目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导...目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于基因治疗研究。方法酶切含有EGFP基因和启动子以及含有米非司酮调控系统的质粒pRS-17,亚克隆到穿梭质粒PDC313上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,利用报告基因引物对病毒进行鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用最终稀释法测定其滴度,并在SW620细胞中检测其基因调控效果。结果成功地构建了携带有米非司酮调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RUEGFP,病毒滴度达到6.6×1010pfu/ml。当给予诱导剂米非司酮后,腺病毒载体可以诱导表达EGFP,两者在一定范围内呈正比,而没有米非司酮时,几乎无报告基因的表达。结论腺病毒Ad-RUEGFP能调控外源基因的表达,为下一步体内基因治疗实验奠定了实验基础。展开更多
文摘目的在基因表达和基因治疗研究中,目的基因过度表达或不适当的表达将影响实验结果,实现对目的基因表达时间和表达水平的精确调控是关键问题。文中旨在构建带绿色荧光蛋白(enhanced green fluorecence protein,EGFP)并可经米非司酮诱导表达的重组腺病毒载体,以期用于基因治疗研究。方法酶切含有EGFP基因和启动子以及含有米非司酮调控系统的质粒pRS-17,亚克隆到穿梭质粒PDC313上,筛选阳性克隆,测序鉴定正确,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体,利用报告基因引物对病毒进行鉴定,扩增后用氯化铯密度梯度离心纯化病毒,用最终稀释法测定其滴度,并在SW620细胞中检测其基因调控效果。结果成功地构建了携带有米非司酮调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RUEGFP,病毒滴度达到6.6×1010pfu/ml。当给予诱导剂米非司酮后,腺病毒载体可以诱导表达EGFP,两者在一定范围内呈正比,而没有米非司酮时,几乎无报告基因的表达。结论腺病毒Ad-RUEGFP能调控外源基因的表达,为下一步体内基因治疗实验奠定了实验基础。
