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PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定
被引量:
4
1
作者
张煜彬
叶路芬
+6 位作者
吴忠秀
薛维娜
何彬
杨畅
李勇军
王永林
刘亭
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第7期42-49,共8页
为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重...
为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功.PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDS-PAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。
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关键词
大肠杆菌表达系统
EGFRvⅢ
表达条件优化
亲和层析
蛋白质印迹法
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职称材料
题名
PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定
被引量:
4
1
作者
张煜彬
叶路芬
吴忠秀
薛维娜
何彬
杨畅
李勇军
王永林
刘亭
机构
贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室/省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室
贵州
医科
大学
民族药与中药开发应用教育
部
工程研究中心
贵州
医科
大学
医药卫生管理学院
贵州
医科
大学
药学院
出处
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第7期42-49,共8页
基金
国家自然科学基金项目(81603189)
贵阳医学院院基金项目([2013]12)
+2 种基金
贵州省教育厅大学生创新创业项目(20195200937)
黔科中引地项目([2018]4006)
黔科合平台人才项目([2016]5613/5677)。
文摘
为了构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant typeⅢ,EGFRvⅢ)的单链抗体PD0721的大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,作者研究了PD0721重组蛋白在大肠杆菌BL21中的最佳表达条件,并建立相应的重组蛋白质纯化方法。首先构建重组表达质粒PD0721-pET-22b(+)并转化至大肠杆菌BL21中,再利用SDS-PAGE研究不同诱导剂IPTG浓度、不同诱导温度、不同诱导时间和不同菌体浓度对PD0721重组蛋白表达的影响。利用镍柱亲和层析开发PD0721重组蛋白的纯化方法,并使用蛋白质印迹法以及N端测序法对纯化后的蛋白质进行鉴定。菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳表明,PD0721-pET-22b(+)重组质粒及PD0721重组大肠杆菌BL21构建成功.PD0721重组蛋白在体外原核表达的最佳诱导剂浓度为0.6μmol/L,最佳温度为15℃,最佳诱导时间为12 h,最佳菌体浓度OD600约为0.6。经过Ni2+柱亲和层析后,当咪唑的浓度为150 mmol/L,可以得到纯度较高的PD0721重组蛋白。SDS-PAGE电泳和Western Blotting结果表明,重组蛋白质产物的相对分子质量约为31000,与理论相对分子质量一致,蛋白质的N端测序也与设计序列一致。作者成功构建了抗EGFRvⅢ抗体PD0721重组蛋白的体外原核表达体系,优化了最佳表达条件,并提供了纯化重组PD0721蛋白的可行方法。
关键词
大肠杆菌表达系统
EGFRvⅢ
表达条件优化
亲和层析
蛋白质印迹法
Keywords
E.coli expression system
EGFRvⅢ
optimization of expression conditions
affinity chromatography
western blotting
分类号
Q511 [生物学—生物化学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
PD0721单链抗体的体外原核表达条件优化及蛋白质鉴定
张煜彬
叶路芬
吴忠秀
薛维娜
何彬
杨畅
李勇军
王永林
刘亭
《食品与生物技术学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
4
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