重组基因c-Aβ-c的构建及其表达蛋白的免疫原性分析 被引量：8

1

作者 冯改丰 胡海涛 +3 位作者 李月英 韩华 王全颖 杨广笑 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期533-537,共5页

目的: 构建原核表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白c-Aβ-c的免疫原性,为阿尔茨海默病(AD)基因工程疫苗的研究打下基础.方法: 采用PCR法,分别扩增编码HBcAg的1～71、88～144氨基酸的基因片断(HBc1～71和HBc88～14... 目的: 构建原核表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,并在大肠杆菌中表达,观察融合蛋白c-Aβ-c的免疫原性,为阿尔茨海默病(AD)基因工程疫苗的研究打下基础.方法: 采用PCR法,分别扩增编码HBcAg的1～71、88～144氨基酸的基因片断(HBc1～71和HBc88～144),以及编码淀粉样肽Aβ1-42的基因.将后者连接于HBc1～71和HBc88～144之间,构建重组质粒pGEMEX/c-Aβ-c,并将重组基因亚克隆于原核表达载体pHGhis中,构建表达质粒pHGhis/c-Aβ-c,通过温度诱导表达.用SDS-PAGE(考马斯亮蓝染色)检测融合基因的表达.以融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA法检测小鼠血清中抗-Aβ抗体的滴度.结果: 经酶切鉴定、DNA序列测定证实,融合基因重组于表达质粒之中,表达质粒与理论设计相符.诱导表达后,表达蛋白约占细菌沉淀的16%.BALB/c小鼠经3次免疫后,其血清中抗-Aβ抗体的滴度可达1∶16 000,且检测不到抗-HBcAg抗体.结论: c-Aβ-c融合基因在大肠杆菌中可高效表达,表达的融合蛋白具有较强的免疫原性. 展开更多

关键词 融合蛋白 β-淀粉样肽(Aβ) 基因工程疫苗 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

融合基因Aβ-HBcAg的原核表达及表达蛋白的免疫反应性和免疫原性分析 被引量：6

2

作者 胡海涛 冯改丰 +2 位作者 董炜疆 王全颖 杨广笑 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期220-222,共3页

目的　研究 β 淀粉样肽 (β amyloidpeptide,Aβ)与乙型肝炎核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,检测融合蛋白的免疫反应性及免疫原性。方法　将重组质粒pBV2 2 0 /Aβ HBcAg转化大肠杆菌DH5α,温控表达 ,超声破碎细菌 ,通... 目的　研究 β 淀粉样肽 (β amyloidpeptide,Aβ)与乙型肝炎核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,检测融合蛋白的免疫反应性及免疫原性。方法　将重组质粒pBV2 2 0 /Aβ HBcAg转化大肠杆菌DH5α,温控表达 ,超声破碎细菌 ,通过SDS PAGE、考马斯亮蓝染色和ELISA等方法 ,观察Aβ HBcAg的表达及融合蛋白的免疫反应性 ;用融合蛋白免疫Balb/c小鼠 ,ELISA法检测血清中的抗 Aβ抗体和抗 HBc抗体滴度。结果　融合蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中 ,表达量为菌体沉淀的 5 % ,融合蛋白既有Aβ的免疫反应性 ,又有HBcAg的免疫反应性。Balb/c小鼠经过 3次免疫后 ,血清中的抗体滴度很低 ,继续强化免疫 2次后 ,血清中抗 Aβ抗体滴度、抗 HBc抗体滴度分别上升为 1∶80 0和1∶32 0 0。结论　融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达 ,表达蛋白有一定的免疫反应性和免疫原性 ,但表达量较低 ,免疫反应性和免疫原性较弱。提示融合基因Aβ HBcAg的表达量和融合蛋白免疫原性的提高尚需进一步研究。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 Β淀粉样肽 HBcAg免疫反应性 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

EGFRvⅢ与HBcAg重组疫苗抗肿瘤作用的实验研究 被引量：4

3

作者 段小艺 王健生 +3 位作者 郭佑民 王鹏 王全颖 杨广笑 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期600-602,共3页

目的:观察PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗的体内抗肿瘤作用。方法:BALB/c小鼠30只随机分成3组,分别接种PEP-3/HBcAg融合蛋白、HBcAg和生理盐水,待融合蛋白组小鼠体内抗体效价达到1:20000时终止免疫,于每只小鼠背部皮下种植阳性Renca细胞,2... 目的:观察PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗的体内抗肿瘤作用。方法:BALB/c小鼠30只随机分成3组,分别接种PEP-3/HBcAg融合蛋白、HBcAg和生理盐水,待融合蛋白组小鼠体内抗体效价达到1:20000时终止免疫,于每只小鼠背部皮下种植阳性Renca细胞,2×105个/只。观察融合蛋白疫苗的抗肿瘤效应。采用HE染色和免疫组织化学图像分析法检测各组肿瘤组织的坏死情况和EGFRvIII表达水平。结果:融合蛋白组、HBcAg组和生理盐水组的成瘤率分别为50%、100%和100%。生理盐水组肿瘤生长速度最快,HBcAg组次之,融合蛋白组肿瘤出现最晚,生长速度最慢。融合蛋白组成瘤小鼠肿瘤平均质量显著小于生理盐水组和HBcAg组(t=4·731,P=0·044;t=6·890,P=0·040);后两组肿瘤质量无统计学意义(t=0·024,P=0·382)。HBcAg组和生理盐水组移植瘤呈不完全小片状坏死,融合蛋白组移植瘤呈大片状坏死,伴炎细胞浸润。融合蛋白组EGFRvⅢ表达水平明显低于生理盐水组和HBcAg组(t=3·157,P=0·006;t=2·539,P=0·021),后两者EGFRvIII表达水平无统计学差异(t=0·460,P=0·651)。结论:PEP-3/HBcAg融合蛋白疫苗能诱导机体产生保护性免疫反应,并具有抗肿瘤作用。 展开更多

关键词 重组疫苗 PEP-3/HBcAg融合蛋白 免疫应答 恶性肿瘤

在线阅读 下载PDF 职称材料

人脑源性神经营养因子重组腺伴随病毒的制备 被引量：3

4

作者 马东亮 胡海涛 +3 位作者 王建明 任惠民 刘勇 杨广笑 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期431-433,437,共4页

目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDN... 目的　构建并产生人脑源性神经营养因子 (humanbrain derivedneurotrophicfactor ,hBDNF)重组腺伴随病毒(adeno associatedvirus,AAV)载体。方法　将目的基因hBDNF插入载体质粒pSSHG Neo的EcoRI BamHI位点 ,构建重组质粒pSSHG Neo/hBDNF。用腺病毒辅助质粒 pFG14 0代替野生型腺病毒 ,包装质粒 pAAV/Ad及已构建的重组质粒 ,三质粒磷酸钙共沉淀法转染 80 %融合的 14 3细胞系 ,包装AAV hBDNF。经蔗糖梯度离心法纯化、斑点杂交方法测定重组病毒滴度。结果　重组病毒AAV hBDNF滴度约为 4 .86× 10 14 颗粒·L-1。结论　成功制备了重组病毒AAV hBDNF 。 展开更多

关键词 人脑源性神经营养因子 腺伴随病毒 神经退行性疾病 基因治疗

在线阅读 下载PDF 职称材料

β-淀粉样肽与乙型肝炎核心抗原融合基因Aβ-HBcAg表达载体的构建 被引量：4

5

作者 冯改丰 胡海涛 +2 位作者 刘中华 王全颖 杨广笑 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期9-13,共5页

目的　构建 β 淀粉样肽 ( β amyloidpeptide ,Aβ)与乙肝核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg ,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究和制备奠定基础。 方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含... 目的　构建 β 淀粉样肽 ( β amyloidpeptide ,Aβ)与乙肝核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg ,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究和制备奠定基础。 方法　采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的Aβ1- 42肽的cDNA ,将其连接到删除了Pre C区的HBcAg亚型ayw基因的N端组成融合基因Aβ HBcAg ,再将该融合基因亚克隆于载体 pBV2 2 0 ,构建为原核表达载体pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。 结果　经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将Aβ1- 42cDNA重组到HBVcore的N端 ,并将融合基因亚克隆于 pBV2 2 0内。 结论　成功构建了原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。 展开更多

关键词 Β-淀粉样肽 乙型肝炎核心抗原 融合基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选 被引量：4

6

作者 韩东刚 段小艺 +3 位作者 郭佑民 周琦 王全颖 杨广笑 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期25-29,共5页

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段... 目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子质量为28000左右。ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性。结论成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体。 展开更多

关键词 噬菌体展示技术 单链抗体 表皮生长因子受体Ⅲ型突变体 筛选

在线阅读 下载PDF 职称材料

NT4-p53(N15)-Ant融合基因的克隆和鉴定 被引量：4

7

作者 宋丽萍 李跃萍 +2 位作者 邱曙东 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期333-336,共4页

目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒... 目的构建NT4-p53(N15)-Ant融合基因表达盒并进行序列分析。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法克隆p53(N15)-Ant基因,筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序。扩增阳性重组质粒后限制性内切酶切取p53(N15)-Ant片段连入pBV220/NT4质粒。结果克隆了p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;重组质粒pBV220/NT4p53(N15)Ant经限制性内切酶及琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和理论值一致。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了含有NT4-p53(N15)-Ant表达盒的pBV220质粒,为进一步开展肿瘤的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 p53(N15)-Ant NT4信号肽 基因克隆 肿瘤

在线阅读 下载PDF 职称材料

EGFRvIII/PEP-3 cDNA与HBcAg重组基因原核表达载体的构建、表达与免疫分析 被引量：2

8

作者 段小艺 王健生 +3 位作者 郭佑民 韩俊丽 王全颖 杨广笑 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期21-24,共4页

目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中... 目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a(+)载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。 展开更多

关键词 重组基因 EGFRvⅢ HBCAG 原核表达 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

NT4-p53(N15)-Ant融合基因重组腺病毒的构建与鉴定 被引量：3

9

作者 宋丽萍 李跃萍 +2 位作者 邱曙东 杨广笑 王全颖 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第3期214-218,共5页

目的:构建编码融合基因NT4-p53(N15)-Ant的重组腺病毒表达载体,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法:利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得p53(N15)-Ant基因克隆,酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N15... 目的:构建编码融合基因NT4-p53(N15)-Ant的重组腺病毒表达载体,为进一步基因治疗的实验研究奠定基础。方法:利用PCR体系延伸互为模板的引物,通过T载体克隆法获得p53(N15)-Ant基因克隆,酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N15)-Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒PJM17共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒Ad.NT4-p53(N15)-Ant,收集病毒上清,大量扩增并测定其滴度,用RT-PCR检测目的基因在293细胞的表达情况。MTT比色法观察重组病毒对HepG2细胞存活率的影响。结果:克隆出p53(N15)-Ant基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(1×1011pfu/ml)重组腺病毒表达载体;反转录聚合酶链反应证实感染Ad.NT4-p53(N15)-Ant的293细胞中有目的基因的表达。Ad.NT4-p53(N15)-Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤作用,与Ad.GFP比较,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒处理组HepG2细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-p53(N15)-Ant复制缺陷型重组腺病毒,为下一步的肿瘤基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 NT4-p53(N15)-Ant 重组腺病毒 肿瘤 基因治疗

在线阅读 下载PDF 职称材料

重组质粒pYTA/Aβ-HBcAg的构建及其在大肠杆菌中的表达 被引量：2

10

作者 冯改丰 胡海涛 +2 位作者 董炜疆 王全颖 杨广笑 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第6期671-674,共4页

目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质... 目的 :研究 β 淀粉样肽 (Aβ)与HBcAg的融合基因Aβ HBcAg的原核表达 ,并检测表达的融合蛋白Aβ HBcAg的免疫原性。方法 :从重组质粒 7Z/Aβ HBcAg中 ,切下含Aβ HBcAg的基因片段 ,将其融合于质粒pYTA1的lac启动子之后 ,构建重组表达质粒pYTA/Aβ HBcAg。以此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在IPTG诱导下表达。超声破碎表达的细菌 ,通过SDS PAGE及考马斯亮蓝染色 ,检测融合蛋白Aβ HBcAg的表达。采用ELISA法检测融合蛋白的反应原性。融合蛋白经饱和硫酸铵盐析法分离和纯化后免疫BALB/c小鼠 ,用ELISA法检测血清中抗 Aβ抗体的滴度。 结果 :融合蛋白以可溶性形式存在于细菌裂解液的上清中 ,其表达量为菌体总蛋白量的 7%。表达的融合蛋白既有Aβ的反应原性 ,又有与HBcAg的反应原性。经 3次免疫后 ,BALB/c小鼠血清中抗 Aβ抗体的滴度最高可达为 1∶16 0 0 0。结论 :融合基因Aβ HBcAg可在大肠杆菌DH5α中表达。表达产物为可溶性蛋白 ,存在于细菌裂解液的上清中 ,具有较强的免疫原性。 展开更多

关键词 阿尔茨海默病 Β-淀粉样肽 HBCAG 免疫原性 疫苗

在线阅读 下载PDF 职称材料

腺病毒介导的NT4p53(N15)Ant异源融合基因对肝癌细胞的杀伤作用 被引量：2

11

作者 李跃萍 邱曙东 +2 位作者 宋丽萍 王全颖 杨广笑 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期936-940,共5页

目的构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应。方... 目的构建包括神经营养因子4(NT4)信号肽,p53氨基端短活性肽(12～26位氨基酸)及蛋白质转导结构域-黑腹果蝇触足肽(Ant)序列在内的异源融合基因,并以腺病毒作为基因转移载体观察NT4p53(N15)Ant基因在体外对肝癌细胞系HepG2的杀伤效应。方法应用互为模板的引物PCR技术及T载体克隆法获得p53(N15)Ant基因克隆,经酶切后连入pBV220/NT4质粒,再将融合基因NT4p53(N15)Ant亚克隆至腺病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pJM17共转染HEK293细胞,通过同源重组获得重组腺病毒,经PCR鉴定后,NT4p53(N15)Ant重组腺病毒感染HepG2细胞,用MTT比色法和PI染色流式细胞计数仪分析Ad.NT4p53(N15)Ant对肿瘤细胞和正常细胞的杀伤效应及凋亡率。结果克隆出NT4p53(N15)Ant基因,得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA经PCR证实含目的基因。MTT测定结果显示,与平行对照病毒Ad.GFP相比,Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,且以病毒感染后48h作用最为明显,对肿瘤细胞抑制率达到63.3%,而对正常细胞NIH3T3的影响很小。Ad.NT4p53(N15)Ant感染HepG2细胞30h后的流式细胞仪分析结果显示:Ad.NT4p53(N15)Ant可使HepG2细胞发生凋亡,凋亡率为18.16%。结论通过分子克隆体外重组技术我们首次成功制备了NT4p53(N15)Ant复制缺陷型重组腺病毒;初步的研究发现Ad.NT4p53(N15)Ant对HepG2细胞有强烈的杀伤效应,这种效应部分是通过诱导HepG2细胞的凋亡而实现的。 展开更多

关键词 神经营养因子4信号肽 p53 蛋白质转导结构域 腺病毒载体 HEPG2细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建 被引量：2

12

作者 王全师 王欣璐 +3 位作者 李华 王巧愚 王全颖 杨广笑 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第12期1715-1719,共5页

目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列... 目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 RNA干扰 逆转录病毒载体 人端粒酶逆转录酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

β淀粉样前体蛋白裂解酶特异性小干扰RNA真核表达载体的构建和鉴定 被引量：2

13

作者 董炜疆 胡海涛 +2 位作者 冯改丰 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期413-416,423,共5页

目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对... 目的构建β淀粉样前体蛋白裂解酶(BACE)特异性小干扰RNA真核表达载体。方法用PCR扩增BACE特异性小干扰RNA,转入带有增强型绿荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pUC19质粒,再将重组基因片段导入逆转录病毒真核表达载体pLXSN中,通过限制性酶切对该重组表达载体进行鉴定。结果成功构建了BACE真核表达载体pLXSN/EGFP-U6-siBACE。结论pLXSN/EGFP-U6-siBACE载体的成功构建对进一步利用基因干扰技术治疗阿尔茨海默病的研究奠定了重要的基础。 展开更多

关键词 干扰性小RNA 阿尔茨海默病 β淀粉样蛋白分泌酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

G250抗原肽与HBcAg融合基因原核表达载体的构建及表达蛋白的免疫分析 被引量：1

14

作者 刘波 孙泽强 +4 位作者 刘庆勇 陈杰 王司军 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期6-11,共6页

目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫... 目的构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因的原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,并通过大肠杆菌进行原核表达并纯化,分析表达融合蛋白的免疫原性及抗原性。方法 PCR扩增编码G250抗原中249～268氨基酸的基因片段,将G250肽插入去除主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/C-G250肽-C,为更换酶切位点,以pGEMEX/C-G250肽-C为模板,PCR扩增C-G250肽-C基因片段,最终将目的基因亚克隆入原核表达质粒pET28a(+)中,IPTG诱导融合蛋白表达,利用Ni 2+-NTA亲和层析法纯化重组融合蛋白,SDSPAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化后融合蛋白经腹腔注射免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测小鼠血清中抗体的滴度。结果酶切及基因测序鉴定证实融合基因正确重组于表达质粒pET28a(+)中,原核表达并纯化后,该分离纯化融合蛋白纯度达95%以上,其相对分子质量约为22.35。BALB/c小鼠经4次免疫后,所有小鼠血清中均可检测到抗体,免疫第6周其血清中抗体滴度可达到1∶5.12×105,抗G250肽抗体滴度达到1∶6.4×104,抗HBcAg抗体滴度不超过1∶4×103。结论成功构建肾癌G250抗原肽与HBcAg重组基因原核表达质粒pET28a(+)/C-G250肽-C,在大肠杆菌中可高效表达,纯化后融合蛋白具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体。 展开更多

关键词 融合蛋白 G250 HBCAG 免疫原性 肾癌

在线阅读 下载PDF 职称材料

β淀粉样肽1～42单克隆抗体的制备 被引量：1

15

作者 董炜疆 胡海涛 +2 位作者 冯改丰 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期517-519,共3页

目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小... 目的　制备稳定分泌β -淀粉样肽 1～ 4 2 (Aβ1-42 )单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,产生高效价抗体。方法　通过基因工程技术 ,将Aβ1-42 基因融合于乙肝核心抗原 (HBcAg)的主要免疫优势区 (MIR) ,制备Aβ和HBcAg的融合蛋白 ,免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与SP2 / 0细胞融合 ,筛选能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果　得到两株能稳定分泌Aβ1-42 单克隆抗体的杂交瘤细胞 ,Aβ1-42 单克隆抗体的Ig亚类为IgG3 。结论　制备得到的Aβ1-42 单克隆抗体特异性强 。 展开更多

关键词 Β-淀粉样肽 单克隆抗体 融合蛋白 细胞融合

在线阅读 下载PDF 职称材料

编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA的克隆 被引量：1

16

作者 段小艺 王健生 +4 位作者 郭佑民 刘敏 周斌 王全颖 杨广笑 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期140-142,共3页

目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3... 目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。 展开更多

关键词 表皮生长因子受体Ⅲ型突变体 PEP-3表位 CDNA 基因克隆

在线阅读 下载PDF 职称材料

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定 被引量：1

17

作者 白艳霞 闫利英 +2 位作者 马清涌 杨广笑 王全颖 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第2期180-184,189,共6页

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,... 目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。 展开更多

关键词 nt4-p53(n37)-ha2-tat p53(n37) P73 重组腺伴病毒 恶性肿瘤 基因治疗

在线阅读 下载PDF 职称材料

NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因重组腺相关病毒的构建及鉴定 被引量：1

18

作者 王健生 张明鑫 +5 位作者 刘德纯 段小艺 周苏娜 张广健 杨广笑 王全颖 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期754-756,共3页

目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、... 目的:构建编码融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT的重组腺相关病毒表达载体。方法:利用限制性内切酶切相应载体后将Apoptin和HA2-TAT连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-Apoptin-HA2-TAT亚克隆至腺相关病毒的穿梭质粒内,与辅助质粒pAAV/Ad、腺病毒质粒pFG140共同转染HEK-293细胞,通过同源重组获得NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,收集病毒上清,Dot blot法测定其滴度。MTT比色法观察NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞存活率的影响。结果:经酶切及测序证实克隆出NT4-Apoptin-HA2-TAT融合基因;得到高滴度的(3.14×1015pfu/L)重组腺相关病毒表达载体。NT4-Apoptin-HA2-TAT重组腺相关病毒表达载体,对HepG2细胞有强烈的诱导凋亡作用,与对照组比较,处理组细胞的存活率明显降低。结论:通过分子克隆体外重组技术成功制备了NT4-Ap-optin-HA2-TAT重组腺相关病毒载体,为下一步的Apoptin应用于基因治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 NT4-Apoptin-HA2-TAT 重组腺相关病毒 肿瘤 融合基因

在线阅读 下载PDF 职称材料

NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因重组腺相关病毒载体的构建及鉴定 被引量：1

19

作者 汤小江 平宝华 +2 位作者 潘承恩 杨广笑 王全颖 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1143-1146,共4页

目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin... 目的:设计构建融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒表达载体。方法:应用非对称引物/模板法,PCR技术制备Ant-Shepherdin[79-87]cDNA片段,通过连接pGEM-T-Easy载体及PBV220-NT4质粒,转化感受态细胞,获得NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因,连接腺相关病毒穿梭质粒pSSHG-CMV,采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染HEK-293细胞获取重组腺相关病毒,Dot-blot法测定重组病毒滴度,MTT比色法观察重组腺相关病毒对A549细胞存活率的影响。结果:合成Ant-Shepherdin[79-87]基因,连接PBV220-NT4,经克隆、酶切,琼脂糖凝胶电泳证实获得321bp的NT4-Ant-Shepherdin[79-87]目的基因;得到高滴度的(3.4×1013pfu/L)重组腺相关病毒表达载体;带有融合基因NT4-Ant-Shepherdin[79-87]的重组腺相关病毒对A549细胞具有强烈的诱导凋亡作用。结论:成功构建了NT4-Ant-Shepherdin[79-87]融合基因的重组腺相关病毒表达载体,为进一步研究针对Survivin的靶向抗肿瘤作用奠定了基础。 展开更多

关键词 SURVIVIN ANT NT4 融合基因 重组腺相关病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

GFP重组腺相关病毒报告病毒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达 被引量：1

20

作者 邢俊平 杨宇 +2 位作者 王全颖 杨广笑 邱曙东 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期316-319,共4页

目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此... 目的构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组腺相关病毒载体和报告病毒,并观察其在真核细胞的表达。方法采用DNA重组技术将GFP基因片段亚克隆到pss HGCMV载体的EcoRⅠ和BamHⅠ位点,构建表达GFP重组腺相关病毒载体pss HGCMV-GFP。以此载体转染143细胞进行GFP重组腺相关病毒包装,产生重组报告病毒颗粒并作纯化。用地高辛标记的CMV polyA片段作为探针,采用斑点杂交方法检测重组病毒的物理滴度。采用氯化钙法体外转染培养的NI H3T3细胞,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察其在细胞中的表达。结果成功构建了GFP重组腺相关病毒载体和报告病毒—VssCMV-GFP,所获病毒的滴度为3.16×1012病毒颗粒/mL。重组腺相关病毒VssCMV-GFP感染NI H3T3细胞后48h开始出现绿色荧光,并逐渐增强,至120h荧光更加集中且很强。结论VssCMV-GFP对真核细胞具有感染能力,并且GFP可以在活细胞内有效表达,提示该重组腺相关病毒可应用于介导基因转移真核细胞进行基因治疗。 展开更多

关键词 绿色荧光蛋白 报告基因 表达

在线阅读 下载PDF 职称材料