端粒酶逆转录酶基因修饰人骨髓间质干细胞的实验研究 被引量：3

1

作者 李克 刘瑞敏 +2 位作者 韩雪飞 马岚 邢莹 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期1357-1362,共6页

目的:观察外源性hTERT基因的异位表达对人骨髓间质干细胞(MSCs)端粒酶活性及细胞生命周期的影响。方法:将携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)目的基因的质粒pEGFP-hTERT通过脂质体转染法转入人骨髓MSCs中... 目的:观察外源性hTERT基因的异位表达对人骨髓间质干细胞(MSCs)端粒酶活性及细胞生命周期的影响。方法:将携带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因和人端粒酶逆转录酶(hTERT)目的基因的质粒pEGFP-hTERT通过脂质体转染法转入人骨髓MSCs中,并用G418筛选法进行抗性克隆的筛选与扩增。通过RT-PCR和PCR-ELISA对转染前后hTERT mRNA的表达情况及其对端粒酶活性的影响进行检测。将转染细胞在EGF和bFGF的联合诱导下向神经元样细胞定向诱导分化,并用RT-PCR进行鉴定。结果:未转染的人骨髓MSCshTERT mRNA表达阴性,且端粒酶呈阴性而转染hTERT基因的人骨髓MSCshTERT mRNA表达阳性,且端粒酶呈阳性。转染hTERT基因的人骨髓MSCs在体外已连续传到第35代,而未转染的人骨髓MSCs传到第20-25代左右已衰老死亡。转染hTERT基因的人骨髓MSCs经EGF和bFGF的联合诱导后,较多细胞出现了典型的神经元样形态,且经RT-PCR检测表明,神经元特征性蛋白微管相关蛋白(MAP2)和神经丝亚单位M(NF-M)表达增强。结论:外源性hTERT基因可以在人骨髓MSCs中获得异位表达,并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性。外源性hTERT基因的异位表达不仅可以使人骨髓间质干细胞的寿命明显延长而且不影响其维持干细胞的多向分化潜能特性。 展开更多

关键词 间质干细胞 端粒 末端转移酶 转染

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hTERT-逆转录病毒载体构建及其介导的脐血间质干细胞基因转移研究

2

作者 李克 刘瑞敏 +1 位作者 韩雪飞 邢莹 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期361-364,共4页

目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(MSCs)中导入hTERT基因,观察该基因对细胞端粒酶活性的影响,能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法:PCR法扩增出hTERT全部片段,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装... 目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(MSCs)中导入hTERT基因,观察该基因对细胞端粒酶活性的影响,能否延长细胞的寿命以及转基因细胞的分化能力。方法:PCR法扩增出hTERT全部片段,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞。检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达,端粒酶活性的变化,hTERT转入后对细胞增殖的影响。用5-氮杂胞苷将转基因细胞向心肌方向诱导,检测心肌特异抗体的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达,细胞端粒酶阳性。生长曲线显示转基因细胞增殖速度快于未转染细胞。向心肌细胞诱导后,心肌特异性抗体α-sarcom ericactin和connexin-43均有表达。结论:在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达,激活细胞端粒酶的活性,有效延长了细胞的寿命,不影响其分化功能。 展开更多

关键词 间质干细胞 脐血 人端粒酶逆转录酶 逆转录病毒载体

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细胞因子诱导人脐血间充质干细胞分化过程中细胞巢蛋白、神经丝亚单位和端粒酶逆转录酶mRNA的表达 被引量：11

3

作者 邢莹 秦洁 +6 位作者 曹孟德 韩雪飞 鄢文海 陈宗德 刘计荣 许燕 龚光明 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2005年第2期250-253,共4页

目的:观察细胞因子EGF和bFGF联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中细胞 巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(NF M)和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的变化。方法:采集健康自然分娩产 妇脐血,密度梯度离心分离单个核细胞(MN... 目的:观察细胞因子EGF和bFGF联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中细胞 巢蛋白(nestin)、神经丝亚单位M(NF M)和端粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA的变化。方法:采集健康自然分娩产 妇脐血,密度梯度离心分离单个核细胞(MNCs),PBS洗涤2次后重悬于含体积分数20%胎牛血清的DMEM/F12 中,接种于T 75培养瓶内(细胞密度为1×106ml-1),一组加入细胞因子EGF和bFGF,终浓度各为10μg/L,另一 组不加细胞因子,剩余细胞用液氮冻存。培养24h倾去全部液体以除去未贴壁细胞,以后每3d全量换液1次,倒 置显微镜下观察细胞形态。分别收集培养1d、4d、7d、14d贴壁细胞和冻存细胞,采用RT -PCR方法检测nestin、 NF M、hTERTmRNA的表达。结果:未培养的脐血MNCs(内含MSCs)nestin、NF M、hTERTmRNA均表达阳性。培 养后nestin、hTERTmRNA表达下降,至第7d已不能检出;而NF MmRNA的表达随培养时间延长而增强。与对照 组相比,细胞因子组NF MmRNA表达较高,nestin、hTERTmRNA表达的下降趋势延迟。结论:细胞因子EGF和 bFGF在联合诱导脐血MSCs分化为神经细胞的过程中,能下调hTERTmRNA的表达。 展开更多

关键词 EGF bFGF 脐血 间充质干细胞 端粒酶逆转录酶 巢蛋白 神经丝亚单位M

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脐血干细胞移植对帕金森病大鼠神经功能恢复的影响 被引量：5

4

作者 樊志刚 刘翔 +3 位作者 白瑞樱 韩雪飞 鄢文海 邢莹 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第4期646-649,共4页

目的:观察脐血干细胞移植对帕金森病(PD)大鼠神经功能恢复的影响。方法:PD大鼠模型分成实验组(n=10)和对照组(n=10)。将第三代脐血间充质干细胞(MSCs)用Hoechst33258标记后植入实验组大鼠纹状体内,对照组注射PBS。此后每周腹腔注射阿朴... 目的:观察脐血干细胞移植对帕金森病(PD)大鼠神经功能恢复的影响。方法:PD大鼠模型分成实验组(n=10)和对照组(n=10)。将第三代脐血间充质干细胞(MSCs)用Hoechst33258标记后植入实验组大鼠纹状体内,对照组注射PBS。此后每周腹腔注射阿朴吗啡以观察神经功能恢复情况,并在2周,4周,8周用免疫荧光双标法检测MSCs的存活,迁移以及胶质纤维酸性蛋白(GFAP),神经元特异性烯醇化酶(NSE),酪氨酸羟化酶(TH)和突触素的表达。利用高效液相色谱电化学检测仪(HPLCECD)检测纹状体多巴胺含量。结果:脐血MSCs移植后大鼠的旋转行为与对照组相比有明显改善(P<0.05);MSCs可在大鼠脑内存活,随时间延长,迁移范围扩大,分布于纹状体,胼胝体和皮质;GFAP,NSE,TH都有表达,突触素无表达。多巴胺水平与对照组相比有明显提高(P<0.05)。结论:脐血MSCs有望成为治疗PD的种子细胞,为神经退行性变提供一种治疗方法。 展开更多

关键词 脐血干细胞 移植 帕金森病 多巴胺 大鼠

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体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化 被引量：7

5

作者 许予明 秦洁 +5 位作者 邢莹 张博爱 龚光明 宋波 陈宗德 张苏明 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第2期269-271,共3页

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法:从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用... 目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法:从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果:诱导1 h、2 h、3 h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5 h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物-神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论:骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 细胞培养 神经细胞 分化

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体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元 被引量：4

6

作者 邢莹 柴立辉 +5 位作者 吴素霞 陈中德 许燕 韩雪飞 曹孟德 鄢文海 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期186-190,共5页

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞,在体外一定条件下可向神经细胞分化。本实验通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs,并用脑源性神经营养因子(BDNF)、forskolin(FSK)和多巴胺(DA)联合对BMSC... 骨髓间充质干细胞(BMSCs)是存在于骨髓中的非造血干细胞,在体外一定条件下可向神经细胞分化。本实验通过密度梯度离心获取人骨髓中的单个核细胞,贴壁培养纯化BMSCs,并用脑源性神经营养因子(BDNF)、forskolin(FSK)和多巴胺(DA)联合对BMSCs进行诱导,电子显微镜观察诱导后细胞是否具有成熟神经元的超微结构特点;免疫细胞化学和RT-PCR检测DA能神经元分化过程中的标志物酪氨酸羟化酶(TH)的表达以及转录因子Nurr1、Ptx3、和Lmx1b的表达。结果显示:诱导2周后,电镜下可见细胞浆中有大量密集的呈扁平囊状的粗面内质网及其间的一些游离核糖体,以及神经丝。RT-PCR结果显示NSE(neuron specific enolase)、Nurr1、Ptx3、Lmx1b和TH的mRNA均有表达;免疫细胞化学表明诱导2周后TH阳性细胞的表达较诱导3d后明显提高。上述结果表明BDNF、FSK和DA可以在体外诱导人BMSCs定向分化为DA能神经元。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 分化 多巴胺能神经元 脑源性神经营养因子 电子显微镜

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超顺磁性氧化铁颗粒标记对大鼠骨髓间充质干细胞活力的影响 被引量：2

7

作者 张勇 程敬亮 +2 位作者 李华丽 王娟 赵天春 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2009年第6期1176-1178,共3页

目的:探讨利用超顺磁性氧化铁颗粒(SHU555A)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对细胞活力的影响。方法:分别使用不同铁浓度(35、70、140和210mg/L)的SHU555A标记大鼠BMSCs,分别于标记后1d及1、2、3周行普鲁士蓝染色观察铁纳米颗粒进... 目的:探讨利用超顺磁性氧化铁颗粒(SHU555A)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)对细胞活力的影响。方法:分别使用不同铁浓度(35、70、140和210mg/L)的SHU555A标记大鼠BMSCs,分别于标记后1d及1、2、3周行普鲁士蓝染色观察铁纳米颗粒进入细胞情况,台盼蓝排除试验检测细胞活力。结果:普鲁士蓝染色显示标记的大鼠BMSCs胞质内存在细小蓝色铁颗粒,标记率100%;台盼蓝染色显示标记时间对BMSCs活力无影响,铁浓度为35mg/L时对标记的细胞活力无影响,大于该浓度则细胞活力下降。结论:35mg/L的铁纳米颗粒可用于大鼠BMSCs标记。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 超顺磁性氧化铁 示踪标记 大鼠

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大鼠精原干细胞的分离纯化 被引量：3

8

作者 张卫星 韩广业 +2 位作者 王瑞 李松 韩雪飞 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2009年第3期497-500,共4页

目的:探讨分离纯化大鼠精原干细胞(SSCs)的方法。方法:取大鼠睾丸组织,通过①机械法+两步酶法,②机械法+两步酶法+Percoll分离法,③机械法+两步酶法+Percoll分离法+差速贴壁法得到细胞悬液,进行培养观察。采用免疫组织化学方法鉴定,台... 目的:探讨分离纯化大鼠精原干细胞(SSCs)的方法。方法:取大鼠睾丸组织,通过①机械法+两步酶法,②机械法+两步酶法+Percoll分离法,③机械法+两步酶法+Percoll分离法+差速贴壁法得到细胞悬液,进行培养观察。采用免疫组织化学方法鉴定,台盼蓝排斥实验及流式细胞仪分别检测细胞活率与纯度。结果:①、②、③法所得细胞为SSCs,所得SSCs活率分别为(93.26±1.06)%,(93.50±0.85)%和(94.73±0.82)%,差异无统计学意义(P>0.05);①、②、③法所得SSCs纯度呈增高趋势(P<0.05)。结论:3种方法在分离纯化过程中对SSCs活率的影响无明显差异。①法能够分离出较高纯度的SSCs,结合Percoll分离法能够使SSCs纯度提高,再结合差速贴壁法能够进一步富集SSCs。 展开更多

关键词 大鼠 精原干细胞 分离 纯化

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端粒酶逆转录酶基因修饰对人骨髓间质干细胞端粒酶活性的影响 被引量：1

9

作者 李克 何炜 +1 位作者 邢莹 樊青霞 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2008年第1期68-71,共4页

目的：观察外源性端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的异位表达对人骨髓间质干细胞（MSCs）端粒酶活性的影响。方法：无菌条件下，抽取健康志愿者骨髓2mL，经离心、洗涤及传代培养后备用。取第5代人MSCs接种至6孔培养板中，待其融合达90％～9... 目的：观察外源性端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的异位表达对人骨髓间质干细胞（MSCs）端粒酶活性的影响。方法：无菌条件下，抽取健康志愿者骨髓2mL，经离心、洗涤及传代培养后备用。取第5代人MSCs接种至6孔培养板中，待其融合达90％～95％时，用脂质体法对其进行转染，转染共分4组：正常对照组、脂质体组、pEG-FP-C1质粒组、pEGFP-hTERT质粒组。选用G418进行抗性克隆的筛选。30d后，正常对照组、脂质体组细胞全部死亡，而pEGFP-C1质粒组、pEGFP-hTERT质粒组则获得抗性克隆；将获得的抗性克隆进一步扩增后，选用pEGFP-C1质粒组、pEGFP-hTERT质粒组和未转染的人骨髓MSCs分别进行RT-PCR，检测转染前后hTERT mRNA的表达情况，并通过PCR-ELISA检测上述细胞的端粒酶活性。结果：未转染组和pEGFP-C1质粒组的人骨髓MSCs hTERT mRNA表达阴性，且端粒酶呈阴性；pEGFP-hTERT质粒组的人骨髓MSCs hTERT mRNA表达阳性，且端粒酶呈阳性。结论：外源性hTERT基因可以在人骨髓MSCs中获得异位表达，并能诱导人骨髓MSCs的端粒酶活性。 展开更多

关键词 间质干细胞 端粒酶 端粒酶逆转录酶 转染

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低速离心法分离小鼠胚胎干细胞

10

作者 许燕 高国伟 +1 位作者 鄢文海 邢莹 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2010年第1期75-78,共4页

目的:探讨获得胚胎干细胞(ES)简单有效的方法。方法:通过普通离心机以600r/min离心6min摔裂小鼠完整囊胚,剥离出未分化的内细胞团,培养鉴定ES。结果:低速离心可将内细胞团从完整囊胚中剥离出来,接种在丝裂霉素处理过的饲养细胞上培养时... 目的:探讨获得胚胎干细胞(ES)简单有效的方法。方法:通过普通离心机以600r/min离心6min摔裂小鼠完整囊胚,剥离出未分化的内细胞团,培养鉴定ES。结果:低速离心可将内细胞团从完整囊胚中剥离出来,接种在丝裂霉素处理过的饲养细胞上培养时,能在2～3d获得巢状增殖的干细胞集落,且能反复传代、冻存复苏,并保持胚胎干细胞多个标志物的特征。结论:利用低速离心摔裂完整囊胚法可获得胚胎干细胞系,且操作方便、经济可行。 展开更多

关键词 内细胞团 胚胎干细胞 小鼠

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脐血单个核细胞培养前后神经细胞特有标志物的变化 被引量：9

11

作者 邢莹 鄢文海 +4 位作者 刘计荣 龚光明 许燕 张莹 曹孟德 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2003年第2期200-202,共3页

目的 :探讨脐血单个核细胞培养前后神经细胞特有标志物的表达差异。方法 :采用RT PCR方法对脐血单个核细胞培养前后nestin ,神经丝亚单位M(NF M)及微管相关蛋白 2 (MAP2mRNA)的表达进行检测。结果 :nestin ,NF M及MAP2mRNA在培养前的脐... 目的 :探讨脐血单个核细胞培养前后神经细胞特有标志物的表达差异。方法 :采用RT PCR方法对脐血单个核细胞培养前后nestin ,神经丝亚单位M(NF M)及微管相关蛋白 2 (MAP2mRNA)的表达进行检测。结果 :nestin ,NF M及MAP2mRNA在培养前的脐血单个核细胞中表达呈阳性 ,培养后 3者表达增强。结论 :直接分离的脐血单个核细胞中存在着表达神经细胞特有分子的细胞 ,培养后 。 展开更多

关键词 骨髓移植 脐血单个核细胞 神经细胞 特有标志物 神经丝亚单位M 微管相关蛋白-2

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EGF和bFGF对脐血单个核细胞τ蛋白及微管相关蛋白-2 mRNA表达的影响 被引量：8

12

作者 鄢文海 曹孟德 +5 位作者 王建枝 刘计荣 龚光明 许燕 韩雪飞 邢莹 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期108-112,共5页

目的探讨脐血单个核细胞在细胞因子诱导作用下τ蛋白及微管相关蛋白-2(MAP2)mRNA的表达。方法用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,接种于含20%胎牛血清H-DMEM培养瓶内。以不加任何生长因子的培养为对照组,其余3组分别加入细胞因子EGF+b... 目的探讨脐血单个核细胞在细胞因子诱导作用下τ蛋白及微管相关蛋白-2(MAP2)mRNA的表达。方法用密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,接种于含20%胎牛血清H-DMEM培养瓶内。以不加任何生长因子的培养为对照组,其余3组分别加入细胞因子EGF+bFGF、bFGF、EGF,终浓度均为20μg/L。倒置显微镜下观察细胞形态变化,RT-PCR方法检测脐血单个核细胞培养前后τ蛋白及MAP2mRNA,免疫细胞化学方法检测τ蛋白及MAP2阳性细胞。结果培养前,脐血单个核细胞胞体小呈圆形;培养后EGF+bFGF组细胞胞体较大,突起粗而长,EGF组细胞胞体呈梭形,有1-2个长突触,bFGF组细胞胞体较小、有多个细长突起,形似星形细胞,对照组细胞形态类似于bFGF组,但数量较少。RT-PCR检测未培养脐血单个核细胞MAP2mRNA表达阳性而τ蛋白mRNA呈阴性,培养后MAP2mRNA表达增强,τ蛋白mRNA亦呈阳性;免疫细胞化学方法可检测MAP2及τ蛋白阳性细胞在EGF+bFGF组、EGF组、bFGF组、对照组分别为335%、256%、196%、144%和298%、214%、153%、135%。结论脐血单个核细胞中存在的神经元特异性分子,经培养和生长因子调控后表达增强,联合使用bFGF、EGF具有协同作用。 展开更多

关键词 胎血 表皮生长因子 碱性成纤维细胞生长因子 微管相关蛋白质类

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非诺贝特对LPC诱导脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及eNOS基因表达的影响 被引量：4

13

作者 孙国举 谢秀梅 +3 位作者 邢莹 鄢文海 杨天崙 余国龙 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期373-378,共6页

目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据非诺贝特不同浓度分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特(10μmol/L)组、中浓度非诺贝... 目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因表达的影响。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),根据非诺贝特不同浓度分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特(10μmol/L)组、中浓度非诺贝特(50μmol/L)组、高浓度非诺贝特(100μmol/L)组,根据非诺贝特不同干预时间分为正常对照组、LPC组、非诺贝特(50μmol/L)干预6h组、12h组、24h组、48h组进行实验。分别观测不同浓度及不同时间非诺贝特内皮细胞增殖、凋亡、NO浓度及eNOS mRNA表达的变化。结果:与正常对照组比较,LPC抑制内皮细胞增殖,促进细胞凋亡,并使HUVECs eNOS mRNA表达降低,NO合成减少。非诺贝特可干预LPC对内皮细胞的作用,使内皮细胞增殖增强,细胞凋亡减少,eNOS mRNA表达升高,NO合成增加,且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系。结论:非诺贝特可改善LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增殖增强,凋亡减少,eNOSmRNA表达升高,NO合成增加,从而起到抗动脉硬化作用。 展开更多

关键词 非诺贝特 人脐静脉内皮细胞 增殖 凋亡 内皮型一氧化氮合酶

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EGF和bFGF联合诱导人脐血MSCs向神经细胞分化过程中端粒酶活性的变化 被引量：6

14

作者 秦洁 曹孟德 +6 位作者 许予明 邢莹 陈宗德 鄢文海 韩雪飞 许燕 龚光明 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第6期956-960,共5页

目的 :检测重组人表皮生长因子 (EGF)和碱性成纤维生长因子 (bFGF)联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中端粒酶活性的变化 ,以探讨人脐血MSCs的增殖性和安全性 ,为其临床应用提供实验和理论依据。方法 :采集健康自然... 目的 :检测重组人表皮生长因子 (EGF)和碱性成纤维生长因子 (bFGF)联合诱导人脐血间充质干细胞(MSCs)向神经细胞分化过程中端粒酶活性的变化 ,以探讨人脐血MSCs的增殖性和安全性 ,为其临床应用提供实验和理论依据。方法 :采集健康自然分娩产妇志愿捐献的脐血 ,密度梯度离心分离单个核细胞 ,接种于含体积分数为2 0 %胎牛血清的DMEM/F12中 ,对照组不加细胞因子 ,实验组加入EGF和bFGF ,终浓度均为 10 μg/L ,剩余细胞用液氮冻存。培养 2 4h后倾去全部液体以去除未贴壁细胞 ,以后每 3d全量换液 1次。分别收集培养 1d、4d、7d、10d、14d、2 1d的贴壁细胞和冻存细胞 ,将细胞密度调整一致 ,采用反转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)方法检测脐血MSCs培养前后各时间段的巢蛋白 (nestin)和神经丝亚单位M(NF -M)mRNA表达 ;采用端粒重复序列扩增 -酶联免疫吸附实验 (TRAP -ELISA)法检测人脐血MSCs向神经细胞分化过程中的端粒酶活性变化。结果 :RT -PCR检测发现 ,未培养的脐血细胞nestin、NF -MmRNA均呈阳性表达 ;培养后NF -MmRNA的表达随培养时间延长而增强(P <0 .0 1) ;实验组与对照组相比 ,细胞因子能明显促进NF -MmRNA的表达 (P <0 .0 1)。而nestinmRNA的表达随培养时间延长而下降 (P <0 .0 1) ,至第 7d已不能检出 ; 展开更多

关键词 脐血 间充质干细胞 神经分化 端粒酶

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脐血单个核细胞在半固体培养基中向神经元样细胞的分化 被引量：2

15

作者 邢莹 马杰 +4 位作者 杨红旗 孙慧 韩雪飞 曹孟德 鄢文海 《神经解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第2期183-185,共3页

为观察脐血单个核细胞在甲基纤维素半固体培养基中的生长情况 ,常规方法分离脐血单个核细胞 ,接种于含 SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3、IL-6、EPO的甲基纤维素半固体培养基中培养。第 5 d发现有 6～ 10个细胞组成的小集簇 ,散在分布 ,细胞... 为观察脐血单个核细胞在甲基纤维素半固体培养基中的生长情况 ,常规方法分离脐血单个核细胞 ,接种于含 SCF、GM-CSF、G-CSF、IL-3、IL-6、EPO的甲基纤维素半固体培养基中培养。第 5 d发现有 6～ 10个细胞组成的小集簇 ,散在分布 ,细胞形态无变化。第 11d有神经元样细胞生长 ,与集簇并存。以后神经元样细胞逐渐生长 ,但集簇生长停滞 ,第 16d仍未发现集落形成。收集细胞 ,进行神经元特异烯醇化酶 (NSE)、神经丝蛋白 (NF)免疫细胞化学测定 ,显示少量神经元样细胞 NSE、NF阳性。该结果提示在半固体培养基中 ,脐血单个核细胞可向神经元样细胞分化 。 展开更多

关键词 人 脐血 核细胞 半固体培养基 神经元样细胞 分化 甲基纤维素

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吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达的影响及其诱导细胞凋亡作用 被引量：2

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作者 巩宏涛 孙玲 +2 位作者 任小晶 刘柳 韩雪飞 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2010年第2期317-320,共4页

本研究探讨吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达及细胞凋亡的影响及吉西他滨应用于白血病治疗的可行性。体外培养人白血病细胞系HL-60细胞,以不同浓度吉西他滨作用于HL-60细胞,用RT-PCR方法检测细胞c-myc mRNA表达的变化;以Western blot... 本研究探讨吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因表达及细胞凋亡的影响及吉西他滨应用于白血病治疗的可行性。体外培养人白血病细胞系HL-60细胞,以不同浓度吉西他滨作用于HL-60细胞,用RT-PCR方法检测细胞c-myc mRNA表达的变化;以Western blot方法检测细胞C-MYC蛋白表达水平;原位酶标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡情况。结果表明,1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞12、24、36、48小时后,不同程度地抑制HL-60细胞c-myc mRNA的表达,并具有时间依赖性,其最适作用时间为24小时,与阿糖胞苷(Ara-C)组及空白对照组比较,抑制作用差异有统计学意义(p<0.05)。1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞24、48、72小时后,C-MYC蛋白表达水平明显下降,于48小时抑制作用最明显,抑制率为94.16%,方差分析显示,各时间点吉西他滨组与空白对照组和Ara-C组比较,差异均有统计学意义(p<0.01);吉西他滨作用24小时组、48小时组及72小时组组间比较,也有显著性差异(p<0.01)。1.0μg/ml吉西他滨作用于HL-60细胞24小时后,出现明显的诱导细胞凋亡作用,阳性率83.67%,与空白对照组(阳性率3.00%)和Ara-C组(阳性率10.67%)比较差异均有统计学意义(p<0.01)。结论:吉西他滨对HL-60细胞c-myc基因及C-MYC蛋白表达有显著的抑制作用,能够诱导HL-60细胞凋亡,其抑制及诱导凋亡作用强于阿糖胞苷,提示吉西他滨可能作为白血病治疗的新选择。 展开更多

关键词 吉西他滨 HL-60细胞 白血病 细胞凋亡 C-MYC基因

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人脐血间充质样细胞体外培养的形态学变化 被引量：2

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作者 刘素芳 鄢文海 +1 位作者 韩雪飞 邢莹 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第1期89-91,共3页

目的:分离培养人脐血间充质样细胞,观察其形态学的变化。方法:取新鲜采集脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的... 目的:分离培养人脐血间充质样细胞,观察其形态学的变化。方法:取新鲜采集脐带血,用1.077g/cm3的淋巴细胞分层液密度梯度离心法分离脐血单个核细胞。将脐血单个核细胞接种于37℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。于不同时间观察细胞形态的变化。结果:从脐血中可以分离出单个核细胞;培养3d出现大量的造血细胞集落,瑞氏染色显示粒-巨噬系集落形成单位与红系集落形成单位集落形成最多;培养5d出现贴壁的扁平状上皮样细胞和长梭形的成纤维样细胞,同时有大量的破骨样细胞混杂;培养1周出现上皮样细胞和成纤维样细胞的集落,此时经胰蛋白酶消化机械吹打可以传代;培养2周以上,出现上皮样细胞的克隆,镜下呈现球形样结构,折光性强。结论:脐血成分复杂,在体外分离培养可以获得形态各异的脐血间充质样细胞。 展开更多

关键词 脐血 间充质样细胞 体外培养 形态 人

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悬浮生长的人脐血细胞中Nestin及MAP_2 mRNA的表达 被引量：2

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作者 鄢文海 刘计荣 +4 位作者 王建枝 邢莹 许燕 韩雪飞 曹孟德 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第4期592-595,共4页

目的 :探讨悬浮生长的人脐血细胞中神经元特有标志物的表达特性 ,进一步阐明脐血单个核细胞(MNCs)向神经细胞分化的条件和机制。方法 :取健康自然分娩产妇脐血 ,密度梯度离心法分离单个核细胞 ,以 1×1 0 6ml-1 细胞密度接种于含体... 目的 :探讨悬浮生长的人脐血细胞中神经元特有标志物的表达特性 ,进一步阐明脐血单个核细胞(MNCs)向神经细胞分化的条件和机制。方法 :取健康自然分娩产妇脐血 ,密度梯度离心法分离单个核细胞 ,以 1×1 0 6ml-1 细胞密度接种于含体积分数为 2 0 %胎牛血清的DMEM培养瓶内 ,置 37℃、体积分数为 5 %CO2 、饱和湿度的培养箱内培养 ,倒置显微镜下观察细胞形态变化。收集培养第 1d、3d、5d、7d、1 0d悬浮生长的细胞 ,用RT PCR法检测培养前后MNCs神经元特有标志物Nestin和MAP2 的mRNA的表达。结果 :培养前MNCs呈小圆形 ,Nestin、MAP2mRNA均表达阳性。培养后细胞体积增大 ,部分细胞贴壁生长 ,部分细胞呈悬浮生长。收集悬浮生长细胞 ,第 1d、3dNestinmRNA的表达升高 ,随后降低直至转阴 ,而MAP2 mRNA的表达随培养时间的延长而增强。结论 :悬浮生长的脐血细胞表达神经元特有标志物Nestin和MAP2 mRNA 。 展开更多

关键词 脐血细胞 神经干细胞 NESTIN 微管相关蛋白-2

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非诺贝特对溶血卵磷脂诱导的血管内皮细胞增生及凋亡的影响 被引量：1

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作者 孙国举 谢秀梅 +2 位作者 邢莹 杨天伦 余国龙 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2006年第5期535-539,共5页

目的:观察非诺贝特对溶血卵磷脂(LPC)诱导的血管内皮细胞增生、凋亡的影响并探讨其机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为正常对照组、LPC组、非诺贝特低浓度组(10μmol·L-1)、非诺贝特中浓度组(50μmol·L-1)及... 目的:观察非诺贝特对溶血卵磷脂(LPC)诱导的血管内皮细胞增生、凋亡的影响并探讨其机制。方法:体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs),分为正常对照组、LPC组、非诺贝特低浓度组(10μmol·L-1)、非诺贝特中浓度组(50μmol·L-1)及非诺贝特高浓度组(100μmol·L-1)。分别观测LPC对血管内皮细胞增生、凋亡及凋亡调控蛋白抑制X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的影响,及非诺贝特干预后的变化。结果:与正常对照组比较,LPC抑制内皮细胞增生,促进内皮细胞凋亡,XIAP表达减弱。非诺贝特可干预LPC对内皮细胞的作用,使内皮细胞增生增强,凋亡减少,XIAP表达增强。结论:非诺贝特可通过促进XIAP表达干预LPC对HUVECs增生及凋亡的影响。 展开更多

关键词 非诺贝特 人脐静脉内皮细胞 增生 凋亡 X连锁凋亡抑制蛋白

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非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAP mRNA表达的影响

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作者 孙国举 谢秀梅 +2 位作者 邢莹 鄢文海 韩雪飞 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第5期876-879,共4页

目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、凋亡、NO生成及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达的影响。方法:体外培养HUVECs株CRL-1730,分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特组(10μmol/L)、中浓度非诺贝特组(50μmol... 目的:探讨非诺贝特对LPC诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增生、凋亡、NO生成及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达的影响。方法:体外培养HUVECs株CRL-1730,分为正常对照组、LPC组、低浓度非诺贝特组(10μmol/L)、中浓度非诺贝特组(50μmol/L)、高浓度非诺贝特组(100μmol/L)。分别观测内皮细胞增生、凋亡、NO生成及XIAPmRNA表达的变化。结果:与正常对照组比较,LPC抑制CRL-1730细胞增生,促进凋亡,降低NO浓度,减弱XIAPmRNA的表达。非诺贝特干预后,CRL-1730细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,XIAPmR-NA表达增强,且其作用呈时间-效应、浓度-效应依赖关系。结论:非诺贝特可通过促进XIAP表达,干预LPC对HUVECs的影响,使内皮细胞增生增强,凋亡减少,NO浓度升高,从而起到抗动脉硬化作用。 展开更多

关键词 非诺贝特 人脐静脉内皮细胞 增生 凋亡 XIAP

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