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骨髓间充质干细胞治疗实验性肺动脉高压后肺组织结构的变化 被引量:8
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作者 何志旭 汪浩文 +3 位作者 尚峰 杨红宇 崔冬冰 杨燕 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1907-1911,共5页
目的:探讨骨髓间充质干细胞(MMSCs)移植治疗肺动脉高压(PAH)后肺组织超微结构的变化。方法:取SD大鼠的骨髓,经贴壁筛选法体外培养并纯化MMSCs,用Hoechst33342荧光染料标记。实验动物随机分为3组:MMSCs移植治疗组(M组)、肺动脉高压模型... 目的:探讨骨髓间充质干细胞(MMSCs)移植治疗肺动脉高压(PAH)后肺组织超微结构的变化。方法:取SD大鼠的骨髓,经贴壁筛选法体外培养并纯化MMSCs,用Hoechst33342荧光染料标记。实验动物随机分为3组:MMSCs移植治疗组(M组)、肺动脉高压模型组(H组)和正常对照组(C组)。M组采用野百合碱(50mg·kg-1)注射复制PAH模型成功后3周经舌下静脉移植5×109cells/LMMSCs细胞悬液1mL;H组复制PAH模型后3周移植1mLL-DMEM细胞培养液,C组在同时间注射等量L-DMEM液。饲养4周,观察各组动物一般情况、生存率、右心室收缩压、右心指数及肺小动脉的微观结构和超微结构的改变。结果:实验动物移植MMSCs后,生存状况明显改善,食欲及活动增加,毛色顺滑、光亮,动物存活率为100%;而模型组动物活动明显减少、食欲下降,消瘦,体重下降或不增,在1月内相继死亡,死亡率为100%。各项指标检测结果显示,MMSCs移植组(M组)大鼠较单纯肺动脉高压组(H组)右心室收缩压明显降低[移植组为(32.20±2.32)mmHg,而模型组为(48.30±1.56)mmHg,两者相比差异显著,P<0.05],右心指数下降[移植组为(38.80±3.24)%,模型组为(45.10±3.43)%,二者相比差异显著,P<0.05],肺小动脉的重建和超微结构的血气屏障、线粒体、板层小体等改变均有明显改善,其结果接近正常对照组。结论:MMSCs移植后可通过形成新生血管建立侧枝循环,有效减轻野百合碱诱导的肺动脉高压和肺组织病变程度。 展开更多
关键词 肺动脉高压 骨髓间充质干细胞 野百合碱
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大鼠骨髓间充质干细胞多向分化潜能的研究 被引量:5
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作者 汪浩文 何志旭 +1 位作者 王志华 刘俊峰 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期528-532,共5页
目的分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),并行多向分化潜能的鉴定。方法经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至... 目的分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),并行多向分化潜能的鉴定。方法经Percoll梯度分离法获得大鼠骨髓单个核细胞。贴壁培养后,通过倒置显微镜进行细胞形态学观察,并采用流式细胞术进行分析。传至第3代后,分别进行成脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞的诱导,并行免疫组织化学鉴定。结果骨髓间充质干细胞大小较为均匀,基本上呈梭形或星形的上皮样细胞,传代培养后的细胞体积增大,成纤维样细胞逐渐增多。经反复传代纯化的MSCs检测CD71、CD29呈阳性表达并证实骨髓间充质干细胞经诱导后分化为脂肪细胞、神经元样细胞、血管内皮样细胞。结论在体外,大鼠骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,可作为组织工程的种子细胞。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 脂肪细胞 神经元样细胞 血管内皮样细胞
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体外分化胚胎干细胞为造血干细胞重建造血功能的研究 被引量:4
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作者 何志旭 林槟 +2 位作者 黄绍良 米蔷 黄景 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1610-1615,共6页
目的:探讨体外定向分化胚胎干细胞(ESCs)为造血干细胞(HSCs)对体内造血功能的重建作用。方法:将小鼠E14.1胚胎干细胞采用"三步诱导法"在体外分化发育为HSCs,造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况,免疫磁珠分选纯... 目的:探讨体外定向分化胚胎干细胞(ESCs)为造血干细胞(HSCs)对体内造血功能的重建作用。方法:将小鼠E14.1胚胎干细胞采用"三步诱导法"在体外分化发育为HSCs,造血克隆形成(CFU)实验观察其体外造血集落形成情况,免疫磁珠分选纯化HSCs移植给经亚致死剂量γ射线照射的雌性SCID小鼠,观察其植入及小鼠造血功能恢复情况。结果:经过分阶段诱导,多种造血刺激因子联合应用能有效促进ESCs定向分化发育为HSCs,流式细胞仪检测HSCs特异性表面标志物CD34+/Sca-1+表达最高为(58.64±4.20)%,CFU培养能形成较多的红系、粒系/巨噬细胞系及混合细胞集落,Wright-Giemsa染色显示为原始的造血细胞。此阶段的HSCs经分选纯化后移植给经γ射线照射后的小鼠,移植组小鼠+10d造血功能开始恢复,观察40d后除血小板恢复较慢外,白细胞、红细胞、血红蛋白等指标已接近正常,植入率为71.4%,存活率为43.0%,染色体检测证实已由受体鼠的XX转为供体鼠的XY。结论:采用分阶段诱导的方法,可在体外定向诱导小鼠ESCs分化发育为HSCs,此来源的HSCs可以有效重建体内造血功能。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 造血干细胞 细胞移植
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人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用 被引量:1
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作者 米蔷 何志旭 +2 位作者 段茂利 王志华 杨燕 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期654-660,共7页
目的为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESc)体外培养系统,用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts,hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。... 目的为建立不含动物细胞成分的人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESc)体外培养系统,用人包皮成纤维细胞(human postnatal foreskin fibroblasts,hPFF)制备细胞饲养层并观察其对hESc体外生长的支持功能及生物学特性的维持作用。方法利用儿童阴茎包皮环切术后遗弃包皮组织分离培养成纤维细胞,纯化增殖细胞,采用35Gyγ射线照射灭活法制备成饲养层。将hESc(HS181细胞株)接种在该饲养层上,连续传代至20代,倒置显微镜观察其形态学变化,测定其细胞碱性磷酸酶活性,类胚体形成实验及干细胞转录因子表达,严重联合免疫缺陷的小鼠(severe combined immune deficiency mice,SCID)体内畸胎瘤形成及体内全能分化特性实验对hESc生物学特性进行鉴定。结果hPFF体外培养过程中生长增殖旺盛,连续传20代以上能保持正常细胞形态学和生物学特性。经γ射线照射使其停止增殖,24 h内能较好地保持细胞活力和形态学特征,具备饲养层细胞基本条件。HS181 hESc在hPFF上传到20代仍能较好地保持未分化状态,细胞呈克隆性生长,高度表达碱性磷酸酶及Oct-4、Nanog等胚胎干细胞转录因子;悬浮法培养连续传20代的hESc可获得由3个胚层细胞所形成的类胚体(Embryoid bodies,EB)结构,可检测到CD90、Flt-1、Nestin基因的表达,证明得到的类胚体中含了3个胚层细胞,说明hESc具有体外多能干性特征。体内全能分化实验显示:将第20代的hESc接种到SCID小鼠体内,6周后可形成畸胎瘤,组织学切片分析其包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞,直接证明其具有体内多向分化的全能性。结论hPFF可作为一种来源丰富,取材方便的人源化饲养层细胞,能有效地支持hESc体外生长。克服了目前hESc建系和体外培养过程中使用动物细胞饲养层带来的异种蛋白污染和致病微生物的危险,初步解决了hESc临床应用的生物安全性问题。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 成纤维细胞 饲养层 人类
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胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究 被引量:1
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作者 黄璟 何志旭 +2 位作者 黄绍良 吴倩倩 刘俊峰 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第8期1597-1601,共5页
目的:探讨胚胎干细胞(ESC)诱导分化为树突状细胞(DC)的实验方法,实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法:E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体(EB)诱导分化为DC。不成熟DC(im-DC)流式细胞仪检测CD11 c、CD8... 目的:探讨胚胎干细胞(ESC)诱导分化为树突状细胞(DC)的实验方法,实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法:E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体(EB)诱导分化为DC。不成熟DC(im-DC)流式细胞仪检测CD11 c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖(LPS)促进DC的成熟,收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查,分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比,异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果:ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11 c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11 c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现,ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用,证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论:使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径,对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。 展开更多
关键词 树突细胞 胚胎干细胞
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同源异体骨髓间充质干细胞移植对大鼠实验性肺动脉高压的治疗作用
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作者 汪浩文 何志旭 +2 位作者 尚峰 王志华 米蔷 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期477-481,共5页
目的探讨同源异体骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对大鼠实验性肺动脉高压的治疗效果及作用机制。方法体外分离、培养并纯化SD大鼠骨髓MSCs。健康雄性SD大鼠随机分为3组,正常对照组(n=15)、肺动脉高压组(n=30)... 目的探讨同源异体骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)移植对大鼠实验性肺动脉高压的治疗效果及作用机制。方法体外分离、培养并纯化SD大鼠骨髓MSCs。健康雄性SD大鼠随机分为3组,正常对照组(n=15)、肺动脉高压组(n=30)、MSCs移植组(n=20)。肺动脉高压组和MSCs移植组大鼠一次性项背部皮下注射野百合碱(50 mg/kg),复制肺动脉高压模型。三组大鼠同等条件饲养。3周后,MSCs移植组大鼠经舌下静脉注射5×106/ml的经Hoechst 33342标记的MSCs细胞悬液1 ml,肺动脉高压组大鼠予等量L-DMEM液,正常对照组不作任何处理。移植后28 d,观察三组大鼠的平均肺动脉压力(mPAP)、右心指数、血气及肺小动脉的微观结构的改变。结果肺动脉高压模型大鼠用MSCs移植28 d后,该组动物生存率为100%,平均肺动脉压力明显降低、右心指数下降,动脉血气指标等均有明显改善,与肺动脉高压组相比差异有统计学意义(P<0.01)。荧光显微镜观察到Hoechst 33342标记的MSCs在肺内定植且分化成大量新生血管并形成侧支循环,肺动脉重构得到有效逆转。结论MSCs移植可有效减轻并逆转野百合碱诱导的肺动脉高压的进程,其治疗作用机制可能与MSCs分化形成新生血管和改善肺小动脉血管重构有关。 展开更多
关键词 骨髓 间充质干细胞 肺动脉高压 治疗
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人脐静脉血管内皮细胞饲养层的制备
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作者 王志华 何志旭 +1 位作者 汪浩文 米蔷 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第10期890-892,共3页
目的探讨使用人脐静脉内皮细胞制备饲养层的方法。方法使用健康产妇剖宫产后同意遗弃的脐带,无菌状态下胶原酶消化法收集内皮细胞,进行传代培养和增殖扩增,免疫组化法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定,分别取 P2~P5代内皮细胞经丝裂霉素 C(10μg... 目的探讨使用人脐静脉内皮细胞制备饲养层的方法。方法使用健康产妇剖宫产后同意遗弃的脐带,无菌状态下胶原酶消化法收集内皮细胞,进行传代培养和增殖扩增,免疫组化法进行Ⅷ因子相关抗原鉴定,分别取 P2~P5代内皮细胞经丝裂霉素 C(10μg/ml)分别处理30、60、90、120 min 后再接种 E14.1胚胎干细胞。观察 E14.1胚胎干细胞在内皮细胞上的生长情况。结果经丝裂霉素 C 处理30~60 min 后的 P2~P3代内皮细胞可以很好的支持胚胎干细胞的生长。结论人脐静脉血管内皮细胞可作为一种来源丰富、取材方便的人源化饲养层细胞,为以后临床应用打下基础。 [临床儿科杂志,2008,26(10):890-892] 展开更多
关键词 人脐静脉 内皮细胞 饲养层
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两种来源树突状细胞生物学特性的比较 被引量:1
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作者 刘俊峰 何志旭 +1 位作者 沈冬 黄瑾 《临床儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期274-277,共4页
目的体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)以及骨髓(BM)单个核细胞分化为树突状细胞(DC),并对其生物学特性进行比较。方法悬浮培养诱导小鼠ESC生成拟胚体(embryonic bodies,EB),取14d生长良好的EB转移至组织培养皿中,添加粒细胞-巨噬细胞集落刺... 目的体外诱导小鼠胚胎干细胞(ESC)以及骨髓(BM)单个核细胞分化为树突状细胞(DC),并对其生物学特性进行比较。方法悬浮培养诱导小鼠ESC生成拟胚体(embryonic bodies,EB),取14d生长良好的EB转移至组织培养皿中,添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)以及IL-3,培养2周后收获DC。同时联合应用GM-CSF、IL-4诱导培养小鼠骨髓单个核细胞分化为DC。并从形态学、表型及功能方面对两者进行检测。结果ESC-DC、BM-DC经磷酸脂多糖(LPS)刺激成熟后其表面均显示出明显的树枝状突起,高表达CD11c、CD86及MHC-Ⅱ类分子,并具有极强的刺激同种异基因淋巴细胞增殖的能力。结论ESC-DC具有与BM-DC相同的生物学特性,为DC的功能研究以及进一步制备相应的白血病疫苗提供又一可靠来源。 展开更多
关键词 胚胎干细胞 骨髓 树突状细胞 诱导
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