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红肉火龙果细胞壁转化酶基因SmCWIN6的表达和酶活性鉴定
1
作者 郑乾明 晏霜 +1 位作者 解璞 王红林 《生物技术通报》 北大核心 2025年第8期267-275,共9页
【目的】细胞壁转化酶(cell wall invertase, CWIN)分解蔗糖生成葡萄糖和果糖,是高等植物糖代谢关键酶。探讨CWINs在红肉火龙果(Selenicereus monacanthus)果实可溶性糖代谢中的生理功能,为调控和改良果实风味和品质提供基础。【方法】... 【目的】细胞壁转化酶(cell wall invertase, CWIN)分解蔗糖生成葡萄糖和果糖,是高等植物糖代谢关键酶。探讨CWINs在红肉火龙果(Selenicereus monacanthus)果实可溶性糖代谢中的生理功能,为调控和改良果实风味和品质提供基础。【方法】提取成年态茎和各发育时期果肉的总蛋白,检测CWIN酶活性,分析SmCWIN家族序列结构域,利用基因数字表达谱和实时荧光定量PCR检测SmCWINs在花、茎、果皮和果肉中的表达模式,通过瞬时转化烟草叶肉细胞进行SmCWIN6的亚细胞定位,利用酿酒酵母表达并提取总蛋白,离体检测SmCWIN6的酶活性。【结果】红肉火龙果成年态茎的CWIN酶活性较低,在果实授粉后23 d时最高,此后,随果实成熟明显下降。红肉火龙果SmCWIN家族仅SmCWIN6含有蔗糖分解相关的结构域和保守的氨基酸残基。SmCWIN6在果实中表达,主要在授粉后20-25 d表达,此后,随果实发育逐渐下调表达,果实成熟时(授粉后30 d)表达微弱。亚细胞定位结合质壁分离试验表明,SmCWIN6蛋白定位于质外体,可能位于细胞壁。经酵母表达获得重组蛋白并离体检测,SmCWIN6可分解蔗糖产生葡萄糖和果糖,在p H=3.0具有最大酶活性。【结论】SmCWIN6在质外体分解蔗糖产生葡萄糖和果糖,主要在果实授粉后20-25 d表达,参与果实发育期间胞外可溶性糖代谢。 展开更多
关键词 火龙果 细胞壁转化酶 质外体 酵母表达 蔗糖分解
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基于转录组测序的红肉火龙果淀粉降解相关基因挖掘及表达分析
2
作者 魏治远 晏霜 +1 位作者 解璞 郑乾明 《南方农业学报》 北大核心 2025年第2期553-562,共10页
【目的】挖掘红肉火龙果淀粉降解相关基因并分析其在果实不同发育时期的表达模式,为阐明红肉火龙果果实成熟过程中的淀粉降解途径提供理论依据。【方法】供试红肉火龙果品种为软枝大红,选取4个不同发育时期(花后19 d、花后22 d、花后25 ... 【目的】挖掘红肉火龙果淀粉降解相关基因并分析其在果实不同发育时期的表达模式,为阐明红肉火龙果果实成熟过程中的淀粉降解途径提供理论依据。【方法】供试红肉火龙果品种为软枝大红,选取4个不同发育时期(花后19 d、花后22 d、花后25 d和花后28 d)果实进行转录组测序,以差异倍数(Fold Change)≥2且错误发现率(FDR)<0.01为标准,筛选不同发育时期果实间的差异表达基因(DEGs),进行GO功能注释和KEGG信号通路富集分析,通过实时荧光定量PCR验证转录组测序数据的可靠性并分析候选基因的表达模式。【结果】经转录组测序共获得22.84 Gb有效数据(Clean data),共获得76618317条有效序列(Clean reads),GC含量为44.78%~46.83%,Q20为98.89%~99.74%,Q30为96.73%~98.53%。与花后19 d相比,花后28 d共有4194个DEGs,其中1728个上调表达,2466个下调表达。GO功能注释分析结果表明,花后28 d与花后19 d比较组的DEGs注释到生物学过程、细胞成分和分子功能3个类别,在生物学过程中,涉及细胞过程的DEGs数量最多,其次是代谢过程。KEGG信号通路富集分析结果表明,花后28 d与花后19 d比较组的DEGs在淀粉和蔗糖代谢通路显著富集。筛选出红肉火龙果淀粉降解途径的10个相关基因,分别为葡聚糖水激酶(GWD)基因(HU02G00177)、磷酸葡聚糖水激酶(PWD)基因(HU09G02021)、磷酸葡聚糖磷酸酶(SEX)基因(HU07G01227)、β-淀粉酶(BAM)基因(HU10G00833、HU10G00777)、α-淀粉酶(AMY)基因(HU05G01323、HU02G00293、HU02G01323)、异淀粉酶(ISA)基因(HU11G01417)、歧化酶(DPE)基因(HU09G01260)。实时荧光定量PCR检测结果表明,10个淀粉降解基因的表达趋势与转录组测序数据一致。HU02G00177、HU07G01227、HU10G00833、HU10G00777、HU02G00293和HU11G01417基因相对表达量在果实发育后期均高于果实发育前期。【结论】红肉火龙果淀粉降解相关基因在果实不同发育时期的表达模式具有差异,其中GWD基因(HU02G00177)、SEX基因(HU07G01227)、BAM基因(HU10G00833、HU10G00777)、AMY基因(HU02G00293)、ISA基因(HU11G01417)可能在果实发育后期发挥重要作用。 展开更多
关键词 红肉火龙果 淀粉降解 差异表达基因 转录组
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红肉火龙果果糖激酶基因HpFRK2的克隆、表达与酶活性分析
3
作者 罗冬兰 巴良杰 +1 位作者 王红林 郑乾明 《热带作物学报》 北大核心 2025年第7期1546-1553,共8页
植物果糖激酶(fructokinase,FRK)特异性催化果糖磷酸化进入糖酵解途径,是果糖代谢和可溶性糖积累的关键酶。阐明红肉火龙果果实HpFRK2基因的表达模式及酶特性,为了解果实可溶性糖积累的分子机制并改良果实品质提供理论基础。本研究从红... 植物果糖激酶(fructokinase,FRK)特异性催化果糖磷酸化进入糖酵解途径,是果糖代谢和可溶性糖积累的关键酶。阐明红肉火龙果果实HpFRK2基因的表达模式及酶特性,为了解果实可溶性糖积累的分子机制并改良果实品质提供理论基础。本研究从红肉火龙果紫红龙品种中克隆HpFRK2基因,采用实时荧光定量PCR分析该基因表达模式,采用烟草叶肉细胞瞬时表达检测其亚细胞定位,通过原核表达获得重组蛋白并检测其酶活性。结果表明:HpFRK2基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1026bp,编码341个氨基酸。HpFRK2蛋白相对分子质量为36.95kDa,理论等电点为5.94。系统进化分析表明HpFRK2与木薯MeFRK2、番茄SlFRK1、苹果MdFRK1和拟南芥AtFRK1具有较近的亲缘关系。蛋白序列分析表明其含有磷酸果糖激酶B(phosphofructokinase type B,pfkB)家族保守结构域。HpFRK2在果实发育20d时的表达量最高,随着果实发育逐渐降低表达,30d时表达量最低;此外,HpFRK2在茎中的表达显著低于果实。亚细胞定位检测表明HpFRK2主要位于细胞质。构建原核表达载体在大肠杆菌表达,成功诱导获得HpFRK2重组蛋白。酶活性检测表明HpFRK2特异性催化果糖磷酸化,果糖对酶活性不具有底物抑制性,催化果糖磷酸化的Km值为1.84mmol/L。本研究结果表明,红肉火龙果HpFRK2蛋白位于细胞质,特异催化果糖磷酸化,主要在果实转色期(花后20~23 d)表达,可能负调控果实的果糖积累。 展开更多
关键词 红肉火龙果 果糖激酶 基因克隆 蛋白表达 酶活
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红肉火龙果果糖激酶基因HpFRK1克隆、表达与酶学活性分析 被引量：3
4
作者 解璞 晏霜 +1 位作者 王红林 郑乾明 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期1589-1596,共8页
【目的】克隆红肉火龙果果糖激酶基因,检测其表达和酶活性,解析其对果实发育可溶性糖积累的生理功能。【方法】从‘紫红龙’果肉克隆HpFRK1基因,进行生物信息学和亚细胞定位分析,利用qRT-PCR检测基因表达,通过大肠杆菌诱导表达获得重组... 【目的】克隆红肉火龙果果糖激酶基因,检测其表达和酶活性,解析其对果实发育可溶性糖积累的生理功能。【方法】从‘紫红龙’果肉克隆HpFRK1基因,进行生物信息学和亚细胞定位分析,利用qRT-PCR检测基因表达,通过大肠杆菌诱导表达获得重组蛋白并检测酶活性。【结果】HpFRK1的开放阅读框长度为993bp,编码330个氨基酸,具有磷酸果糖激酶B家族结构域。HpFRK1与甜菜BvFRK亲缘关系最近,均属于细胞质定位的FRKs。HpFRK1在成熟茎和不同发育时期果实均表达,在花后20d的果实表达量最高,随果实发育逐渐下调,花后30d(果实成熟)表达量最低。亚细胞定位检测表明HpFRK1主要定位于细胞核和细胞质。诱导获得的Hp-FRK1重组蛋白特异性催化果糖磷酸化(Km为11.01mmol/L)。【结论】HpFRK1在细胞质特异性催化果糖磷酸化,在红肉火龙果果实发育期间负调控果实可溶性糖积累。 展开更多
关键词 红肉火龙果 果糖激酶 基因克隆 表达分析 原核表达
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贵州不同产区蜂糖李果实糖酸组分差异及品质评价 被引量：3
5
作者 王红林 解璞 +4 位作者 马玉华 赵凯 王红 赵晓珍 郑乾明 《贵州农业科学》 CAS 2024年第8期84-93,共10页
【目的】探明贵州不同产区蜂糖李果实的糖酸品质特征,为提高蜂糖李果品质量整体水平和促进产业可持续发展提供参考。【方法】以贵州安顺4个种植区(AZNL、AZND、AZNJ和AZYH)、黔南州3个种植区(QNLF、QNLM和QNHD)以及贵阳(GXFS)、黔西南州... 【目的】探明贵州不同产区蜂糖李果实的糖酸品质特征,为提高蜂糖李果品质量整体水平和促进产业可持续发展提供参考。【方法】以贵州安顺4个种植区(AZNL、AZND、AZNJ和AZYH)、黔南州3个种植区(QNLF、QNLM和QNHD)以及贵阳(GXFS)、黔西南州(QXQG)、铜仁市(TYHG)和遵义市(ZSYX)种植的蜂糖李新鲜成熟果实为材料,考察果形指数和硬度等外观品质,检测分析果实糖酸组分及含量、可溶性固形物和可滴定酸含量等主要风味指标,并对果品品质22个指标进行主成分分析和系统聚类分析。【结果】11份蜂糖李果实糖含量为102.29~160.71 mg/g,糖组分以蔗糖含量最高,平均56.21 mg/g,山梨醇含量最低,仅20.71 mg/g;有机酸含量为5.29~7.89 mg/g,有机酸组分以苹果酸含量最高,平均达5.31 mg/g,抗坏血酸含量最低,仅0.04 mg/g。主成分分析共提取5个主成分,累积贡献率达92.89%,获得品质评价函数:F=0.361 F_(1)+0.241 F_(2)+0.153 F_(3)+0.107 F_(4)+0.066 F5。聚类分析显示,QXQG和AZNL各为一类,其余9个样品聚为一类,其中,AZNL和QXQG综合得分较高,品质最佳。【结论】贵州11份不同种植区蜂糖李果实品质依次为AZNL> QXQG> QNLF> AZNJ> AZND> QNLM> AZYH> QNHD> GXFS> ZSYX>TYHG。 展开更多
关键词 蜂糖李 糖组分 酸组分 品质评价 果形指数 果实硬度 可溶性固形物 可滴定酸
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红肉火龙果液泡转化酶基因HpVIN1的克隆、表达和酶活性鉴定 被引量：3
6
作者 郑乾明 晏霜 +2 位作者 王红林 解璞 马玉华 《热带作物学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期2524-2533,共10页
液泡转化酶(vacuolar invertase,VIN)不可逆地分解蔗糖生成葡萄糖和果糖,是可溶性糖代谢的关键酶,参与植物的生长发育、产量品质形成和抵御逆境。为探讨VIN基因在红肉火龙果(Hylocereus polyrhizus)可溶性糖代谢中的生理功能,从果实中克... 液泡转化酶(vacuolar invertase,VIN)不可逆地分解蔗糖生成葡萄糖和果糖,是可溶性糖代谢的关键酶,参与植物的生长发育、产量品质形成和抵御逆境。为探讨VIN基因在红肉火龙果(Hylocereus polyrhizus)可溶性糖代谢中的生理功能,从果实中克隆HpVIN1基因,开展序列比对、系统进化、基因表达、亚细胞定位、酵母生长互补分析和蔗糖分解活性检测。基于RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)扩增获得HpVIN1基因,其开放阅读框(open reading frame,ORF)长度为1935 bp,编码644个氨基酸。序列分析表明,HpVIN1含有转化酶催化蔗糖分解的关键结构域,且在N端含有液泡定位的相关序列。系统进化分析表明HpVIN1与猕猴桃、枇杷、苹果和葡萄的VINs具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR检测表明,HpVIN1在茎和果实转色期(花后20~25 d)的表达量较高,果实成熟期(花后30 d)表达微弱。HpVIN1融合绿色荧光蛋白在拟南芥叶肉原生质体瞬时表达表明HpVIN1定位于液泡膜和液泡。HpVIN1在蔗糖利用缺陷的酵母株系过表达,恢复酵母以蔗糖为唯一碳源的生长,证明HpVIN1具有蔗糖分解活性。酵母总蛋白的离体催化实验表明,HpVIN1分解蔗糖产生葡萄糖和果糖,蔗糖分解活性在pH 4.0时最大,并随pH的升高快速降低。研究结果表明,位于液泡内的HpVIN1具有分解蔗糖产生葡萄糖和果糖的酶活性,参与红肉火龙果茎和果实转色期的可溶性糖代谢。 展开更多
关键词 火龙果 液泡转化酶基因 蔗糖分解 亚细胞定位 酵母表达
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红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3的克隆及功能鉴定 被引量：2
7
作者 郑乾明 王红林 +2 位作者 王小柯 解璞 马玉华 《植物资源与环境学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期22-29,共8页
为了解α-淀粉酶在红肉火龙果〔Hylocereus polyrhizus(F.A.C.Weber)Britton et Rose〕果实淀粉降解中的作用,对红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3进行克隆和生物信息学分析,检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达,同时对HpAMY3重... 为了解α-淀粉酶在红肉火龙果〔Hylocereus polyrhizus(F.A.C.Weber)Britton et Rose〕果实淀粉降解中的作用,对红肉火龙果α-淀粉酶基因HpAMY3进行克隆和生物信息学分析,检测果实发育期间该酶的活性及其编码基因的表达,同时对HpAMY3重组蛋白的淀粉降解活性进行分析。结果表明:HpAMY3基因的开放阅读框长度为2742 bp,编码913个氨基酸;HpAMY3蛋白的理论相对分子质量为102370,理论等电点为pI 6.02,预测此蛋白位于叶绿体,且为亲水性蛋白。系统进化分析表明HpAMY3与拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕AtAMY3的亲缘关系最近,均属于AMYⅢ类。亚细胞定位实验结果显示HpAMY3定位于本氏烟草(Nicotiana benthamiana Domin)叶片的叶绿体,表明HpAMY3具有质体定位的特点。在授粉后20和23 d,红肉火龙果果实的α-淀粉酶活性较低;在授粉后25 d,α-淀粉酶活性显著(P<0.05)升高;在授粉后27和30 d,α-淀粉酶活性保持在较高水平。红肉火龙果果实的HpAMY3基因相对表达量在授粉后20和23 d较低,在授粉后25和27 d持续升高,在授粉后30 d略有降低。红肉火龙果果实发育期间α-淀粉酶活性与HpAMY3基因相对表达量的相关性较高(R^(2)=0.94)。体外淀粉降解活性实验结果显示:在含有HpAMY3重组蛋白的反应体系中均检测到麦芽糖和麦芽三糖,且二者含量极显著(P<0.01)高于含有载体对照pDR196的反应体系。综合上述结果,HpAMY3蛋白可能定位于红肉火龙果果实的淀粉体;在果实发育期间,HpAMY3基因上调表达,HpAMY3具有淀粉降解活性。 展开更多
关键词 红肉火龙果 Α-淀粉酶 果实发育 亚细胞定位 酵母表达 酶活
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红肉火龙果糖转运蛋白HpSWEET4b基因克隆、表达和转运活性鉴定 被引量：1
8
作者 郑乾明 晏霜 +1 位作者 解璞 王红林 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期2739-2748,共10页
【目的】探明红肉火龙果(Hylocereus polyrhizus)糖转运蛋白SWEET HpSWEET4b基因的表达模式、亚细胞定位和糖转运活性,为调控果实可溶性糖积累提供依据。【方法】采用反转录PCR(RT-PCR)从果肉cDNA克隆HpSWEET4b基因,开展序列比对和系统... 【目的】探明红肉火龙果(Hylocereus polyrhizus)糖转运蛋白SWEET HpSWEET4b基因的表达模式、亚细胞定位和糖转运活性,为调控果实可溶性糖积累提供依据。【方法】采用反转录PCR(RT-PCR)从果肉cDNA克隆HpSWEET4b基因,开展序列比对和系统进化分析。采用实时定量PCR(qRT-PCR)研究基因表达,融合荧光蛋白在烟草叶肉细胞瞬时表达研究亚细胞定位。在酵母己糖吸收缺陷株系表达HpSWEET4b,采用酵母生长互补和胞外酸化方法研究糖转运活性。【结果】HpSWEET4b基因的开放阅读框(ORF)长度为744 bp,编码247个氨基酸残基,蛋白相对分子质量为27.34 kDa,理论等电点为9.41。HpSWEET4b蛋白含有2个“MtN3_slv”(PFAM编号:PF03083.19)结构域,以及7个跨膜结构域。系统进化分析表明,HpSWEET4b与拟南芥AtSWEET4~AtSWEET8聚为一类,属于SWEET家族II类。HpSWEET4b在茎的表达量极低,在授粉后20 d的果肉表达量最高,并随果实发育显著下降。融合荧光蛋白在烟草叶肉细胞瞬时表达证明HpSWEET4b主要定位于细胞膜。经酵母生长互补检测,HpSWEET4b具有葡萄糖、果糖、2-脱氧葡萄糖和甘露糖转运活性,不具有山梨醇、甘露醇和半乳糖转运活性。葡萄糖和果糖均促进酵母胞外酸化,进一步证明HpSWEET4b的葡萄糖和果糖转运活性。【结论】红肉火龙果HpSWEET4b属于SWEET家族II类成员,定位于细胞膜,具有葡萄糖和果糖等己糖转运活性,主要在授粉后20~23 d的果肉参与质外体和胞质之间的己糖跨膜转运。 展开更多
关键词 红肉火龙果 果实发育 糖转运蛋白SWEET 基因克隆 表达分析 转运活性鉴定
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红肉火龙果HpHXK基因克隆、表达及酶学特性分析
9
作者 晏霜 解璞 +1 位作者 王红林 郑乾明 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期1396-1404,共9页
【目的】分析红肉火龙果催化己糖磷酸化糖酵解途径关键酶—己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因的克隆、表达及酶学特性,为研究HXK基因在果实可溶性糖积累过程中的作用机制及提高红肉火龙果果实品质提供理论依据。【方法】以红肉火龙果紫红龙... 【目的】分析红肉火龙果催化己糖磷酸化糖酵解途径关键酶—己糖激酶(Hexokinase,HXK)基因的克隆、表达及酶学特性,为研究HXK基因在果实可溶性糖积累过程中的作用机制及提高红肉火龙果果实品质提供理论依据。【方法】以红肉火龙果紫红龙的成熟茎组织及花后20、23、25、27和30 d的果实为研究对象,通过转录组测序获得HXK蛋白序列,反转录PCR克隆HXK基因,使用ExPASy、Plant-PLoc、Phobius和SMART等在线工具对HpHXK蛋白进行生物信息学分析,利用Clustal W进行氨基酸序列多重比对,采用MEGA 7.0邻接法(Neighbor-joining,NJ)构建系统发育进化树;构建pGEX-4T-HpHXK载体并转化至烟草叶片;分析HpHXK基因在不同组织中的表达模式并利用比色法测定重组蛋白的酶活性。【结果】HpHXK基因开放阅读框(ORF)长度为1410 bp,编码469个氨基酸残基。生物信息学分析表明,HpHXK蛋白相对分子量为52.47 kD,理论等电点(pI)为5.42,该蛋白具有HXK特征结构域。系统发育进化树结果显示,HpHXK序列与水稻、拟南芥、苹果、梨、葡萄和枇杷的HXKs聚为一类。HpHXK基因在花后20 d果实中的相对表达量最高,显著高于花后25、27和30 d果实及成熟茎(P<0.05)。亚细胞定位结果显示,HpHXK蛋白定位于细胞质和细胞膜。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测结果显示,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后,重组质粒表达产物与预期相对分子质量一致,表明成功获得HpHXK重组蛋白。HpHXK蛋白对葡萄糖[米氏常数(Km)=0.61 mmol/L]的亲和力高于果糖(K_(m)=2.92 mmol/L)。【结论】HpHXK蛋白具有HXK家族保守结构域,在红肉火龙果果实发育期间,HpHXK基因负向调控果实可溶性糖积累,在细胞质中催化以葡萄糖为主的己糖磷酸化。 展开更多
关键词 火龙果 HXK基因 表达特征 酶学特性 载体构建
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