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具备高效CRISPR协同激活活性的HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞株构建
被引量：
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作者
任柱平
杨泰然
+4 位作者
雷元三
金留飞
崔古贞
田益明
陈峥宏
《生物技术通报》
北大核心
2025年第5期52-61,共10页
【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。...
【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。【方法】首先利用PiggyBac转座子系统构建HIEC6-dCas9-SAM多克隆细胞;然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,并使用免疫印迹、间接免疫荧光法鉴定单克隆细胞株中dCas9-SAM蛋白(dCas9、VP64、MS2、HSF1、p65)的表达情况;最后利用CRISPRa荧光报告系统和构建包装特定靶基因sgRNA慢病毒,检测所构建稳转株在转录和蛋白水平的CRISPR激活效率。【结果】成功获得两株HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞,两株细胞均能高水平稳定表达dCas9-SAM蛋白。CRISPRa荧光报告系统检测显示,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞的激活效率分别高达96.7%、99.0%。靶基因激活功能验证显示,在转录水平,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞中靶基因APN的转录激活水平分别高达2725倍和4521倍,SLC35A1基因的转录激活水平分别为27.5倍和18.1倍;在蛋白水平,APN蛋白的激活效率分别高于12.9倍和11.2倍,SLC35A1蛋白的激活效率分别为1.32倍和0.97倍。两株单克隆稳转细胞均表现出较高的转录激活活性。【结论】成功构建两株具有高水平CRISPR转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆稳转细胞,为后续基于CRISPRa系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供了重要细胞工具。
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关键词
dCas9-SAM
HIEC6细胞
CRISPR激活
稳转细胞株
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职称材料
题名
具备高效CRISPR协同激活活性的HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞株构建
被引量：
1
1
作者
任柱平
杨泰然
雷元三
金留飞
崔古贞
田益明
陈峥宏
机构
贵州
医科大学基础医学院
微生物
学教研室
贵州省
病原
生物
学特色
重点
实验室
贵州省微生物组与感染性疾病防控重点实验室
出处
《生物技术通报》
北大核心
2025年第5期52-61,共10页
基金
贵州省科技计划项目(黔科合基础-ZK[2023]一般333)
贵州医科大学引进博士启动基金项目(校博合J字[2022]010)
+1 种基金
贵州省病原生物学重点实验室(QJJ[2022]019)
高等学校学科创新引智计划(111计划,D20009)。
文摘
【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。【方法】首先利用PiggyBac转座子系统构建HIEC6-dCas9-SAM多克隆细胞;然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,并使用免疫印迹、间接免疫荧光法鉴定单克隆细胞株中dCas9-SAM蛋白(dCas9、VP64、MS2、HSF1、p65)的表达情况;最后利用CRISPRa荧光报告系统和构建包装特定靶基因sgRNA慢病毒,检测所构建稳转株在转录和蛋白水平的CRISPR激活效率。【结果】成功获得两株HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞,两株细胞均能高水平稳定表达dCas9-SAM蛋白。CRISPRa荧光报告系统检测显示,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞的激活效率分别高达96.7%、99.0%。靶基因激活功能验证显示,在转录水平,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞中靶基因APN的转录激活水平分别高达2725倍和4521倍,SLC35A1基因的转录激活水平分别为27.5倍和18.1倍;在蛋白水平,APN蛋白的激活效率分别高于12.9倍和11.2倍,SLC35A1蛋白的激活效率分别为1.32倍和0.97倍。两株单克隆稳转细胞均表现出较高的转录激活活性。【结论】成功构建两株具有高水平CRISPR转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆稳转细胞,为后续基于CRISPRa系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供了重要细胞工具。
关键词
dCas9-SAM
HIEC6细胞
CRISPR激活
稳转细胞株
Keywords
dCas9-SAM
HIEC6 cells
CRISPR activation
stable cell line
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
具备高效CRISPR协同激活活性的HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞株构建
任柱平
杨泰然
雷元三
金留飞
崔古贞
田益明
陈峥宏
《生物技术通报》
北大核心
2025
1
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