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PKMYT1在糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡中的作用
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作者 杨成友 罗鸿 +6 位作者 王涛 谢志鸿 梁亮 李凡超 吴建华 张飞 彭吾训 《中国运动医学杂志》 北大核心 2025年第5期381-393,共13页
目的:探讨膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(PKMYT1)在糖皮质激素(GC)诱导的成骨细胞(OB)凋亡中的作用,为早期激素性股骨头坏死(SANFH)提供理论基础和治疗靶点。方法:(1)选取小鼠颅盖骨成骨样细胞(MC3T3-E1)进行研究,control组使用普通培... 目的:探讨膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(PKMYT1)在糖皮质激素(GC)诱导的成骨细胞(OB)凋亡中的作用,为早期激素性股骨头坏死(SANFH)提供理论基础和治疗靶点。方法:(1)选取小鼠颅盖骨成骨样细胞(MC3T3-E1)进行研究,control组使用普通培养基培养,实验组进行成骨诱导培养,通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色(ARS)验证成骨能力。使用不同浓度的GC处理小鼠成骨细胞(mOB),通过膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)双染色法检测细胞凋亡,细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测细胞增殖,蛋白质免疫印迹(WB)检测抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)和促凋亡蛋白切割的半胱天冬酶-3和切割的半胱天冬酶-9(cleaved caspase 3/9)的表达。通过蛋白组学测序找出可能调控GC诱导mOB凋亡的分子。进一步通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及WB分析PKMYT1表达。(2)选择不同浓度PKMYT1抑制剂GSK-1520489A处理mOB,以筛选合适抑制剂浓度,进一步分组为control组、GC组、GSK-1520489A组和GC+GSK-1520489A组,通过WB检测各组细胞PKMYT1和凋亡相关蛋白BCL-2、cleaved caspase 3/9的表达,CCK8实验检测细胞活性及细胞毒性,5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EDU)检测细胞增殖,细胞活死染色和AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测凋亡。(3)使用PKMYT1过表达慢病毒感染mOB,通过免疫荧光、q PCR和WB验证过表达效率。过表达PKMYT1成功后,将细胞分为control组、GC组、PKMYT1过表达(OE)组和OE+GC组,通过EDU检测细胞增殖,AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法和细胞活死染色检测凋亡。(4)为了验证人成骨细胞(hOB)中PKMYT1变化,选取健康人股骨头提取的hOB为control组,激素性股骨头缺血性坏死(hSANFH)患者股骨头提取的hOB为hSANFH组,通过qPCR和WB检测两组细胞中PKMYT1表达。结果:(1)小鼠颅盖骨成骨样细胞(MC3T3-E1)诱导分化成熟后,在GC作用下,相较于control组,实验组中随着GC浓度增加,AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测显示mOB凋亡细胞比例增多(P<0.01);CCK8实验显示细胞活性降低(P<0.01);WB检测显示BCL-2表达降低(P<0.01)、cleaved caspase 3/9表达均升高(P<0.01)。蛋白组学测序显示GC处理成熟的mOB后PKMYT1表达降低。(2)不同浓度PKMYT1抑制剂GSK-1520489A处理m OB,随着浓度增加,细胞活性降低,细胞毒性增加(P<0.001)。相对于control组,GSK-1520489A组中m OB增殖减少(P<0.001),mOB凋亡增多(P<0.001);相较于单独使用GC组,使用GC+GSK-1520489A组中m OB增殖减少(P<0.05),mOB凋亡增多(P<0.01)。(3)过表达PKMYT1后,相对于control组,OE组中mOB增殖增加(P<0.001),m OB凋亡未见明显增多(P>0.05)。相对于GC组,OE+GC组中m OB增殖增加(P<0.001),m OB凋亡减少(P<0.001)。(4)在人股骨头组织中提取hOB,q PCR和WB结果表明hSANFH组中PKMYT1表达低于control组(P<0.001)。结论:PKMYT1表达下调促进GC诱导的m OB凋亡;相反,过表达PKMYT1抑制GC诱导的mOB凋亡。PKMYT1可能成为SANFH早期治疗的潜在靶点。 展开更多
关键词 激素性股骨头坏死 PKMYT1 成骨细胞 凋亡 增殖
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MEN1缺失通过诱导DNA损伤累积抑制乳腺癌细胞的恶性表型 被引量：3
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作者 梁黎 杨云巧 +8 位作者 朱佳美 潘婷 周润蕾 邓英蕾 陈腾祥 郭兵 李海洋 金帮明 毛大华 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期616-625,共10页
目的:探讨多发性内分泌肿瘤1型综合征(multiple endocrine neoplasia type 1,MEN1)编码基因MEN1在乳腺癌细胞恶性表型调控中的作用及分子机制。方法:TCGA数据库分析乳腺癌组织(n=1097)和正常乳腺组织(n=114)中MEN1基因的mRNA表达水平;... 目的:探讨多发性内分泌肿瘤1型综合征(multiple endocrine neoplasia type 1,MEN1)编码基因MEN1在乳腺癌细胞恶性表型调控中的作用及分子机制。方法:TCGA数据库分析乳腺癌组织(n=1097)和正常乳腺组织(n=114)中MEN1基因的mRNA表达水平;收集临床乳腺癌组织标本(n=13)和癌旁组织(n=4),采用RT-qPCR和免疫组化法检测其中MEN1基因的mRNA水平和menin蛋白的表达;CRISPR/Cas9技术构建MEN1基因敲除的MDA-MB-231(MDA-MB-231/KO)细胞,细胞经menin-MLL抑制剂MI-3单独或联合甲基硝基亚硝基胍(N-meth⁃yl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG)、阿霉素(doxorubicin,DOX)、紫杉醇(paclitaxel,TAX)、他莫昔芬(tamoxifen,TAM)作用后运用CCK-8、克隆形成实验、EdU染色及流式细胞术分别检测细胞增殖和细胞凋亡,免疫荧光染色法检测细胞γH2AX和53BP1的表达,Western blot法检测细胞γH2AX、RAD51、BRCA1、53BP1、KU70和KU80的蛋白表达。结果:TCGA数据库分析结果显示,与正常乳腺组织比较,MEN1基因在乳腺癌组织中的表达量显著增高(P<0.05);免疫组化和RT-qPCR结果显示,与癌旁组织比较,menin的蛋白水平和MEN1的mRNA水平显著升高(P<0.05);MEN1基因敲除或MI-3作用显著抑制乳腺癌细胞的增殖,诱导细胞凋亡,增强乳腺癌细胞对MNNG的敏感性(P<0.05);免疫荧光结果显示,MEN1基因敲除显著增强MDA-MB-231细胞核中γH2AX的染色强度而降低53BP1的染色强度(P<0.05);Western blot结果显示,MEN1基因敲除显著抑制MDA-MB-231细胞中RAD51、BRCA1及53BP1的蛋白表达,而促进KU70和KU80蛋白的表达(P<0.05)。结论:MEN1基因是乳腺癌诱导因子,MEN1缺失可抑制同源重组修复而代偿性激活非同源末端连接,引起乳腺癌细胞中DNA损伤累积,增强乳腺癌细胞对DNA损伤诱导剂的敏感性。 展开更多
关键词 MEN1基因 乳腺癌 DNA损伤 同源重组修复 非同源末端连接
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营养元素和蛋白联合干预氟中毒对雌鼠卵巢功能作用 被引量：6
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作者 王飞清 夏曙华 +2 位作者 邹文兵 杨华 喻茂娟 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第7期52-57,共6页
目的探讨钙、镁、铜、锌、维生素D和蛋白联合干预燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢功能变化。方法 120只体重80 g左右的清洁级SD雌性大鼠为研究对象,随机分为对照组、染氟组、多种元素组、多种元素+蛋白组,每组30只。各模型组大鼠自由食用不同配... 目的探讨钙、镁、铜、锌、维生素D和蛋白联合干预燃煤型氟中毒对雌鼠卵巢功能变化。方法 120只体重80 g左右的清洁级SD雌性大鼠为研究对象,随机分为对照组、染氟组、多种元素组、多种元素+蛋白组,每组30只。各模型组大鼠自由食用不同配方的病区原煤加拌泥煤烘烤的玉米饲料。分别于染氟60,120,180 d处死雌鼠,分离双侧卵巢。免疫组化法检测卵巢颗粒细胞凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表达。HE染色光镜下观察卵巢组织形态、各级卵泡数量变化。结果卵巢颗粒细胞Bcl-2蛋白表达量差异无显著性。各组与染氟组Bax蛋白比较,120 d和180 d差异有显著性(P<0.05),180 d两干预组比较差异有显著性(P<0.05)。各组内比较,染氟组Bax蛋白表达量逐渐增多,差异有显著性(P<0.05)。多种元素组60 d与180 d比较差异有显著性(P<0.05)。染氟组随时间延长,卵巢颗粒细胞呈现渐进性水肿的变化,闭锁的卵泡和黄体退化逐渐增多。两干预组卵巢颗粒细胞少见轻度水肿,正常的各级卵泡多见,闭锁的卵泡和退化的黄体明显降低;与染氟组相比,60 d对照组和多种元素+蛋白组闭锁卵泡降低,差异有显著性(P<0.05);120 d和180 d对照组、两干预组差异有显著性(P<0.05)。结论钙、镁、铜、锌、维生素D可拮抗燃煤型氟中毒对卵巢生殖毒性降低Bax蛋白的表达量,降低闭锁卵泡数量,同时添加蛋白联合干预效果更佳。 展开更多
关键词 燃煤型氟中毒 卵巢功能 营养元素 干预
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