实验测定细胞相对存活率;采用β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验检测衰老细胞比率;采用Western blot法检测各细胞株中热休克蛋白(HSP)70、HSP27、聚集素(CLU)、p53、p21和白细胞介素(IL)-1β蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR法测定各细胞株中p53、p21、IL-6、IL-8、IL-1β、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)mRNA表达水平。比较各细胞株在不同热休克处理条件下和HSP90抑制剂IPI504处理下热休克反应相关蛋白相对表达量,比较各细胞株不同浓度H_(2)O_(2)处理后相对存活率,比较各细胞株经或未经ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理后p21蛋白相对表达量。结果基因测序显示H8和H9细胞株成功携带突变基因,Western blot检测结果显示H8、H9细胞株不表达HSF1蛋白,HSF1在ARPE-19细胞中被成功敲除。与野生型细胞株相比,H8、H9细胞株中的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);各细胞株HSP90蛋白相对表达水平总体比较,差异无统计学意义(F=0.29,P>0.05)。在不同热休克刺激和IPI504诱导下野生型细胞株中HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与野生型细胞株相比,H8和H9细胞株的HSP70、HSP27、CLU蛋白相对表达水平显著低于相应处理的野生型细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与野生型细胞株相比,H8和H9细胞株培养24、48、72和96 h的细胞活力均显著降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与野生型细胞株比较,H8和H9细胞株G1期细胞百分比显著升高,细胞周期抑制因子p53、p21的mRNA和蛋白相对表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.05),SA-β-gal染色阳性细胞比率显著增加,差异均有统计学意义(均P<0.001);衰老相关炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β、MCP1 mRNA相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.001)。H8和H9细胞株ROS含量明显高于野生型细胞株,差异均有统计学意义(均P<0.001);H8和H9细胞株经NAC处理后p21蛋白相对表达量较未经NAC处理明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。H8和H9细胞株200、400、600、800μmol/L H 2O 2处理条件下细胞相对存活率明显低于野生型细胞,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论敲除HSF1可下调HSP的表达,激活ROS/P53/P21通路,诱导RPE细胞衰老,并增加RPE对氧化应激刺激的敏感性。HSF1在RPE细胞中可能具有抗衰老和抗氧化调控作用。 展开更多
关键词 热休克转录因子1 年龄相关性黄斑变性 细胞衰老 视网膜色素上皮 衰老治疗 氧化应激
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鸢尾素对抑郁小鼠行为学、外周血CD4^+细胞Th17分化和糖酵解的影响 被引量：2
2
作者 马明逸 余列 秦波 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2020年第2期213-217,共5页
目的:探讨鸢尾素是否能够改善小鼠的抑郁症状并分析相关机制。方法:将小鼠分为正常对照组、模型组及鸢尾素组,每组6只。模型组及鸢尾素组用皮质醇诱导小鼠抑郁模型。鸢尾素组造模成功后连续腹腔注射鸢尾素(100μg/kg)6 d。采用糖水偏好... 目的:探讨鸢尾素是否能够改善小鼠的抑郁症状并分析相关机制。方法:将小鼠分为正常对照组、模型组及鸢尾素组,每组6只。模型组及鸢尾素组用皮质醇诱导小鼠抑郁模型。鸢尾素组造模成功后连续腹腔注射鸢尾素(100μg/kg)6 d。采用糖水偏好实验、旷场实验及强迫游泳实验评价小鼠抑郁行为的变化,检测小鼠外周血中Th17细胞比例,ELISA法检测外周血中IL-17A含量。分选正常小鼠初始CD4^+T细胞,分为对照组和鸢尾素组,给予Th17细胞分化条件刺激3 d后,鸢尾素组再用鸢尾素(500μg/L)培养3 d;检测Th17细胞分化率,分光光度法检测细胞中丙酮酸、乳酸含量,Western blot法检测丙酮酸激酶2(PKM2)的表达。结果:与模型组比较,鸢尾素组小鼠旷场中心区运动时间及进入次数增加,强迫游泳不动时间缩短,糖水偏好度增加,外周血中Th17细胞比例及IL-17A含量下降(P均<0.05)。与对照组比较,鸢尾素组Th17细胞分化率,细胞内丙酮酸、乳酸含量及PKM2表达水平均降低(P<0.05)。结论:鸢尾素可能通过调控初始CD4^+T细胞的糖酵解程度,抑制其向Th17细胞分化,从而减少Th17细胞形成,发挥抗抑郁作用。 展开更多
关键词 鸢尾素 抑郁 TH17细胞 糖酵解 小鼠
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携带TP53和ERBB2基因突变的肝细胞癌类器官的培养及药物敏感性鉴定 被引量：2
3
作者 刘二冬 侯明慧 +3 位作者 王向 宗雅丽 王红阳 付静 《海军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期597-603,共7页
目的?培养肝细胞癌类器官用于药物筛选,为肝细胞癌患者的个体化治疗提供参考。方法将1例肝细胞癌患者的肿瘤组织消化为单细胞后接种于基质胶中培养。通过H-E染色观察类器官与原代肿瘤组织的细胞形态。采用免疫组织化学染色观察类器官与... 目的?培养肝细胞癌类器官用于药物筛选,为肝细胞癌患者的个体化治疗提供参考。方法将1例肝细胞癌患者的肿瘤组织消化为单细胞后接种于基质胶中培养。通过H-E染色观察类器官与原代肿瘤组织的细胞形态。采用免疫组织化学染色观察类器官与原代肿瘤组织中细胞角蛋白7(CK7)、细胞角蛋白8(CK8)、p53、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)等分子的表达情况。通过靶向测序检测类器官中肿瘤相关基因的突变情况。根据靶向测序结果进行药物筛选,采用CellTiter-Glo细胞活性检测试剂盒检测varlitinib[表皮生长因子受体/erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)特异性抑制剂]、索拉非尼(激酶多靶点抑制剂)、顺铂和nutlin3(p53激活剂)对类器官活性的影响。结果成功建立了携带肿瘤蛋白p53(TP53)和ERBB2基因突变的肝细胞癌类器官。H-E染色结果显示,类器官与原代肿瘤组织具有极为相似的结构和细胞学特征。免疫组织化学染色结果显示,类器官与原代肿瘤组织中CK7均为阴性,CK8、p53和GPC-3均为阳性。靶向测序结果显示,类器官中的突变基因有TP53(E271K,100%)、ERBB2(A1232V,62.29%)、RUNX转录因子1(RUNX1)(E395A,20.21%)、雄激素受体(AR)(Q91dup,70%)。细胞活性检测结果显示,varlitinib和索拉非尼对类器官的IC;分别为2.81μmol/L和1.327μmol/L,顺铂对类器官的IC;为40.98μmol/L,nutlin3对类器官生长无明显影响。结论成功建立了1例携带TP53和ERBB2基因突变的肝细胞癌类器官,该类器官保留了原代肿瘤组织的结构和分子特征,药物筛选结果可能为肝细胞癌患者的个体化治疗提供参考。 展开更多
关键词 肿瘤蛋白p53 erb-b2受体酪氨酸激酶2 肝细胞癌 类器官 药物筛选
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