目的构建携带C57BL/6小鼠雌激素受体α(estrogen receptorα,Erα)的重组慢病毒,感染原代培养的小鼠神经细胞,观察是否能提高Erα的表达,为进一步研究Erα与神经系统疾病的关系奠定基础。方法将Erα基因片段插入慢病毒主体载体LV-GFP-fl...目的构建携带C57BL/6小鼠雌激素受体α(estrogen receptorα,Erα)的重组慢病毒,感染原代培养的小鼠神经细胞,观察是否能提高Erα的表达,为进一步研究Erα与神经系统疾病的关系奠定基础。方法将Erα基因片段插入慢病毒主体载体LV-GFP-flag,构建重组慢病毒载体LV-Erα-flag。通过琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)、基因测序验证后,将LV-Erα-flag与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染293T细胞,测定病毒滴度,获得携带Erα基因的重组慢病毒V-Erα-flag。无血清培养C57BL/6小鼠的神经细胞,对照病毒V-GFP-flag感染神经细胞,在荧光显微镜下每天观察荧光表达情况,用流式细胞仪检测感染效率和凋亡率以获得最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。然后用最佳MOI值的重组慢病毒V-Erα-flag感染神经细胞,采用实时定量PCR、蛋白质印迹方法检测感染后细胞中Erα的转录和蛋白表达水平。结果 AGE及测序鉴定均表明重组慢病毒载体构建成功,包装、扩增后得到V-Erα-flag,感染滴度为2×108 TU/ml;MOI=5的对照病毒V-GFP-flag能感染神经细胞,感染效率达(89.8±4.03)%,而凋亡率仅为(3.6±0.29)%。神经细胞至少能存活8周,在此期间GFP能持续表达,说明慢病毒能有效而稳定感染神经细胞。用MOI=5的V-Erα-flag感染神经细胞后,能显著增强神经细胞中的ErαmRNA和蛋白表达水平。结论成功构建了携带Erα基因的重组慢病毒,其能成功感染神经细胞,使ErαmRNA和蛋白表达水平增高。展开更多
文摘目的构建携带C57BL/6小鼠雌激素受体α(estrogen receptorα,Erα)的重组慢病毒,感染原代培养的小鼠神经细胞,观察是否能提高Erα的表达,为进一步研究Erα与神经系统疾病的关系奠定基础。方法将Erα基因片段插入慢病毒主体载体LV-GFP-flag,构建重组慢病毒载体LV-Erα-flag。通过琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresis,AGE)、基因测序验证后,将LV-Erα-flag与包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共同转染293T细胞,测定病毒滴度,获得携带Erα基因的重组慢病毒V-Erα-flag。无血清培养C57BL/6小鼠的神经细胞,对照病毒V-GFP-flag感染神经细胞,在荧光显微镜下每天观察荧光表达情况,用流式细胞仪检测感染效率和凋亡率以获得最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)。然后用最佳MOI值的重组慢病毒V-Erα-flag感染神经细胞,采用实时定量PCR、蛋白质印迹方法检测感染后细胞中Erα的转录和蛋白表达水平。结果 AGE及测序鉴定均表明重组慢病毒载体构建成功,包装、扩增后得到V-Erα-flag,感染滴度为2×108 TU/ml;MOI=5的对照病毒V-GFP-flag能感染神经细胞,感染效率达(89.8±4.03)%,而凋亡率仅为(3.6±0.29)%。神经细胞至少能存活8周,在此期间GFP能持续表达,说明慢病毒能有效而稳定感染神经细胞。用MOI=5的V-Erα-flag感染神经细胞后,能显著增强神经细胞中的ErαmRNA和蛋白表达水平。结论成功构建了携带Erα基因的重组慢病毒,其能成功感染神经细胞,使ErαmRNA和蛋白表达水平增高。
